Biológiai órák

A földi ciklus nappali és éjszakai váltakozása olyan megbízható, hogy nem meglepő, hogy az állatok, növények és baktériumok is beállítják viselkedésüket és fiziológiájukat (áttekintésért lásd 1. hivatkozás). A cirkadián ritmusok minden élőlény mindenütt jelenlévő alkalmazkodása a legkiszámíthatóbb környezeti kihívásokhoz. Az állandó körülmények között fennmaradó, ≈1 napos periódusú biológiai ritmust cirkadiánnak (circa, “körül”; dian, “nap”) nevezzük.

Az oszcilláció alapjául szolgáló molekulák egészen a közelmúltig ismeretlenek maradtak. Az ilyen oszcillációk RNS- vagy fehérjeszintézis-gátlókkal történő megzavarása arra utal, hogy ilyen molekulák is részt vesznek benne (2).

A mechanizmusok feltárásában sikeresnek bizonyult a genetikai módosítások alkalmazása. A gyümölcslégyben, a Drosophila melanogasterben felfedezett első és második óra mutánsok a periódus és az időtlen gének (3-5).

A gyümölcslegyekben a periódus és az időtlen gének mRNS- és fehérjetermékeinek mennyisége ≈24 órán keresztül ciklikusan változik a légy agyának meghatározott helyein (6). Maki Kaneko és munkatársai ezekről a feltételezett pacemaker sejtekről beszéltek a gyümölcslégy agyában, ezeket a molekuláris oszcillációt markerként használva (7). A kifejlett fejben a fehérje vizsgálatok kimutatták, hogy a per ritmikusan expresszálódik specifikus helyeken, a központi agy és a látóidegek között elhelyezkedő laterális neuronokban. A laterális neuronokat tekintik a felnőtt légy lokomotoros aktivitásritmusának feltételezett pacemaker sejtjeinek.

Kaneko és munkatársai (7) kimutatták, hogy a per és tim termékei a lárva agyában korlátozott számú neuronban kimutathatók. Az expressziós mintázat számos ilyen sejtben ciklikus. Ezen neuronok közül öt laterálisan elhelyezkedő sejt expresszál. PERIOD (PER) anyagot a korai lárvastádiumtól kezdve, ami arra utal, hogy ezek lehetnek felelősek a lárvális időmegőrzésért, az eclosionért és a lokomotoros aktivitásért. Egy másik érdekes felfedezés a per és tim ciklikusan expresszálódó neuronok egy olyan klasztere, amely a laterális neuronokkal ellentétes fázisban expresszálódik. Az eredmények arra utalnak, hogy egy szervezetben több, különböző fiziológiai vagy viselkedési folyamatok ritmusában részt vevő oszcillátor van jelen. Kaneko és munkatársai (7) szintén leírták a pacemaker neuronok vezetékezési mintázatának anatómiai jellemzését a per promóter-függő riportergén-expresszió segítségével. Egy ilyen molekuláris anatómiai megközelítés új betekintést hozhat ennek az agyi rendszernek a funkcionális feltérképezésébe. Továbbá az emlősök és a legyek órasejtjei közötti összehasonlításnak tisztáznia kell e rendszerek közötti evolúciós kapcsolatot.

A transzkripció cirkadián kontrollja belépési pontot biztosít a cisz-hatású szabályozó elemek és a transz-hatású faktorok elemzéséhez, amelyeken keresztül az óra számos óra által szabályozott génkifejeződést szabályozhat (6). Ezek a feltételezett cisz-hatású szabályozó elemek, amelyeket “time-box”-nak (8) neveztek el, feltételezhetően az órakontrollált gének promóter és enhancer régiójában helyezkednek el. Továbbá az órakontrollált reszponzív elem (6) vagy time-box szabályozhatja az endogén cirkadián fiziológiai jelenségeket állandó körülmények között. Legutóbb a Drosophila period gén promóter régiójában azonosították a time-box lehetséges jelöltjét (9). Bár azt javasolták, hogy a per a transzkripciós represszión keresztül közvetíti az mRNS-ciklust, a per és a DNS közötti közvetlen kölcsönhatás nagyon valószínűtlen, mivel a PER-nek nincs DNS-kötő doménje. Hardin csoportja széleskörűen elemezte a per gén promóter régióját per-lacZ fúziós gén transzgenikus legyekkel végzett vizsgálatokban (9). Azonosítottak egy cirkadián transzkripciós enhancert egy 69 bp hosszúságú DNS-fragmentumon belül, amely a per gén előtt egy E-boxot tartalmaz, és amely felelős a per gén expressziójának éjszakai aktiválásáért. Az E-box a transzkripciós faktorok bázikus helix-loop-helix osztályának ismert kötőhelye.

A legutóbbi idők legerősebb jelöltje az oszcillátorban transz-hatású faktornak a Clock, amelyet forward-genetikai stratégiával klónoztak (10). Takahashi csoportja (10) izolálta és elemezte cirkadián mutáns egértörzsek lokomotor-aktivitását. A Clock mutáns hosszú periódust mutatott, amely néhány nap állandó sötétségben töltött idő után aritmiássá vált. Takahashi és munkatársai (10) sikeresen klónozták a felelős gént, és azonosították a mutációt a Clock gén fehérjét kódoló régiójában. Érdekes módon a Clock fehérje tartalmaz egy fehérje-fehérje kötő domént (PAS), amely a Drosophila per génben található, és egy bázikus helix-loop-helix motívumot a DNS-kötéshez. Ráadásul Takahashi és munkatársai (10) a normál clock gén átvitelével teljesen meg tudták menteni a clock mutáns egerek hosszú periódusú és aritmiás fenotípusát.

Ravi Allada és munkatársai leírták a Clock-ra összpontosító közös molekuláris komponenseket, amelyek mind a legyekben, mind az emberben felelősek a cirkadián ritmus kialakulásáért (11). Allada és munkatársai (11) kémiailag mutagenizált legyeket szűrve olyan mutánsokat kerestek, amelyek megváltoztatják vagy megszüntetik a lokomotoros aktivitás cirkadián ritmusát, és találtak egy új aritmikus mutánst, amelyet kezdetben Jrk-nek neveztek el. A Jrk legyek a transzkripció csökkent szintje miatt alacsony szinten expresszálják a periódus és az időtlen fehérjéket. A gént azonosították, és feltűnő szekvencia-konzerváltságot mutat az emlősök cirkadián ritmusgénjével, a Clockkal; ezért Allada és munkatársai (11) ezt a légygént dClocknak nevezték el. Az egér clock-hoz hasonlóan a Drosophila clock is tartalmaz bázikus helix-loop-helix és PAS doméneket, valamint egy transzkripciós aktiváló domént.

A legújabb munkák mind az emlősöknél, mind a legyeknél arra utalnak, hogy a CLOCK fehérjepartnerei is evolúciósan konzerváltak (BMAL-nak nevezve) (12, 13). Kimutatták, hogy a CLOCK-BMAL dimmerek a period és timeless gének promóter régiójához kötődnek, és legyekben mindkét gént transzaktiválják. Továbbá a PERIOD-TIMELESS (PER-TIM) expresszió elnyomja a CLOCK-BMAL által közvetített riporter indukciót. Így egy negatív visszacsatolási modellt javasoltak (1. ábra).

Az emlősökben a hipotalamuszban található SCN-t tekintik a cirkadián ritmusjelenségek fő pacemakerének, amint azt számos anatómiai és fiziológiai vizsgálat bizonyította (14). Nemrégiben a Drosophila periódus gén három homológjáról számoltak be egérben és emberben (15). Annak ellenére, hogy három emlős period homológ létezik, amelyek mRNS cirkadián oszcillációt mutatnak az egér agyának suprachiasmaticus magjában, nem számoltak be a cirkadián lokomotoros viselkedés funkcionális implikációjáról.

Annak tisztázására, hogy az emlősök per homológja részt vehet-e az emlősök lokomotoros viselkedésének cirkadián ritmusában, Ishida csoportja klónozott egy patkány per homológot, és aritmiás SCN-lesionált patkányokat készített a perifériás szövetek cirkadián ritmusának megfigyelésére (16).

Azért, hogy megvizsgáljuk, hogy a patkány PERIOD 2 (RPER2) mRNS ritmikus expressziója megfigyelhető-e az SCN-en kívül más szövetekben is, Northern blot analízist végeztünk a szem, az agy, a szív, a tüdő lép, a máj és a vesék szöveteiben. Érdekes módon minden vizsgált szövetben az RPER2 mRNS ritmikus expresszióját mutatták ki, bár az éjszakai/nappali arány minden szövetben eltérő volt. Az RPER2 a Drosophila periódus génjének emlős homológjaként viselkedik (16), mivel cirkadián expressziója a legkülönbözőbb szövetekben magas volt éjszaka, ahogy a periódus a Drosophilában.

Mivel az SCN-t cirkadián óra pacemakernek tekintik az emlősökben, Ishida csoportja (16) azt vizsgálta, hogy az RPER2 mRNS több szöveti cirkadián expresszióját befolyásolja-e az SCN sérülése. Meglepő módon az RPER2 többszöveti expressziójának ritmikus jellegét az SCN-laesió teljesen megszüntette. Az RPER2 többszöveti expressziója tehát az SCN ellenőrzése alatt áll. Ez az első jelentés, amely arra utal, hogy a többszövetes cirkadián ritmust egy emlős agyi óra, a hipotalamusz SCN-je szabályozza. Az adatok arra is utalnak, hogy az emlősök per homológja (RPER2) részt vehet az emlősök lokomotoros viselkedésének cirkadián ritmusában, mivel az RPER2 mRNS cirkadián expressziójának elvesztése az egész testben akkor következett be, amikor a patkányok cirkadián lokomotoros aktivitása megszűnt. Egy ilyen probléma tisztázásához olyan transzgenikus állatokat kell készítenünk, amelyek az RPER2 génben funkcióvesztéses vagy funkciónyeréses mutációt mutatnak. Az a tény, hogy az RPER2 mRNS ritmikus kifejeződése több szövetben teljesen az SCN-től függ, arra utal, hogy az egész test ritmusának koordinált fenntartásához bizonyos jelekre van szükség (2. ábra). Egy SCN-transzplantációs vizsgálat szintén az SCN-ből származó humorális faktorok fontosságára utal (17). Az SCN-ből származó ilyen humorális faktorok fontosak lehetnek az RPER2 gén cirkadián ritmikus expressziójának létrehozásában a perifériás szövetekben. Úgy tűnik tehát, hogy – a fejlődésbiológiához hasonlóan – e biológiai óra kulcsmolekulái jól konzerválódnak a legyek és az emlősök között. A közeljövőben elképzelhető a baktériumoktól (18) az emberig terjedő közös molekuláris óra mechanizmusa.

.