Az L-Arabinóz fermentáció javítása a Saccharomyces cerevisiae metabolikus útvonalának és transzportjának módosításával

Abstract

A Saccharomyces cerevisiae-ben Lactobacillus plantarum kodon-optimalizált araA, araB és araD génjeinek expressziójával létrehoztuk az L-arabinóz hasznosítási útvonalát. A TAL1, TKL1, RPE1, RKI1 és GAL2 gének túlexpresszálása és adaptív evolúció után a rekombináns törzs L-arabinóz-hasznosítása hatékony lett. Az így létrejött törzs maximális fajlagos növekedési sebessége 0,075 h-1, maximális fajlagos L-arabinóz-fogyasztási sebessége 0,61 g h-1 g-1 száraz sejttömeg, és ígéretes, 0,43 g g-1 etanolhozamot mutatott L-arabinóz fermentációból.

1. Bevezetés

A fosszilis tüzelőanyagoktól való függőség csökkentése érdekében a bioetanol termelését világszerte a 2005-ös ~45 millió literről 2012-re ~113 milliárd literre növelték . Az üzemanyag etanol jövőbeli nagyüzemi előállítása valószínűleg a bőséges lignocellulóz anyagokon fog alapulni a cukor és a gabona helyett, amelyek az emberek és az állatok táplálékául szolgálnak . A lignocellulóz alapanyagokból történő költséghatékony üzemanyag-etanolgyártás a nyersanyagok teljes körű felhasználását igényli. A bioetanol-előállítás egyik célja, hogy az erjesztő mikroorganizmusok képesek legyenek a lignocellulóz-alapanyagokban lévő összes cukrot átalakítani. A lignocellulóz anyagokból körülbelül 3-15% L-arabinóz komponens nyerhető ki. Ezért szükséges egy L-arabinózt fermentáló mikroorganizmus létrehozása e cukor hasznosításának növelése érdekében .

A gombákban és a baktériumokban kétféle L-arabinóz anyagcsere útvonal létezik. Az aldóz-reduktáz (AR), az L-arabitol-4-dehidrogenáz (LAD), az L-xilulóz-reduktáz (LXR) és a D-xilit-dehidrogenáz (XDH) alkotja a gombák L-arabinóz anyagcsereútját. Az AR és az LXR által katalizált reakció a NADPH NADP+ -vá oxidációjával kapcsolódik, és az LAD és az XDH kofaktorként NAD+ -ot használ. A keletkező xilulóz foszforilálódik, és belép a pentóz-foszfát útvonalba (PPP). A bakteriális L-arabinóz anyagcsereút kofaktortól független, és L-arabinóz izomerázból (AraA), L-ribulokinázból (AraB) és L-ribulóz-5-foszfát 4-epimerázból (AraD) áll. A keletkező D-xilulóz-5-foszfát a PPP-be kerül. Mindkét L-arabinóz anyagcsere útvonalat a Saccharomyces cerevisiae-ben hozták létre, amely a hagyományos etanoltermelő mikroorganizmus, amely kiváló cukorerjesztő képességgel és a zord környezettel szembeni toleranciával rendelkezik, de az L-arabinózt nem képes erjeszteni. Nem meglepő, hogy a gombás L-arabinóz metabolikus útvonalat tartalmazó rekombináns S. cerevisiae törzsben redox egyensúlyhiány lép fel. A melléktermék L-arabitol hozama a D-xilóz és L-arabinóz kofermentációban elfogyasztott pentózcukorból 0,48 g g-1 volt, bár a NADH-t expresszáló törzs inkább AR-t és LXR-t használt a redox egyensúlyhiány csökkentése érdekében .

A gombás L-arabinóz metabolikus útvonalhoz képest a bakteriális útvonal egyszerűbb és kofaktortól független. A bakteriális L-arabinóz anyagcsereútban részt vevő enzimek hatékony aktivitásvizsgálatainak hiánya miatt azonban ennek az útvonalnak az optimalizálása S. cerevisiae-ben nem volt egyszerű. Az Escherichia coli araA, araB és araD génjeit expresszáló S. cerevisiae törzs nem tudta hasznosítani az L-arabinózt. Miután azonban az E. coli L-arabinóz izomeráz génjét Bacillus subtilisből klónozott araA génre cserélték, a törzs több körös adaptív növekedés után képes volt növekedni és etanolt termelni L-arabinózon . Továbbá az L-arabinóz hasznosítását tovább javították a bakteriális araA, araB és araD gének kodonhasználatának az élesztő által preferált kodonokra történő megváltoztatásával . A Lactobacillus plantarum L-arabinóz metabolikus génjei jobban megfeleltek a S. cerevisiae kodonhasználatának, mint a korábban közölt gének. Wisselink és munkatársai az L. plantarum araA és araD több példányát és az araB egyetlen példányát vitték be az S. cerevisiae-be. A nem oxidatív PPP enzimeket kódoló gének túlterjedése és kiterjedt adaptív evolúció után a kapott törzs magas, akár 0,43 g g-1 etanolhozamot mutatott L-arabinózon történő anaerob növekedés során, nagy arabinózfogyasztási sebességgel (0,70 g h-1 g-1 száraz sejttömeg (DCW)) . Egy fejlettebb törzs metabolizmusának, transzkriptomjának és metabolikus fluxusának elemzése kimutatta, hogy a galaktóz transzporter, transzketoláz és transzaldoláz izoenzimek magasabb expressziós szintje előnyös a S. cerevisiae L-arabinózon történő növekedéséhez .

A jelen munkában a L. plantarum egyedi kodon-optimalizált araA, araB és araD génjeit a S. cerevisiae törzsben CEN.PK102-3A különböző szinteken expresszáltuk. Ezután a PPP-ben részt vevő TAL1, TKL1, RPE1 és RKI1 géneket túlexprimáltuk ebben a rekombináns törzsben. Az így kapott törzset szekvenciálisan szelektáltuk L-arabinózon aerob körülmények között és oxigénkorlátozott körülmények között. Olyan törzset kaptunk, amelynek L-arabinóz-hasznosító képessége jelentősen megnövekedett. A kifejlesztett törzsek és a GAL2 transzportergént is túlreprezentáló törzs L-arabinóz metabolikus kapacitását vizsgáltuk. Az L-arabinóz-anyagcsere hatékonyságát befolyásoló tényezőket tárgyaljuk.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Az L-arabinóz-anyagcsere hatékonyságát befolyásoló tényezők. Közegek és tenyésztési körülmények

Az élesztők tenyésztéséhez 1,7 g L-1 élesztő nitrogénbázist (YNB, Sangon, Kína) és 5 g L-1 ammónium-szulfátot (Sangon, Kína) tartalmazó élesztő szintetikus teljes közeget (SC) használtunk, további szénforrásként glükózt (Sangon, Kína) vagy L-arabinózt (Sinopharm, Kína). A teljes kiegészítő keveréket, 0,77 g L-1 CSM-URA vagy 0,67 g L-1 CSM-LEU-URA (MP Biomedicals, Solon, OH), a szükséges plazmidok fenntartásához adtuk, szükség esetén auxotróf szelekcióval. A KanMX4 markerrel rendelkező törzsek esetében a táptalajhoz 200 g mL-1 G418-szulfát antibiotikumot (Promega, Madison, WI, USA) adtunk. Minden élesztőt 30°C-on tenyésztettünk.

2.2. A kodonadaptációs index elemzése

A kodonadaptációs indexet (CAI) arra használják, hogy bemutassák a kodonhasználat preferenciáját az egyes fajokban . A CAI elemzéshez a CODONW (http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/MobylePortal/portal.py?form=codonw) programot használtuk.

2.3. Plazmid- és törzsépítés

E. coli DH5-t használtunk a szubklónozáshoz. Az ebben a vizsgálatban használt S. cerevisiae törzseket és plazmidokat az 1. táblázat tartalmazza. Az ebben a vizsgálatban használt primereket a 2. táblázat tartalmazza.

Az L-arabinóz izomerázt (GenBank: CCC80517.1), az L-ribulokinázt (GenBank: CCC80519.1) és az L-ribulóz-5-foszfát 4-epimerázt (GenBank: CCC80518.1) kódoló, egyedi kodon-optimalizált araA, araB és araD gének az L. Plantarum mesterségesen szintetizáltuk és ligáltuk a pHX plazmid HXT7 promóter és PGK1 terminátor szekvenciái közé, amelyet a YEp24-PGKp plazmid PGK1p-jének HXT7p-vel való helyettesítésével állítottunk elő, és amely a Kpn I és Sma I restrikciós enzimek helyeit tartalmazza. A HXT7p-araD-PGK1t fragmentumot PCR-rel amplifikáltuk a Hind III és Bln I restrikciós enzimek terminális helyeivel, majd beillesztettük az YIp5 Hind III és Nhe I helyeibe, így kaptuk az YIp5-araD plazmidot. A terminális Bgl II és Sal I helyeket tartalmazó HXT7p-araA-PGK1t fragmentumot beillesztettük az YIp5-araD BamH I és Sal I helyére, így kaptuk az YIp5-araAD plazmidot. Az Eag I és Stu I helyeket tartalmazó HXT7p-araB-PGK1t fragmentumot a YIp5-araAD Eag I és Stu I helyére illesztettük be, így kaptuk a YIp5-ara plazmidot (1. ábra (a)). A TEF1 promóter fragmentumot (Hind III és Sal I terminális helyekkel) és a PGK1 terminátor fragmentumot (BamH I és Hind III terminális helyekkel) a pJFE3 és pYMIKP plazmidokból klónoztuk. Ezt a két fragmentumot ligáltuk és beillesztettük a pYX242 plazmidba, hogy létrehozzunk egy vektort, a pYX242-WS-t, amely két, gének expressziójára alkalmas hellyel rendelkezik. Ezután az araA gént beillesztettük e vektor Sal I és Sac I helyei közé a TEF1 promóter és a PloyA terminátor kontrollja alatt a kifejeződéséhez, és az így kapott plazmidot pYX2422-TEF1araA-nak neveztük el (1. ábra (b)). A pYX2422-HXT7araA plazmidot (1. b) ábra) a HXT7p fragmentumának felhasználásával konstruáltuk a pYX2422-TEF1araA plazmid TEF1p fragmentumának kiszorítására; az illesztések BamH I és Sal I felismerő szekvenciák voltak. A GAL2 gént a CEN.PK102-3A kromoszómális DNS-éből klónoztuk, majd beillesztettük a pJFE3 plazmid Xba I és Sal I helyére, így kaptuk a pJFE3-GAL2 plazmidot. A pJFE3-GAL2 plazmid Nde I és Apa I helyek közötti URA3 fragmentumát a pUG6-ból klónozott KanMX4 génnel helyettesítettük, így kaptuk a pJFE318-GAL2 plazmidot (1. ábra c)).

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

1. ábra

A plazmidok fizikai térképei (a) YIp5-ara, (b) pYX2422-TEF1araA/HXT7araA és (c) pJFE318-GAL2.

Az élesztő transzformációját a lítium-acetát transzformációs módszerrel végeztük . Az YIp5-ara plazmidot a Stu I helyen linearizáltuk, majd transzformáltuk a CEN.PK102-3A-ba. A kromoszómális URA3 génbe integrált araA, araB és araD génekkel rendelkező transzformánsokat CSM-URA-t tartalmazó SC táptalajon szelektáltuk, és miután szekvenálással megerősítettük, a kívánt transzformánst BSW1A1-nek neveztük el. A BSW1A1-be a pYX242, pYX2422-HXT7araA és pYX2422-TEF1araA plazmidokat transzformáltuk, így a BSW1AY, a BSW1A7, illetve a BSW1AT lett. A linearizált pJPPP3-at, amely a TAL1, TKL1, RPE1 és RKI1 gének expressziós kereteit tartalmazza, integráltuk a BSW1AT kromoszómájába a GRE3 gén lokuszán, így kaptuk a BSW2AP törzset. A BSW2AP törzset 20 g L-1 L-arabinózon adaptáltuk aerob körülmények között, majd oxigénlimitált körülmények között. A stacionárius fázis elérése után egy új tételt indítottunk el a kultúra friss táptalajba való átültetésével, 0,15 g DCW L-1 kezdeti biomassza mellett. Amikor a törzs duplázódási ideje stabilizálódott, az adaptált mutánsok közül a BSW3AP mutánst választottuk ki az L-arabinózon való kiváló növekedése alapján. Ezután a pJFE318-GAL2 plazmidot transzformáltuk a BSW3AP törzsbe, így kaptuk a BSW3AG.

2.4 törzset. Valós idejű kvantitatív PCR

A sejteket 20 g L-1 glükózt tartalmazó SC táptalajon tenyésztettük, és összegyűjtöttük, amikor a tenyészetek OD600 értéke elérte az 1-et. A teljes RNS-t TRIzol reagenssel (Sangon, Kína) extraháltuk. A cDNS első szálát 1 g teljes RNS-ből reverz transzkripcióval írtuk át PrimeScript RT reagens készletekkel és gDNA Eraserrel (Takara, Japán). A hígított cDNS-termékeket a SYBR Green Real-time PCR Master Mix (TOYOBO, Japán) és a LightCycle PCR System (Roche Molecular Biochemicals, Németország) segítségével valós idejű kvantitatív PCR-hez használtuk. A normalizáláshoz az ACT1 aktint kódoló gént használtuk referencia génként. A valós idejű PCR adatait a módszer szerint számoltuk ki. Az ezekhez a PCR-hez használt primereket a 2. táblázatban soroltuk fel.

2.5. Fermentáció

Egyetlen kolóniát tenyésztettünk egy éjszakán át 20 g L-1 glükózt tartalmazó SC táptalajon. Az éjszakai tenyészet egy mintáját 10 g L-1 glükózt és 10 g L-1 L-arabinózt tartalmazó SC táptalajban 0,5 kezdeti OD600-ra hígítottuk. 10 órás tenyésztés után a sejteket összegyűjtöttük és fermentációra használtuk. Minden rázólombikban végzett fermentációt 30°C-on, 200 r percenként 200 ml rázólombikban végeztünk, 40 ml tápfolyadékot tartalmazó 200 ml-es rázólombikban. Az oxigénkorlátozott állapotot gumidugóval tartottuk fenn. Az anaerob körülmények között végzett szakaszos fermentációkat 1,4 literes fermentorokban (Infors AG, Svájc) végeztük, 900 ml hasznos térfogattal. Az anaerob körülményeket nitrogénnel való befecskendezéssel (0,1 L min-1) tartottuk fenn; a keverési sebesség 500 fordulat/perc volt. A pH-t 5,0-on tartottuk 1 mol L-1 NaOH és 1 mol L-1 H3PO4 automatikus pumpálásával. A kezdeti biomassza 0,2 g DCW L-1 volt. Az SC plusz CSM-LEU-URA közegben a szénforrás 20 g L-1 L-arabinóz volt; a BSW3AG törzs fermentációjához 200 g mL-1 G418-t adtunk. A kifejlődött törzsek és a nem kifejlődött törzsek száraz sejttömegét a száraz tömeg (mg mL-1) = 0,266 × OD600 – 0,0762 és a száraz tömeg (mg mL-1) = 0,2365 × OD600 + 0,1149 képlet szerint számoltuk ki.

2.6. Az erjedési termékek elemzése

A nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát (HPLC) Prominence LC-20A (Shimadzu, Japán) RID-10A törésmutató detektorral (Shimadzu, Japán) felszerelve használtuk a cukrok és metabolitok koncentrációjának meghatározására. Az Aminex HPX-87P ioncserélő oszlopot (Bio-Rad, USA) használtuk az L-arabinóz, az arabit és az etanol elemzéséhez 80°C-on, vízből álló mobil fázissal, 0,6 ml min-1 áramlási sebességgel. Az Aminex HPX-87H ioncserélő oszlopot (Bio-Rad, Hercules, USA) használtuk glicerin és acetát elemzésére 45°C-on, 5 mmol L-1 H2SO4-et használva mobilfázisként .

3. Eredmények

3.1. Eredmények

3. Az L-arabinóz útvonalban részt vevő kodon-optimalizált gének expressziója S. cerevisiae-ben

Az L-arabinóz izomeráz (GenBank hozzáférési szám: CCC80517.1), az L-ribulokináz (GenBank hozzáférési szám: CCC80519.1) és az L-ribulóz-5-foszfát-4-epimeráz (GenBank accession no. CCC80518.1) a National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) adatbázisában rögzített, az L. plantarum araA, araB és araD génjeit mesterségesen szintetizáltuk S. cerevisiae preferált kódok felhasználásával. A kodonoptimalizált araA, araB és araD CAI értékei 0,599, 0,580 és 0,646 voltak, amelyek magasabbak voltak, mint a natív szekvenciáké (0,324, 0,223 és 0,243).

A kodon-optimalizált araA, araB és araD expressziós kazettáit integráltuk a CEN.PK102-3A törzs kromoszómájába, így jött létre a BSW1A1 törzs. A BSW1A1 azonban nem tudott L-arabinózon növekedni, bár ezeknek a géneknek az átírt mRNS-e mind kimutatható volt. Ezután az araA több példányát vittük be a BSW1A1-be, amelyet a pYX242 epizomális plazmid hordozott, és a HXT7 és TEF1 promóterek ellenőrzése alatt fejeződött ki. Az így kapott BSW1A7 és BSW1AT törzsekben az araA transzkripciós szintje -szoros és -szoros volt magasabb, mint a csak az integrált, expresszált araA-t hordozó BSW1AY referencia törzsben. A BSW1A7 és BSW1AT törzseket aerob módon inkubáltuk L-arabinózon, és a BSW1AT törzs növekedése ~150 óra elteltével volt megfigyelhető, míg a BSW1A7 még hosszabb tenyésztés esetén sem tudott növekedni.

3.2. Az L-Arabinóz hasznosításának javítása S. cerevisiae-ben mérnöki és evolúciós módszerekkel

A nemoxidatív pentóz-foszfát útvonalban részt vevő TAL1, TKL1, RPE1 és RKI1 géneket a BSW1AT 150 órás tenyészetből izolált egyetlen kolóniában a linearizált pJPPP3 plazmid kromoszómába történő integrálásával túlexpresszáltuk. Az így kapott BSW2AP törzs L-arabinózon fejlődött. Aerob körülmények között 9, oxigénkorlátozott körülmények között pedig 12 átvitel után a tenyészet megduplázódási ideje 22 óráról 4,5 órára csökkent. A mutánsokat L-arabinóz lemezeken szűrtük, és egy nagy kolóniát választottunk ki, amelyet BSW3AP-nak neveztünk el.

A BSW1AT, BSW2AP és BSW3AP rekombináns törzsekben a gének transzkripciós szintjét valós idejű kvantitatív PCR segítségével határoztuk meg (2. ábra). Az araA expressziós szintje a BSW2AP-ban 2-szer magasabb volt, mint a BSW1AT-ban, míg az araB és az araD expressziós szintje a BSW2AP-ban alacsonyabb volt. Ezek a változások a BSW1AT L-arabinózon történő termesztése során bekövetkezett mutációknak tudhatók be. A továbbfejlesztett BSW3AP törzsben mindhárom gén magas szinten kifejeződött. Az araA, araB és araD expressziós szintje a BSW3AP törzsben 4,1-szer, 1,6-szor és 2,5-szer magasabb volt, mint a BSW1AT törzsben.

2. ábra

A BSW2AP és BSW3AP törzsek araA (fekete sávok), araB (szürke sávok) és araD (üres sávok) expressziója a BSW1AT törzshez képest. E gének mRNS-szintjének hajtásváltozásait az ACT1 expressziójához normalizáltuk. A vizsgált törzseket 20 g L-1 glükózon tenyésztettük. A megadott értékek három független mérésből származnak.

A BSW1AT, BSW2AP és BSW3AP törzsek L-arabinóz-hasznosítását oxigénlimitált körülmények között rázó-lombikban hasonlítottuk össze (3. ábra); a kezdeti OD600 0,5 volt. A BSW1AT 120 óra alatt nem növekedett. A BSW2AP törzs az L-arabinózon 0,011 h-1 maximális fajlagos növekedési sebességgel () növekedett; 4,4 g L-1 L-arabinózt fogyasztott, és 1,2 g L-1 etanolt termelt 120 óra fermentáció alatt. Ezzel szemben a kifejlődött BSW3AP törzsé 0,23 h-1-re nőtt. A 120 órás fermentáció után 18,6 g L-1 L-arabinóz fogyott el, a maximális fajlagos fogyasztási sebesség 0,7 g h-1 g-1 DCW volt; 6,9 g L-1 etanol keletkezett, és az etanolhozam 0,43 g g-1 volt; csak 0,13 g L-1 L-arabitol halmozódott fel.

(a)

(b)

(c)

(d)

.

(a)
(b)
(c)
(d)

3. ábra

Az L-törzsek arabinóz fermentációja rázólombikban. A BSW1AT (▲), BSW2AP (■) és BSW3AP () növekedési kapacitása (a), L-arabinóz fogyasztása (b), arabitol képződése (c) és etanol képződése (d). A törzseket 20 g L-1 L-arabinózt tartalmazó 40 ml SC táptalajban tenyésztettük 30 °C-on, 200 r percenként, 0,5 kezdeti OD600 mellett. Az adatok három független kísérlet átlagai.

3.3. A GAL2 overexpressziója javította a fejlesztett törzs L-arabinóz anaerob fermentációját

A GAL2 galaktózpermeáz gént overexpresszáltuk a BSW3AP-ban, így jött létre a BSW3AG törzs. A BSW3AP és BSW3AG törzs anaerob L-arabinóz fermentációs tulajdonságait vizsgáltuk (4. ábra és 3. táblázat) bioreaktorokban. A BSW3AP törzs L-arabinózon 0,067 h-1 maximális fajlagos növekedési sebességgel növekedett. Az L-arabinóz maximális fajlagos fogyasztási sebessége 0,49 g h-1 g-1 DCW volt. Az etanol előállításának maximális fajlagos sebessége 0,20 g h-1 g-1 DCW volt, a hozam 0,42 g g-1 volt. A GAL2 túlexpressziója jelentősen javította az L-arabinóz fermentációs kapacitást. A BSW3AG maximális fajlagos növekedési sebessége 0,075 h-1 volt, ami 12%-kal gyorsabb, mint a BSW3AP-é. A BSW3AG L-arabinóz specifikus fogyasztási sebessége 0,61 g h-1 g-1 DCW volt, ami 24%-kal gyorsabb volt, mint a BSW3AP-é. Az etanoltermelés sebessége 0,27 g h-1 g-1 DCW, az etanolhozam pedig 0,43 g g-1 volt. Továbbá mind a BSW3AP, mind a BSW3AG kis mennyiségű glicerint (1,4 g L-1 mindkét törzs esetében) és szinte kimutathatatlan mennyiségű arabitot és acetátot termelt.

Törzs μ max (h-1) A maximális fajlagos L-arabinóz-fogyasztási sebesség (g h-1 g-1 DCW) Ethanol termelési sebesség (g h-1 g-1 DCW) Ethanol hozam (g g-1 L-arabinóz fogyasztás) BSW3AP 0.067 0.49 0.20 0.42 BSW3AG 0.075 0.61 0.27 0.43

3. táblázat

A maximális fajlagos növekedési sebesség (), a maximális fajlagos L-arabinóz-fogyasztás, az etanoltermelés és az etanolhozam a BSW3AP és BSW3AG esetében 20 g L-1 L-arabinózon.

(a)

(b)

(a)
(b)

4. ábra

A BSW3AP (a) és a BSW3AG (b) anaerob szakaszos fermentációja 20 g L-1 arabinózon. A (■), arabinóz (◆), etanol (▲), glicerin () és acetát (×) szintjei. A fermentációt 1,4 literes fermentorokban végeztük, 900 ml munkatérfogattal. Az anaerob körülményeket nitrogén befecskendezésével (0,1 L min-1) tartottuk fenn; a keverési sebesség 500 r min-1 volt. A pH-t 5,0-on tartottuk 1 mol L-1 NaOH és 1 mol L-1 H3PO4 automatikus pumpálásával. A kezdeti biomassza 0,2 g DCW L-1 volt. A 20 g L-1 L-arabinózt használtuk szénforrásként az SC plusz CSM-LEU-URA közegben, a BSW3AG törzs fermentációjához pedig 200 g mL-1 G418-at adtunk. Az adatok duplikált meghatározások átlagát jelentik.

4. Megbeszélés

A cukrok teljes átalakítása fontos a lignocellulóz anyagokból történő hatékony és költséghatékony üzemanyag-etanol előállításához. Már a szubsztráthasznosítás kis mértékű javítása is jelentősen csökkentheti az egész folyamat költségeit . Az L-arabinóz a lignocellulóz anyagok fontos összetevője. A L. plantarum L-arabinóz útvonalának expressziója hatékonynak bizonyult az L-arabinózt hasznosító S. cerevisiae felépítésében . Tekintettel arra, hogy a kodon-optimalizált gének a fehérjék fokozott expressziójához vezethetnek , a jelen munkában a L. plantarum eredeti araA, araB és araD génjeit úgy módosítottuk, hogy megfeleljenek az S. cerevisiae kodonhasználatának, majd integráltuk a CEN.PK102-3A törzs kromoszómájába. Ez a rekombináns törzs azonban nem tudott L-arabinózon növekedni. Ezután az araA gén további példányait vittük be a rekombináns törzsbe a HXT7 és TEF1 promóterek irányítása alatt. Amikor a két így kapott törzset L-arabinózon tenyésztették, csak a TEF1 promóter kontrollja alatt az araA-t expresszáló törzs tenyészetében volt megfigyelhető növekedés, amelyben az araA transzkripciós szintje 1,4-szer magasabb volt, mint a HXT7 promóter által kontrollált araA-t expresszáló törzsben. Arra utalunk, hogy csak akkor következhet be növekedés L-arabinózon, ha az araA transzkripciós szintje egy bizonyos szintnél magasabb. Ezzel szemben az araB-nek és az araD-nek csak egy-egy példányát vittük be ebbe a rekombináns törzsbe, és ezeknek a géneknek a transzkripciós szintje alacsonyabb volt, mint a szülői törzsben. Ezek a jelenségek arra utaltak, hogy az araB és az araD kevésbé fontos az L-arabinózon való növekedés szempontjából, mivel e géneknek csak egy példánya tette lehetővé, hogy a rekombináns törzs L-arabinózon növekedjen.

Az adaptív evolúció a törzsek metabolikus hatékonyságának növelésére hatékony módszernek bizonyult . A jelen vizsgálatban az evolvált BSW3AP törzs jelentősen javított L-arabinóz metabolizáló képességet mutat. Mindhárom gén (araA, araB és araD) megnövekedett transzkripciós szintje hozzájárulhat a javuláshoz. Az araA és az araD génhez képest az araB expressziós szintje alacsonyabb volt. Becker és Boles arról számolt be, hogy az L-arabinózon mutáns csökkentette az araB által kifejezett L-ribulokináz aktivitást. Az araB viszonylag alacsonyabb expressziójával elkerülhető az ATP túlfogyasztása, ami előnyös lenne a törzs L-arabinózon történő növekedése szempontjából.

Az L-arabinóz új szénforrás az S. cerevisiae számára. Az L-arabinóz felvétele az S. cerevisiae-ben elsősorban a Gal2p hexóztranszporter nem specifikus transzportjától függ. A Hxt9p és Hxt10p is képes az L-arabinóz szállítására, de a hatékonyság nagyon alacsony . Arról számoltak be, hogy a GAL2 túlterjedése javítja az L-arabinóz hasznosítását . Ebben a vizsgálatban a GAL2 túlexpressziója jelentősen megnövelte a BSW3AP törzsünk növekedési sebességét és L-arabinóz felhasználási sebességét. Ez az eredmény azt sugallta, hogy az elméleti L-arabinóz metabolikus fluxus magasabb, mint amit a BSW3AP-ban kimutattunk. A BSW3AP L-arabinóz-hasznosítását a felszívódási sebesség korlátozta. Amikor a GAL2-t túlexpresszáltuk, a plazmamembránban lévő több Gal2p megnövekedett L-arabinózfelvételhez vezetett, majd elősegítette az L-arabinóz hasznosítását. Eredményeink tovább erősítették a transzporterek fontosságát az L-arabinóz hasznosításában; azonban a Gal2p affinitása az L-arabinózhoz alacsony, és a glükóz kompetitíven gátolta az L-arabinózhoz való kötődését . Az L-arabinóz specifikus transzporter hatékonyságának javítása még hátravan.

5. Következtetések

A géntechnológia és az adaptív evolúció több lépésével megkaptuk a BSW3AG törzset, amely L-arabinózon 0,075 h-1 sebességgel növekszik. A maximális fajlagos L-arabinóz-fogyasztási sebesség 0,27 g h-1 g-1 DCW, a maximális etanolhozam pedig 0,43 g g-1 elfogyasztott L-arabinóz, ami az elméleti mennyiség 84,3%-át teszi ki. Az araA magas szintű expressziója különösen fontos a hatékony L-arabinóz útvonal kialakításában a S. cerevisiae-ben, és hatékonyabb transzporterek szükségesek a kifejlesztett törzsek L-arabinóz-felvevő kapacitásának javításához.

Érdekütközések összeférhetetlensége

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek összeférhetetlenségeik.

Megköszönések

Ezt a munkát a Nemzeti Kulcsfontosságú Alapkutatási Program (2011CB707405), a Kínai Nemzeti Magas Technológiai Kutatási és Fejlesztési Program Grant (2012AA022106), a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (30970091, 31070096 és 31270151), valamint a Kínai Nemzetközi S&T Együttműködési Program (2010DFA32560) támogatta. A szerzők köszönetet mondanak Dr. Peter Kötternek a frankfurti Johann Wolfgang Goethe Egyetemről a CEN.PK102-3A.

törzsért.