Brainbow
A Brainbow technikák a Cre-Lox rekombinációra támaszkodnak, amelyben a Cre rekombináz fehérje a loxP-helyek közötti DNS inverzióját vagy kivágását hajtja végre. Az eredeti Brainbow módszer magában foglalja a Brainbow-1 és a Brainbow-2 módszereket, amelyek a cre/lox rekombináció különböző formáit használják. A Brainbow-3, a Brainbow-1 módosított változata 2013-ban került kifejlesztésre. Minden Brainbow altípus esetében egy adott XFP kifejeződése sztochasztikus, azaz véletlenszerű esemény.
A Brainbow-1 különböző fluoreszcens fehérje géneket (XFP-ket) tartalmazó DNS-konstrukciókat használ, amelyeket a loxP mutáns és kanonikus formái választanak el egymástól. Ez egymást kizáró kivágási lehetőségeket hoz létre, mivel a cre-mediált rekombináció csak azonos loxP-helyek között történik. Miután a rekombináció megtörtént, a közvetlenül a promóter után megmaradó fluoreszcens fehérje egyedileg fejeződik ki. Így egy olyan konstrukció, amelynek négy XFP-jét három különböző loxP-hely, három kimetszési esemény és az eredeti konstrukció választja el egymástól, négy különböző fluoreszcens fehérjét képes előállítani.
A Brainbow-2 a Cre-kimetszést és inverziót használja, hogy egy adott konstrukcióban többféle expressziós lehetőséget tegyen lehetővé. Egy DNS-szegmensben két ellentétesen orientált XFP-vel a Cre egy véletlenszerű inverziós eseményt indukál, amely az egyik fluoreszcens fehérjét az expresszióhoz megfelelő orientációban hagyja. Ha két ilyen inverz szekvencia egymáshoz igazodik, három különböző inverziós esemény lehetséges. Ha a kivágási eseményeket is figyelembe vesszük, a négy fluoreszcens fehérje közül az egyik fog kifejeződni a Cre kivágások és inverziók adott kombinációja esetén.
A Brainbow-3 megtartja a Brainbow-1 loxP formátumát, de az RFP, YFP és CFP géneket mOrange2, EGFP és mKate2 génekkel helyettesíti. Az mO2, EGFP és mK2 géneket azért választottuk, mert fluoreszcens gerjesztési és emissziós spektrumuk minimálisan fedik egymást, és mert minimális szekvencia-homológiájuk van, ami lehetővé teszi olyan szelektív antitestek tervezését, amelyekkel immunhisztokémiai protokollokban kimutathatók. A Brainbow-3 a neuronok XFP-kkel való egyenetlen feltöltésének problémáját is megoldja az XFP-k farnezilált származékainak használatával, amelyek egyenletesebben jutnak el a neuronmembránokba.
A Brainbow in vivo megvalósítása két transzgenikus organizmustörzs keresztezésével történik: az egyik a Cre fehérjét expresszálja, a másik pedig egy loxP/XFP konstrukció több változatával transzfektált. A transzgén több példányának használata lehetővé teszi, hogy az XFP-k úgy kombinálódjanak, hogy körülbelül 100 különböző színt adjanak. Így minden egyes neuron más-más árnyalattal van jelölve a fluoreszcens fehérjék adott kombinatorikus és sztochasztikus expressziója alapján.
A differenciális XFP-expressziós mintázatok láthatóvá tétele érdekében az agyi szeleteket konfokális mikroszkópiával képezik le. Az adott gerjesztési hullámhosszúságú fotonnal történő expozíció során minden fluorofór jelet bocsát ki, amelyet egy vörös, zöld vagy kék csatornába gyűjtenek, és az így kapott fénykombinációt adatelemző szoftverrel elemzik. A különböző színű neuronok szuperpozíciója lehetővé teszi a bonyolult idegi áramkörök vizuális szétválasztását.
Az eddigi vizsgálatok során a Brainbow-t túlnyomórészt egereken tesztelték, azonban a fent leírt alaptechnikát a 2007-ben bemutatott eredeti módszer megjelenése óta újabb vizsgálatokban is módosították.
MiceEdit
Az egér agya 75 000 000 neuronból áll, és jobban hasonlít az emberi agyhoz, mint a drosophila és más, e technika modellezésére gyakran használt szervezetek, például a C. elegans. Az egerek voltak az első olyan szervezetek, amelyekben sikeresen alkalmazták a Brainbow idegrendszeri képalkotó módszert. Livet és munkatársai (2007) a Brainbow egerek két változatát fejlesztették ki a Brainbow-1 és a Brainbow-2 segítségével, amelyeket fentebb ismertettünk. E módszerek használata során egy teljes térkép elkészítéséhez és az egér izom axonjainak nyomon követéséhez több tízezer képet kell gyűjteni és halmokká összeállítani, hogy egy teljes sémát lehessen készíteni. Ezután lehetőség nyílik az egyes motoros axonok és szinaptikus kapcsolataik nyomon követésére az izom teljes konnektomjának megalkotásához.
A Brainbow technikával transzgénikus egerekben vizsgált neuronok további példái a fülizmokat innerváló motoros idegben, az agytörzsben lévő axonpályákban és a hippokampusz fogazott gyrusában találhatók.
DrosophilaSzerkesztés
A Drosophila agyának összetettsége, amely körülbelül 100 000 neuronból áll, kiválóan alkalmas a Brainbow-hoz hasonló neurofiziológiai és idegtudományi technikák alkalmazására. Valójában Stefanie Hampel és munkatársai (2011) a Brainbow-t genetikai célzási eszközökkel kombinálva azonosították az egyes neuronokat a Drosophila agyban és a különböző neuronális vonalakban. Az egyik genetikai célzási eszköz egy GAL4/UAS bináris expressziós rendszer volt, amely az UAS-Brainbow expresszióját szabályozza, és az expressziót neuronok kis csoportjaira irányítja. A “Flip Out” módszerek alkalmazása növelte a riporterkonstrukció celluláris felbontását. A fluoreszcens fehérjék expressziója az eredeti Brainbow-hoz hasonlóan a Cre-rekombinációtól függött, amely a megfelelő lox-helyeknek felelt meg. Hampel és munkatársai (2011) szintén kifejlesztették a Brainbow saját változatát (dBrainbow), amely az endogén fluoreszcencia helyett az epitópok antitest-jelölésén alapul. Konstrukciójuk két példánya hat fényes, elválasztható színt eredményez. Ez, valamint a színkiosztás egyszerűsítései lehetővé tették számukra, hogy az egyes neuronok pályáját nagy távolságokon keresztül is megfigyelhessék. Konkrétan nyomon követték a motoros neuronokat az antennalobbról a neuromuszkuláris csomópontokig, ami lehetővé tette számukra, hogy azonosítsák az egyes neuronok specifikus izomcélpontjait.
Végeredményben ez a technika lehetővé teszi a Drosophila neuronális áramköreinek hatékony feltérképezését, így a kutatók több információt fedezhetnek fel e gerinctelen állat agyi szerkezetéről és arról, hogy az hogyan kapcsolódik az ebből következő viselkedéshez.