Biszulfit-szekvenálás

A biszulfit-szekvenálás rutin szekvenálási módszereket alkalmaz biszulfitkezelt genomi DNS-en a CpG-dinukleotidok metilációs állapotának meghatározására. Más, nem szekvenálási stratégiákat is alkalmaznak a metiláció lekérdezésére meghatározott lokuszokon vagy az egész genom szintjén. Valamennyi stratégia feltételezi, hogy a nem metilezett citozinek uracillá történő biszulfit-indukált átalakulása teljes, és ez szolgál az összes későbbi technika alapjául. Ideális esetben az alkalmazott módszer minden egyes allél esetében külön-külön határozza meg a metilációs állapotot. A biszulfit-szekvenálás alternatív módszerei közé tartozik a kombinált biszulfit-restrikciós analízis és a metilált DNS immunprecipitáció (MeDIP).

A biszulfitkezelt DNS elemzésére szolgáló módszereket folyamatosan fejlesztik. E gyorsan fejlődő módszertanok összefoglalására számos áttekintő cikket írtak.

A módszertanok általában a metiláció-specifikus PCR-en (MSP) alapuló stratégiákra (4. ábra) és a nem metiláció-specifikus körülmények között végzett polimeráz láncreakciót (PCR) alkalmazó stratégiákra (3. ábra) oszthatók. A microarray-alapú módszerek nem metiláció-specifikus körülményeken alapuló PCR-t is alkalmaznak.

Nem metiláció-specifikus PCR-alapú módszerekSzerkesztés

3. ábra: Nem metiláció-specifikus PCR-en alapuló DNS-metilációs elemzési módszerek. A biszulfitkonverziót követően a genomiális DNS-t olyan PCR-rel amplifikálják, amely nem tesz különbséget metilált és nem metilált szekvenciák között. A rendelkezésre álló számos módszerrel ezután az amplikonban a biszulfitkonverzió következtében bekövetkezett változások alapján történik a megkülönböztetés.

Közvetlen szekvenálásSzerkesztés

A biszulfitkezelt DNS felhasználásával végzett metilációelemzés első bejelentett módszere PCR-t és standard dideoxinukleotid DNS-szekvenálást használt a biszulfitkonverziónak ellenálló nukleotidok közvetlen meghatározására. A primereket úgy tervezték, hogy azok szálspecifikusak, valamint biszulfit-specifikusak legyenek (azaz olyan primerek, amelyek nem-CpG citozinokat tartalmaznak, így nem komplementerek a nem biszulfittal kezelt DNS-hez), és a kérdéses metilációs helyet flankálják (de nem érintik). Ezért mind a metilált, mind a nem metilált szekvenciákat felerősíti, ellentétben a metiláció-specifikus PCR-rel. A metilálatlan citozinok minden helye timinként jelenik meg a sense szál amplifikált szekvenciájában, és adeninként az antisense szál amplifikált szekvenciájában. A PCR-primerekbe nagy áteresztőképességű szekvenáló adaptorok beépítésével a PCR-termékek tömegesen párhuzamos szekvenálással szekvenálhatók. Alternatív megoldásként – és munkaigényes módon – a PCR-termék klónozható és szekvenálható. A termék szekvenáláshoz való feljavítására nested PCR módszereket lehet alkalmazni.

Az összes későbbi, biszulfittal kezelt DNS-t használó DNS-metilációs elemzési technika a Frommer és munkatársai által készített ezen jelentésen alapul (2. ábra). Bár a legtöbb más módozat nem valódi szekvenáláson alapuló technika, a “biszulfit-szekvenálás” kifejezést gyakran használják a biszulfit-konverziós DNS-metilációs elemzési technikák általános leírására.

PyrosequencingEdit

Pyrosequencinget is használtak biszulfitkezelt DNS elemzésére metiláció-specifikus PCR alkalmazása nélkül. Az érdeklődésre számot tartó régió PCR-amplifikációját követően a piroszekvenálást a régió specifikus CpG-helyeinek biszulfittal átalakított szekvenciájának meghatározására használják. A C-T arány az egyes helyeken kvantitatív módon meghatározható a C és T beépülésének mennyisége alapján a szekvencia meghosszabbítása során. A módszer fő korlátja a technológia költsége. A piroszekvenálás azonban jól lehetővé teszi a nagy áteresztőképességű szűrési módszerek kiterjesztését.

A technika további fejlesztését a közelmúltban írták le Wong és munkatársai, amely allélspecifikus primereket használ, amelyek egynukleotid-polimorfizmusokat építenek be a szekvenáló primer szekvenciájába, és így lehetővé teszik az anyai és apai allélok elkülönített elemzését. Ez a technika különösen hasznos a genomiális imprinting elemzésében.

Metiláció-érzékeny egyszálú konformációs analízis (MS-SSCA)Edit

Ez a módszer az egyszálú konformációs polimorfizmus (SNP) elemzésére kifejlesztett egyszálú konformációs polimorfizmus analízis (SSCA) módszerén alapul. Az SSCA megkülönbözteti az azonos méretű, de eltérő szekvenciájú egyszálú DNS-fragmentumokat a nem denaturáló elektroforézisben történő eltérő migráció alapján. Az MS-SSCA-ban ezt arra használják, hogy megkülönböztessék a biszulfittal kezelt, PCR-amplikált, az érdeklődésre számot tartó CpG-helyeket tartalmazó régiókat. Bár az SSCA nem elég érzékeny, ha csak egyetlen nukleotid különbség van jelen, a biszulfitkezelés gyakran számos C-T átalakulást végez a legtöbb érdekes régióban, és az így kapott érzékenység megközelíti a 100%-ot. Az MS-SSCA a DNS-metiláció mértékének félig kvantitatív elemzését is lehetővé teszi a sávok intenzitásának aránya alapján. Ez a módszer azonban nem az egyes metilációs helyek, hanem az összes CpG-hely egészének értékelésére szolgál a vizsgált régióban.

Nagyfelbontású olvadáselemzés (HRM)Edit

Egy további módszer az átalakított és a nem átalakított biszulfittal kezelt DNS megkülönböztetésére a nagyfelbontású olvadáselemzés (HRM), egy kvantitatív PCR-alapú technika, amelyet eredetileg az SNP-k megkülönböztetésére terveztek. A PCR-amplikonokat közvetlenül elemzik a hőmérséklet-emelkedés és az olvadás közbeni interkaláló fluoreszcens festék felszabadulása révén. A metiláció mértéke, amelyet az amplikon C-T-tartalma képvisel, határozza meg az olvadás gyorsaságát és a festék ebből következő felszabadulását. Ez a módszer lehetővé teszi a közvetlen kvantitást egy egycsöves vizsgálatban, de a metilációt az amplifikált régió egészében, nem pedig specifikus CpG-helyeken értékeli.

Metiláció-érzékeny egynukleotid primer hosszabbítás (MS-SnuPE)Edit

Az MS-SnuPE a primer hosszabbítási módszert alkalmazza, amelyet eredetileg egynukleotid polimorfizmusok elemzésére terveztek. A DNS-t biszulfit-konvertálják, és biszulfit-specifikus primereket kötnek a szekvenciához az érdeklődésre számot tartó CpG-t közvetlenül megelőző bázispárig. A primer a DNS-polimeráz termináló dideoxinukleotidok segítségével egy bázispárral meghosszabbodik a C (vagy T) felé, és a C:T arányát kvantitatív módon meghatározzák.

A C:T arány meghatározására számos módszer alkalmazható. Kezdetben az MS-SnuPE a radioaktív ddNTP-kre támaszkodott, mint a primer meghosszabbításának riporterére. Fluoreszcencia-alapú módszerek vagy piroszekvenálás is használható. A mátrix-asszisztált lézer deszorpciós ionizáció/repülési idő (MALDI-TOF) tömegspektrometriás elemzés azonban a két polimorf primer hosszabbítási termék megkülönböztetésére használható, lényegében az SNP genotipizálásra tervezett GOOD assay alapján. Az ionpáros fordított fázisú nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát (IP-RP-HPLC) szintén használták már a primer hosszabbítási termékek megkülönböztetésére.

Bázisspecifikus hasítás/MALDI-TOFEdit

Az Ehrich és munkatársai által nemrég leírt módszer tovább használja a biszulfit-konverziókat egy bázisspecifikus hasítási lépés hozzáadásával a nukleotidváltozásokból nyert információ fokozása érdekében. Ha először az érdeklődésre számot tartó régiót in vitro átírják RNS-be (a kezdeti amplifikáció során a PCR-primerhez egy RNS-polimeráz promóterhelyet adnak), az RNáz A segítségével az RNS-átiratot bázisspecifikus helyeken lehet hasítani. Mivel az RNáz A specifikusan hasítja az RNS-t a citozin és uracil ribonukleotidoknál, a bázisspecifikusságot a hasításnak ellenálló dTTP beépítésével érhetjük el, ha citozin-specifikus (C-specifikus) hasítást szeretnénk, és dCTP beépítésével, ha uracil-specifikus (U-specifikus) hasítást szeretnénk. A hasított fragmentumok ezután MALDI-TOF segítségével elemezhetők. A biszulfitkezelés vagy a hasítási helyek bevezetését/eltávolítását eredményezi C-ről-U-ra történő átalakulással, vagy a fragmentum tömegének eltolódását G-ről-A-ra történő átalakulással az amplifikált reverz szálban. A C-specifikus hasítás specifikusan vágja az összes metilált CpG-helyet. A keletkező fragmentumok méretének elemzésével meghatározható a CpG-helyek DNS-metilációjának specifikus mintázata a régión belül, nem pedig a régió egészének metilációjának mértéke. Ez a módszer bizonyította hatékonyságát a nagy áteresztőképességű szűrés szempontjából, lehetővé téve számos CpG-hely lekérdezését több szövetben, költséghatékony módon.

Metiláció-specifikus PCR (MSP)Edit

4. ábra: A metiláció-specifikus PCR egy érzékeny módszer a metilált régió diszkriminatív felerősítésére és kimutatására metilált-specifikus primerek segítségével biszulfit-konvertált genomiális DNS-en. Az ilyen primerek csak olyan szekvenciákhoz kapcsolódnak, amelyek metiláltak, és így olyan 5-metilcitozinokat tartalmaznak, amelyek ellenállnak a biszulfit általi átalakításnak. Alternatív módon nem metilált specifikus primerek is használhatók.

A metilációs analízis ezen alternatív módszere szintén biszulfittal kezelt DNS-t használ, de nem kell szekvenálni a kérdéses területet. Ehelyett a primerpárokat maguk is úgy tervezik, hogy “metilált-specifikusak” legyenek azáltal, hogy csak a nem átalakított 5-metilcitozinokat komplementáló szekvenciákat tartalmazzák, vagy fordítva, “nem metilált-specifikusak”, a nem metilált citozinokból átalakított timineket komplementálják. A metiláltságot a specifikus primer amplifikációra való képessége határozza meg. Ez a módszer különösen hasznos az esetlegesen nagy metilációs sűrűségű CpG-szigetek lekérdezéséhez, mivel a primerben lévő CpG-párok számának növekedése növeli a vizsgálat specificitását. A CpG-pár elhelyezése a primer 3′-végén szintén javítja az érzékenységet. Az MSP-t használó első jelentés elegendő érzékenységet írt le az allélek 0,1%-ának metilációjának kimutatására. Általánosságban az MSP-t és a hozzá kapcsolódó protokollokat tartják a legérzékenyebbnek, amikor egy adott lókusz metilációs állapotát kérdezik le.

A MethyLight módszer az MSP-n alapul, de kvantitatív PCR segítségével kvantitatív elemzést biztosít. Metilált-specifikus primereket használnak, és egy metilált-specifikus fluoreszcens riporter szondát is alkalmaznak, amely az amplifikált régióhoz kapcsolódik. Alternatív módon a primereket vagy a szondát metilációs specifitás nélkül is meg lehet tervezni, ha az érintett szekvenciákon belül a CpG-párok megkülönböztetésére van szükség. A mennyiségi meghatározás egy metilált referencia-DNS-hez viszonyítva történik. E protokoll módosítása a PCR specifikusságának növelésére a sikeresen biszulfittá konvertált DNS-hez (ConLight-MSP) egy további szondát használ a biszulfittá nem konvertált DNS-hez, hogy számszerűsítse ezt a nem specifikus amplifikációt.

A MSP-vel amplifikált DNS-t használó további módszertan a termékeket olvadási görbe elemzésével elemzi (Mc-MSP). Ez a módszer a biszulfit-konvertált DNS-t mind metilált-specifikus, mind nem metilált-specifikus primerekkel amplifikálja, és a két termék mennyiségi arányát az olvadási görbeelemzés során keletkező eltérő csúcsok összehasonlításával határozza meg. Bevezettek egy olyan nagy felbontású olvadáselemzési módszert, amely a kvantitatív PCR-t és az olvadáselemzést egyaránt használja, különösen az alacsony szintű metiláció érzékeny kimutatására

Mikroarray-alapú módszerekSzerkesztés

A mikroarray-alapú módszerek a biszulfittal kezelt DNS elemzésére rendelkezésre álló technológiák logikus kiterjesztése a metiláció genom-szerte történő elemzésének lehetővé tétele érdekében. Az oligonukleotid microarray-ket az érdeklődésre számot tartó CpG-helyeket célzó oligonukleotid hibridizációs szondapárok felhasználásával tervezik. Az egyik komplementer a változatlan metilált szekvenciához, a másik pedig komplementer a C-U-vá konvertált metilálatlan szekvenciához. A szondák biszulfit-specifikusak is, hogy megakadályozzák a biszulfit által hiányosan átalakított DNS-hez való kötődést. Az Illumina Methylation Assay egy ilyen vizsgálat, amely a biszulfit szekvenálási technológiát alkalmazza microarray szinten, hogy genom-szintű metilációs adatokat hozzon létre.