BétaGalactosidase Assay (A better Miller)

vissza a protokollokhoz

Háttér

β-A galaktozidázt a lac operon lacZ génje kódolja az E. coli. Ez egy nagy (120 kDa, 1024 aminosav) fehérje, amely tetramert alkot. Az enzim feladata a sejtben a laktóz glükózzá és galaktózzá hasítása, hogy azok szén/energiaforrásként felhasználhatók legyenek. A szintetikus o-nitrofenil-β-D-galaktozid (ONPG) vegyületet is felismeri szubsztrátként, és a galaktóz és a sárga színű o-nitrofenol keletkezése érdekében hasítja. Ha egy reakcióban az ONPG többletben van az enzimhez képest, az o-nitrofenol egységnyi idő alatt történő termelődése arányos a β-galaktozidáz koncentrációjával; így a sárga szín termelődése felhasználható az enzimkoncentráció meghatározására.

Miért érdekel minket? Általában a kísérleteket úgy tervezik meg, hogy a β-Galaktozidáz koncentrációja a sejtben a vizsgált rendszer valamely aspektusának kijelzője legyen. Például egy kutató egy promótert fuzionálhat a lacZ génhez, és a β-Gal szintjét használhatja a promóter aktivitásának leolvasására különböző körülmények között. 1972-ben Jeffrey Miller kiadta az “Experiments in Molecular Genetics” című könyvet, amely tartalmazott egy protokollt a β-Gal mennyiségének ONPG-vel történő meghatározására. Emiatt az ONPG/β-Gal próbákat “Miller” próbáknak nevezik, és a β-Gal aktivitás standardizált mennyisége egy “Miller egység”.

1 Miller egység = \displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420}) – (1.75*Abs_{550}))}{(t * v * Abs_{600})}{(t * v * Abs_{600})} }

ahol:

• Abs420 a sárga o-nitrofenol abszorbanciája,
• Abs550 a sejttörmelékből származó szórás, amit ha megszorozunk 1-gyel.75 megközelíti a 420 nm-nél megfigyelt szórást,
• t = reakcióidő percben,
• v = a vizsgált tenyészet térfogata milliliterben,
• Abs600† a sejtsűrűséget tükrözi.

†Megjegyezzük, hogy ez az érték minden egyes használt spektrofotométer esetében más és más, és ismert Abs600 kultúrák hígításával kell kalibrálni az Abs600-onkénti kolóniaképző egységek meghatározásához.

A könyvében dr. Miller elmagyarázza, hogy ez a képlet körülbelül 1 Miller-egységet ad az indukálatlan E. coli (alacsony β-Gal-termelés) és körülbelül 1000 egységet a teljesen indukált (laktózon vagy IPTG-n nevelt) kultúra esetében.

Tapasztalataim szerint az 1 mM IPTG-vel indukált MG1655 kultúrák log-fázisban 1500-1800 Miller-egységet mutatnak. A különbség oka nem ismert, de gyanítom, hogy a Dr. Miller spektrofotométere és az általam használt Abs600/sejtsűrűség közötti különbségekből ered, valamint abból, hogy én a Miller-méréseimet 30 °C-on végzem (az egyszerűség kedvéért), míg Dr. Miller 28 °C-on végezte a vizsgálatait. Olyan promóterfúziókat készítettem, amelyek ~40 000 Miller-egységet generálnak; azonban, amint azt alább tárgyaljuk, ez túl magas a vizsgálathoz, ezért a protokollt úgy módosítottam, hogy alacsonyabb legyen ez az érték.

Protokoll

Az általam használt protokoll Zhang és Bremer cikkéből származik (JBC 270, 1995, Free full text!), amelyben az eredeti Miller-protokollt jelentősen leegyszerűsítették, hogy több mintát lehessen mérni kevesebb manipulációval.

Röviden, a protokoll abból áll, hogy megmérjük egy baktériumtenyészet sejtsűrűségét (Abs600), majd a sejtek egy aliquotáját kivesszük a küvettából, és “permeabilizáló” oldattal keverjük össze, amely detergens tartalmú, ami megbontja a sejtmembránokat (de a β-Gal-t érintetlenül hagyja). Ez megöli a sejteket és leállítja a transzlációt. Az inkubálás után ONPG “szubsztrát” oldatot adunk hozzá, és hagyjuk, hogy a sárga szín kialakuljon. Ezután “stop” oldatot adunk hozzá, és megmérjük az o-nitrofenol abszorbanciáját.

1. Növeljük a kultúrákat bármilyen körülmények között, amit vizsgálni szeretnénk.
2. A növekedés során előzetesen mérjünk 80 μL aliquotát a permeabilizációs oldatból 1 db.5 ml-es mikrofúziós csövekbe, és zárja le őket.
3. Mérje meg az Abs600-t, és rögzítse!
4. Vegyen ki egy 20 μL-es aliquotát a tenyészetből, és adja hozzá a 80 μL permeabilizációs oldathoz.

A minta most már több órán át stabil. Ez lehetővé teszi az idősoros kísérletek elvégzését.

1. Az utolsó minta levétele után helyezze át a mintákat és a szubsztrátoldatot 20-30 percre a 30 °C-os meleg helyiségbe.
2. Adjon 600 μL szubsztrátoldatot minden csőbe, és JEGYZZE MEG A KIEGÉSZÍTÉS IDEJÉT.
3. Amikor elegendő szín alakult ki, adjon hozzá 700 μL Stop oldatot, keverje jól össze, és JEGYZZE MEG A STOP IDEJÉT.
4. Az utolsó minta leállítása után (egyesek hosszabb ideig tarthatnak, mint mások, de általában 30-90 perc alatt elkészülnek), helyezze át a csöveket egy mikrofugába, és 5-10 percig teljes fordulatszámon forgassa őket.
5. Óvatosan vegye ki a csöveket a centrifugából, és a csövek tetejéről töltse át az oldatot a küvettá(k)ba. Igyekszik elkerülni, hogy részecskés anyag kerüljön a küvettába, hogy a szórás ne befolyásolja a leolvasást.
6. Rögzítse az Abs420 értéket. Ennek kisebbnek kell lennie, mint 1 és nagyobbnak, mint 0,05. Ha egy kicsit kívül esik ezen a tartományon, ne aggódjon.

A Miller-egységek kiszámítása:

\displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420})}{((Abs_{600} \text{ a kultúrából vett minta})*(\text{térfogat } )*(\text{reakcióidő}))}(\text{reakcióidő}))} }

Kommentárok a vizsgálathoz

• Reshma 2007. október 15. 11:28, 2007. október 15. (CDT): Miller az OD600 = 0,28 és 0,70 közötti OD600 közötti kultúrát ajánlja. Azonban azt állítja, hogy éjszakai kultúrák is használhatók, de az exponenciálisan növekvő sejtek pontosabb vizsgálatokat adnak .

• Mikor történik a reakció? Erre nem találtam jó választ a szakirodalomban. Ha hagytam egy reakciót befejeződni, akkor ~2-3-as Abs420 értéket mértem. Ez persze kívül esik a spektrofotométer megbízható tartományán, de ad egy támpontot, hogy meddig mehet a reakció. Reprodukálható adatokat kaptam, amikor a sárga szín éppen csak kimutatható volt a stop oldat hozzáadása előtt, egészen kb. az LB húsleves színéig, mielőtt leállt volna. Ne feledje, hogy a reakció során a szubsztrátnak telítenie kell az enzimet, ezért ne hagyja, hogy túl messzire menjenek. Én rutinszerűen három külön mérést végzek minden kultúránál, és átlagolom őket.
  • Reshma 2007. október 15. 11:28, 15. (CDT): Miller azt ajánlja, hogy az OD420nm-es mérés ideális esetben 0,6-0,9 legyen .

• Gyakran használnak eldobható műanyag küvettákat mind a tenyészet zavarosságának, mind a sárga o-nitropenolnak a mérésére. Az a tapasztalatom, hogy az eldobható küvetták optikája TÖRVÉNYES: igen, átlátszóak, de a fény útja szánalmasan torz (nézzünk csak át egy távoli tárgyra). Ez nem nagy probléma, ha ugyanazt a küvettát használjuk a vak és a mintához, és ugyanúgy tájoljuk a spektrofotométerben. A probléma akkor merül fel, ha sok különböző mintát mérünk különböző küvettákban. Az értékek még a különböző küvettákban mért azonos kultúra esetében is NAGYON eltérőek lehetnek. Javaslom, hogy vagy jó minőségű üveg- vagy kvarcküvettát használjon, vagy mérje a mintákat lapos aljú 96 lyukú lemezolvasóban. Úgy tapasztaltam, hogy az Abs600 méréseknél a 150 μL kultúra pipettázása során elkövetett hibám sokkal kisebb volt, mint az eldobható küvetták használata. Természetesen a mért zavarosságot sejt/mL-re kell kalibrálni, mint egy 1 cm-es küvettánál.

• A minták megpörgetésével és a felülúszóból való óvatos eltávolításával elkerülhető, hogy 550 nm-en kelljen mérni a szórást és kitalálni, hogy mi lenne 420 nm-en.

• Ha a reakcióban túl sok β-Gal van, a cső néhány perc (vagy akár másodperc) alatt besárgul. Ez túl gyors. A hiba egyik legnagyobb hozzájárulása a reakcióidő becslése lesz. Ha a reakció körülményeit úgy állítod be, hogy a reakció körülbelül egy órát vegyen igénybe, az időbeli hibák jelentéktelenné válnak. Ha lassítani kell a reakciót, kevesebb sejtet használhat, és növelheti a permeabilizációs puffer mennyiségét, hogy a térfogat még mindig 100 μL legyen. Alternatív megoldásként a β-Gal-konstrukció riboszóma-kötőhelyét átkonstruálhatja, hogy gyengítse azt. Azt tapasztaltam, hogy ha a sejtjeim 40 000 Miller-egység β-Gal-t gyártottak, akkor nagyon megbetegedtek a transzlációs stressztől. Ebben az esetben jobb volt gyengíteni a β-Gal mRNS transzlációját.
  • Az ilyen reakciókat úgy csinálom, mint az enzimkinetikát. A mintákat 10 másodpercenként indítom el (az idő visszaszámlálásával), így pontos reakcióidőt lehet kapni akkor is, ha csak pár percig hagyod a reakciókat. Nagyon reprodukálható eredményeket kapok 1,5-30 perces reakcióidőkkel. Ha már megérezte, hogy mennyi időre van szüksége a reakciókhoz, könnyen csoportosíthatja azokat a mintákat, amelyeknek ugyanannyi reakcióidőre van szükségük. Ha minden mintát három példányban csinálsz, akkor biztos lehetsz benne, hogy az időzítés reprodukálható.–Kathleen 16:43, 2005. december 14. (EST)

• Itt egy példa néhány tényleges adatra, amit ezzel a vizsgálattal kaptam. Ez egy timecourse kísérlet volt. Minden egyes időpontban 1 ml-t vettem mindegyik tenyészetemből, megmértem az OD600-at, három 20 µl-es aliquotát vettem közvetlenül a küvettából, és mindegyikhez 80 µl permeabilizációs oldatot adtam. A vizsgálatot pontosan a fent leírtak szerint végeztem el, és az összes mintát szobahőmérsékleten tartottam az idősor befejezéséig. Ezeknek a kultúráknak az OD600 értéke 0,4 és 4 között változott (az én mintámban) a kísérlet során, és a β-Gal próbák reakcióideje 2-25 perc között változott. A három egyedi β-Gal próbát minden egyes időpontra minden egyes kultúra esetében (piros vagy fekete szimbólumok) ábrázoljuk a grafikonon, hogy szemléltessük a próba reprodukálhatóságát az egyes kísérleteken belül.–Kathleen

Receptek

Permeabilizáló oldat

Mintánként 80 μL-re van szüksége.

• 100 mM dibázikus nátrium-foszfát (Na2HPO4)
  • (A Zhang protokoll 200 mM nátrium-foszfátot tartalmaz. Ezt soha nem tudtam a többi komponenssel együtt oldatba hozni, bármit is próbáltam, ezért visszavettem 100 mM-ra. Még 50 mM-ot is használtam, kimutatható változás nélkül.)
• 20 mM KCl
• 2 mM MgSO4
• 0,8 mg/ml CTAB (hexadeciltrimetilammónium-bromid)
• 0.4 mg/mL nátrium dezoxikolát
• 5,4 μL/mL béta-merkaptoetanol

Szubsztrátoldat

Mintánként 600 μL-re van szüksége.

• 60 mM Na2HPO4
• 40 mM NaH2PO4
• 1 mg/mL o-nitrofenil-β-D-galaktozid (ONPG)
• 2.7 μL/mL β-merkaptoetanol

(A Zhang protokollban 20 μg/mL CTAB és 10 μg/mL dezoxikolát is szerepel. Ezeket kihagyom, gondolván, hogy a permeabilizáló oldatból még bőven marad, és ha még nem haltak meg, akkor nem is fognak.)

Stop oldat

Mintánként 700 μL-re van szükséged.

• 1 M nátrium-karbonát (Na2CO3)

A stopoldat magas pH-ja denaturálja a β-Gal-t és körülbelül megduplázza a reakció sárga színét.