Elágazó DNS (bDNS) technológia

BY admin
|

Bevezetés

Az elágazó DNS (bDNS) vizsgálat egyedülálló és hatékony eszközt biztosít a nukleinsavmolekulák megbízható mennyiségi meghatározásához. Alapvetően különbözik a célszekvencia-amplifikációs módszerektől, mint például a PCR, a bDNS-teszt közvetlenül fiziológiai szintű nukleinsavmolekulákat mér a riporterjel felerősítésével, ahelyett, hogy a célszekvenciák sokszorosítása lenne a kimutatás eszköze, és így elkerüli a célszekvenciák kivonásában és amplifikálásában rejlő hibákat. A bDNS-teszt lineáris jelerősítést alkalmaz szintetikus oligonukleotid szondák és bDNS-molekulák felhasználásával, és körülbelül 500 és 10 000 000 molekula között képes pontosan és precízen mérni. A bDNS-technológia új fejlesztései közé tartozik az előerősítő molekulák hozzáadása és az új nukleotidok, az isoC és az isoG beépítése az oligonukleotid szondaszekvenciákba a jel további fokozása és a bDNS-próbakomponensek nem specifikus hibridizációja által okozott zaj csökkentése érdekében. Ezek a fejlesztések a bDNS-teszt mennyiségi kimutatási határát akár 50 molekulára is kiterjesztették.

A bDNS-technológia története

A bDNS-teszt jól alkalmazható rutinszerű klinikai vagy kutatási környezetben, és számos területen sikeresen alkalmazzák, beleértve a vírusos betegségekben szenvedő betegek prognózisát és monitorozását. Megbízható eszközt biztosítva a vírusterhelés közvetlen számszerűsítésére klinikai mintákban, bDNS-próbákat fejlesztettek ki hepatitis B vírus DNS, hepatitis C vírus RNS), humán immunhiány vírus 1. típusú RNS és citomegalovírus DNS mérésére. Az oligonukleotid szondák egyedi tervezésével a bDNS-teszt lehetséges alkalmazásai messze túlmutatnak a vírusnukleinsav-kvantitatív meghatározáson. A célnukleinsavmolekulák specifikus szekvenciáihoz tartozó oligonukleotid szondák létrehozásával a bDNS-tesztet a legkülönbözőbb alkalmazásokhoz igazították. A kutatók például szondákat terveztek a bDNS-teszthez a sejtek mRNS-szintjének mérésére. Ez számos kutatási alkalmazásban gyümölcsöző megközelítésnek bizonyult, beleértve a citokin mRNS-szint változásainak nyomon követését egészséges és immunhiányos betegpopulációkban, az inzulin splicing-minták vizsgálatát és a stresszgének indukciójának értékelését molekuláris toxikológiai alkalmazásokhoz. Sokoldalúsága, könnyű használhatósága és magas szintű teljesítménye miatt a bDNS-teszt gyorsan a nukleinsav-kvantitatív meghatározás

Áttekintés

A bDNS-teszt 96 lyukú mikrolemez formátumot használ, és specifikus hibridizációs reakciók sorozatán és a hibridizált szondák kemilumineszcens detektálásán alapul. Az egyes mikrosejtek felületéhez “befogott” szondák kapcsolódnak, amelyek egy specifikus nukleotidszekvenciát tartalmaznak. Ezek a befogott szondák a “célszondák” egy részhalmazához kötődnek, amelyek a célnukleinsavmolekula specifikus nukleotidszekvenciáihoz kötődnek. Ez a hibridizációs sorozat lehorgonyozza a célnukleinsavmolekulát a mikrosejt felszínéhez. A célnukleinsav kimutatása és a jel felerősítése egy másik hibridizációs sorozaton keresztül történik.

A célszondák második alcsoportja a célnukleinsavmolekulát bDNS-erősítő molekulákhoz köti. Előerősítő molekulák hozzáadásával, amelyek egy további erősítő réteget biztosítanak a célszondák és a bDNS-erősítő molekulák között, még nagyobb jelerősítés érhető el. Minden bDNS-erősítő molekulát úgy terveztek, hogy 15 kart tartalmazzon, amelyek mindegyike három kötőhelyet tartalmaz az alkalikus foszfatázzal konjugált “címkeszondák” számára. Az alkalikus foszfatáz által aktivált dioxetán szubsztrát bevezetésekor kemilumineszcens jel keletkezik. Ez a jel könnyen számszerűsíthető a kibocsátott fotonok számának luminométerben történő számlálásával. A bDNS-teszt eredendően kvantitatív, mivel a kibocsátott fotonok száma közvetlen kapcsolatban áll a mintában lévő célnukleinsav mennyiségével.

Műszerek

Készülékek – Chiron lemezmelegítő 8×12-es mikrocellatartóval felszerelve – Chiron lemezolvasó luminométer

Reagensek az 1. napra

  • Oligonukleotid-
    • Oligonukleotid-módosított mikrocellák
    • Lízis hígítószer
    • Lízis reagens (proteináz K)
    • Célszondák a befogáshoz
    • Célszondák a jelöléshez
    • Minták
    • Standardok és kontrollok (opcionális)

    Reagensek a 2. napra

    Eljárás

    1. nap

    1. Készítse el a minta munkareagensét az alábbiak kombinálásával:
    • 6 ml liziszhígító
    • 600 ml lízisreagens
    • 32 ml 500 fm/ml célszondák a befogáshoz (20 fm/200 ml végleges)
    • 96 ml500 fm/ml célszondák a jelöléshez (60 fm/200 ml végleges)

    Megjegyzés: A célszondák tényleges koncentrációja a célnukleinsavmolekulától függően változik.

    1. Plazma- vagy szérumminták esetén pipettázzon 150 ml Specimen Working Reagent és 50 ml szérumot vagy plazmát két példányban oligonukleotiddal módosított mikrosejtekbe. Sejt- vagy szövetminták esetében készítsen és extraháljon RNS-pelleteket Specimen Working Reagentben a leírtak szerint, és pipettázzon 200 ml-t minden egyes RNS-kivonatból két példányban oligonukleotiddal módosított mikrokutakba.
    2. Kívánság szerint pozitív és negatív kontrollokat is tartalmazhat a specificitás érdekében. A kontrollokat ugyanúgy kell kezelni, mint a 2. lépésben (fent) a minták esetében leírt módon, és kétszeresen kell lefuttatni.
    3. Ha szükséges, az abszolút mennyiségi meghatározás érdekében standardokat is be lehet vonni. Pipettázzon 150 ml Specimen Working Reagent és 50 ml megfelelő standard görbe tagot a duplikált oligonukleotiddal módosított mikrosejtekbe.
    4. Zárja le a mikrosejteket Mylar fóliával, és inkubálja a mikrosejteket egy éjszakán át 53°C-on a Chiron lemezmelegítőben. (Megjegyzés: A hőmérséklet az adott vizsgálathoz meghatározott optimális hőmérséklettől függ.)

    2. nap

    1. Vegye ki a lemezt a Chiron lemezmelegítőből, és hagyja állni 10 percig szobahőmérsékleten. Amíg a lemez lehűl, készítse el az erősítőoldatot az erősítő koncentrátum 200 fm/ml-es hígításával címkehígítóban. A végső koncentrációnak 10 fm/50 ml-nek kell lennie.
    2. Mossuk át a mikrosejteket kétszer az A mosással, majd pipettázzunk 50 ml hígított erősítőt minden egyes mélyedésbe. Inkubálja a mikrosejteket 30 percig 53°C-on a Chiron lemezmelegítőben.
    3. Vegye ki a lemezt a Chiron lemezmelegítőből, és hagyja állni 10 percig szobahőmérsékleten. Amíg a lemez lehűl, készítse el a címke munkaoldatot a címkeszonda 500 fm/ml-es hígításával címkehígítóban. A végső koncentrációnak 20 fm/50 ml-nek kell lennie.
    4. Mossa át a mikrosejteket kétszer az A mosással, majd pipettázzon 50 ml címke munkaoldatot minden egyes mélyedésbe. Inkubálja a mikrosejteket 15 percig 53 °C-on a Chiron lemezmelegítőben.
    5. Vegye ki a lemezt a Chiron lemezmelegítőből, és hagyja állni 10 percig szobahőmérsékleten. Ez idő alatt készítse el a 99,7% v/v LumiphosPlus-ból és 0,3% v/v 10% SDS-ből álló szubsztrátoldatot (például: 3 ml LumiphosPlus, 9 ml 10% SDS).
    6. Mossa át a mikrocellákat kétszer az A mosással, majd háromszor a B mosással. Adjon 50 ml szubsztrátoldatot minden lyukba.
    7. Mérje a kemilumineszcenciát a lemezt leolvasó luminométerben. (Ez magában foglalja a mikrosejtek 30 perces inkubálását 37°C-on a mérés előtt, hogy elérjük a steady-state kinetikát).

    Hibaelhárítás

    • A ligonukleotiddal módosított kutakat óvatosan kell kezelni. Ne bontsa szét a kútcsíkokat szegmensekre. Zárja le a kutakat biztonságosan friss lemezzáró anyaggal, hogy megakadályozza a párolgást az inkubációk során. Amikor az inkubációt követően eltávolítja a lemezzárót, ügyeljen arra, hogy ne húzza ki a mélyedéseket a mikrosejttartóból.
    • Az optimális mennyiségi meghatározás érdekében minden mintát, standardot és kontrollt két példányban kell vizsgálni. A semleges lipémiás vagy zavaros mintákat, mivel ezek nem egyértelmű eredményeket adhatnak.
    • Az optimális eredmények érdekében minden reagenset használat előtt a vizsgálati eljárásban megadott hőmérsékletre kell hozni. A reagens hozzáadása a mikrogödrökhöz úgy történjen, hogy a pipetta hegyét a gödör közepének közelében, a gödörben lévő folyadék felszíne felett érintse a falhoz.

    Alkalmazás

    A HIV-1 vagy hepatitis C vírussal (HCV) fertőzött betegek rutinszerű kezelésének részévé vált a vírus mennyiségi meghatározása vagy vírusterhelés vizsgálata. Jelenleg számos molekuláris technológia áll rendelkezésre a klinikai laboratóriumi környezetben történő felhasználásra. Ezek közül csak az elágazó DNS (bDNS) próbák rendelkeznek FDA-engedéllyel a HIV-1 és HCV vírusterhelés vizsgálatára. Ez a jelerősítési technológia hibridizációs reakciók sorozatára épül, amelyek nagymértékben alkalmasak a teljes automatizálásra, és így csökkentik az ilyen típusú elemzések elvégzéséhez szükséges munkaerőt.

    A nukleinsav-célmolekulák kimutatására szolgáló bDNS-technológiát alkalmazó molekuláris diagnosztikai tesztek érzékeny, specifikus és megbízható eszközök a vírusos és bakteriális fertőzések diagnosztizálásában és a betegség progressziójának nyomon követésében a terápia során. A bDNS-tesztek a kutatólaboratóriumi fejlesztési szakaszokból az Amerikai Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hivatal által jóváhagyott, értékes klinikai alkalmazásokkal rendelkező mennyiségi tesztekké fejlődtek. A bDNS-tesztek kevésbé munkaigényesek, mint számos molekuláris alapú eljárás, mivel kiválóan alkalmasak a teljes automatizálásra. A bDNS használatával nincs szükség a célszekvencia amplifikációjára, és így a bDNS-próbáknál kevésbé valószínű a túlzott amplikonok vagy az átvitel miatti keresztszennyeződés az ismétlődő minták között. Ezenkívül, mivel a bDNS egy jelerősítési technológia, a vizsgálat a teljes dinamikai tartományban kevesebb mint 0,5 log vagy 3-szoros variabilitással képes számszerűsíteni.

    A bDNS-technológia sokoldalúnak bizonyult, mivel a mikroorganizmusok széles skálája által okozott fertőzés kimutatására fejlesztettek ki módszereket, beleértve a Trypanosoma

    brucei parazitát, a citomegalovírust, az antibiotikum-érzékeny és antibiotikum-rezisztens Staphylococcus baktériumokat, a humán papillomavírust és a hepatitis B vírust. Az újabb erőfeszítések azonban a HIV-1 és a hepatitis C-vírus (HCV) RNS-ének mennyiségi meghatározására szolgáló bDNS-próbák kifejlesztésére összpontosítottak, ami a bDNS-módszerek rutinszerű alkalmazásához vezetett a klinikai molekuláris diagnosztikai laboratóriumokban. A bDNS-módszerek fejlődésének ismertetése során ez az áttekintés a HIV-1 és a HCV bDNS-próbáira helyezi a hangsúlyt.

    Első generációs HIV-1 bDNS-próbák

    Pontos, reprodukálható első generációs bDNS-próbákat fejlesztettek ki a HIV-1 RNS és a HCV RNS kimutatására emberi plazmában (Quantiplex HIV-1 vagy HCV RNS 1.0 assay, Bayer, Tarrytown, NY).9-11 A Quantiplex bDNS-próbáról szóló egyik első jelentésben a szeronegatív donoroktól származó plazmaminták felhasználásával az első generációs

    bDNS-próbával nem tapasztaltak reaktivitást, ami kiváló specificitásra utal.9-9 A bDNS-teszt pozitív eredményt mutatott 348 olyan beteg mintáinak 83%-ában, akik HIV-1 szeropozitívak voltak.9 A Quantiplex HIV-1 RNS 1.0 teszt segítségével végzett számszerűsítés dinamikus tartománya 104 (alsó kimutatási határ) és több mint 106 HIV RNS-kópia/ml között volt.9,11 A vírusterhelés 2-3-szoros változása statisztikailag szignifikáns volt a bDNS-teszt használatával, ami azt jelzi, hogy a Quantiplex HIV-1 RNS 1.0 teszt rendkívül pontos és reprodukálható.11 Ehhez képest az RT-PCR teszt legkorábbi változatainak használatával a vírusterhelés legalább 3,7-5,8-szoros változása volt szükséges ahhoz, hogy az eredmények statisztikailag szignifikánsak legyenek.11 Így a bDNS lett a választott módszer a vírusterhelés vizsgálatát és az új HIV-1 reverz transzkriptáz és proteáz inhibitorok klinikai hatékonyságát értékelő legtöbb klinikai vizsgálatban.

    A bDNS kimutatási módszer érzékenységét a második generációs HIV-1 tesztben (Quantiplex HIV-1 RNS 2.0 assay, Bayer) a cél- és befogadó szondák kialakításának megváltoztatásával és preamplifier oligonukleotidok hozzáadásával növelték. A cél- és befogadó szondák jobb kialakítása lehetővé tette a hibridizáció szigorúságának növelését, ezáltal csökkentve a teszt hátterét. Az előerősítők drámaian megnövelik a jelintenzitást, mivel minden egyes előerősítő molekula több régióval rendelkezik a sok bDNS-molekulához való hibridizációhoz. Ezenkívül minden egyes bDNS-molekula több, ismétlődő szekvenciával rendelkezik az AP-jelölt szondák hibridizációjához. A Quantiplex HIV-1 RNS 2.0 Assay használatával a jelkimenet linearitást mutatott körülbelül 500 kópia/ml és 1,6 × 106 kópia/ml között (a megadott dinamikus tartomány 500 és 8 × 105 kópia/ml között volt). A második generációs HIV-1 bDNS-teszt érzékenysége 20-szorosára nőtt az első generációs teszthez képest (az alsó kimutatási határ 500 kópia/ml, illetve 10 × 104 kópia/ml volt). A precizitás átfogó elemzése során összehasonlították a Quantiplex HIV-1 RNS 2.0 Assay kezdeti és ismételt teszteredményeit. A HIV-1 RNS 2.0 vizsgálat nagymértékben reprodukálhatónak bizonyult.14 Az 5000 kópia/ml-nél nagyobb vírustömegű 174 minta 96%-ában a kezdeti és az újratesztelési eredmények között 0,3 log10-nél kisebb eltérés volt a kópiaszámban. Az 500 és 5000 kópia/ml közötti vírusterhelésű 69 minta 86%-ánál a kezdeti és az ismételt vizsgálat eredményei között kevesebb mint 0,3 log10 különbség volt. Az 5 339 beteg közül azonban, akiket rutinszerű klinikai vizsgálat során vizsgáltak egyéves időközönként, a minták 41,6%-ában 500 kópia/ml-nél kisebb vírusterhelést figyeltek meg.

    Ezért a betegek jelentős részénél nagyobb érzékenységű (azaz <500 kópia/ml alsó kimutatási határral rendelkező) bDNS-tesztre volt szükség.

    A Quantiplex HIV-1 RNS 2.0 teszt és egy RT-PCR teszt (Amplicor HIV-1 Monitor 1.0 assay, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) teljesítményjellemzőit ismert HIV-1 víruskópiaszámmal rendelkező standard minták hígításai alapján hasonlították össze. Amikor ugyanazon standardok hígításait vizsgálták a 2 teszttel, a HIV-1 kópiaszámok általában magasabbak voltak az RT-PCR teszttel, mint a bDNS teszttel. Például az RNS-kópiaszámok tartománya 900 és 7,68 × 105 kópia/ml között volt a bDNS-vizsgálatban és 3360 és 1,88 × 106 kópia/ml között az RT-PCR-vizsgálatban. Mindkét vizsgálat lineáris volt a megadott dinamikai tartományokban.

    A HIV-1 kópiaszám vs. jelkimenet regressziós egyenesek meredekségének összehasonlítása azt sugallta, hogy a bDNS-tesztnek kisebb volt az arányos szisztematikus hibája. Az 1 650 HIV-1 kópia/ml standard mintát használva a bDNS-tesztnél kisebb volt a lefutások közötti variabilitás, mint az RT-PCR-tesztnél; a bDNS- és az RT-PCR-tesztek variációs együtthatója 24,3%, illetve 34,3% volt, ami azt jelzi, hogy a bDNS-teszt valamivel pontosabb volt ennél a HIV-1 RNS-kópiaszámnál. Az 1650 példány/ml-es standard alkalmazásával összehasonlítva a lefuttatások közötti variációs együtthatók magasabbak voltak a 165 HIV-1 RNS-kópiát/ml-t tartalmazó minta esetében (44,0% és 42.7% a bDNS- és az RT-PCR-vizsgálatok esetében). A vizsgálatok eredményei hasonlóak voltak, amikor a bDNS-teszt segítségével azonos HIV-1 kópiaszámokat hasonlítottak össze az A-tól F-ig terjedő HIV-altípusok között. Az RT-PCR ezen változatával azonban az A, E és F altípusokat kevésbé hatékonyan mutatták ki, mint a B, C és D altípusokat. A második generációs bDNS-teszt és a HIV-1 mennyiségi meghatározására szolgáló Amplicor Monitor RT-PCR-teszt közötti különbségek azt jelezték, hogy a diagnózis és a kezelés során minden egyes beteg esetében szükség van a vizsgálati módszer következetességére.

    HCV bDNS-tesztek

    A harmadik generációs HIV-1 bDNS-teszt továbbfejlesztése közben a Bayer felismerte, hogy szükség van egy olyan HCV vírusterhelés-teszt kifejlesztésére, amelynek klinikai hasznossága hasonló a HIV-1 vizsgálatéhoz. A HCV kimutatására az első generációs bDNS-teszt (Quantiplex HCV RNS 1.0 assay, Bayer) dinamikus számszerűsítési tartománya emberi plazmában 3,5 × 105 és 1,2 × 108 HCV RNS-kópia/ml között volt. Az 1-6. genotípust kimutatták ezzel a teszttel, bár az érzékenység alacsonyabb volt a 2. és 3. genotípus esetében (67%-os kimutatási arány: 89 olyan szérummintából 60 pozitív jel a 2. vagy 3. HCV-genotípust ismerten tartalmazó szérummintában), mint az 1. genotípus esetében (97%-os kimutatási arány: 69 olyan szérummintából 67 pozitív jel az 1. HCV-genotípust ismerten tartalmazó szérummintában). A Quantiplex HCV RNS 1.0 teszt és egy kutatólaboratórium által kifejlesztett HCV RT-PCR teszt összehasonlítása az RT-PCR teszt nagyobb érzékenységét mutatta, amelynek alsó kimutatási határa 2,5 × 104 HCV RNS kópia/ml volt. A HCV bDNS-teszt azonban nagyobb reprodukálhatósággal rendelkezett, és kevésbé volt időigényes, mint a laboratóriumban kifejlesztett HCV RT-PCR-teszt.

    A HCV 2. és 3. genotípusának kimutatási arányának javítása érdekében kifejlesztettek egy második generációs tesztet (Quantiplex HCV RNS 2.0 assay, Bayer).15 A második generációs HCV RNS-teszt fő tervezési változtatása az volt, hogy a HCV genomban olyan szekvenciákhoz használtak szondákat, amelyek a genotípusok között jobban konzerváltak. Ezek a konzervált régiók az 5′ nem transzlált szekvenciák és a HCV-genom core génjének szekvenciái voltak. A cél- és a befogadó szondák megváltoztatásának eredményeként a második generációs tesztben drámaian csökkent a HCV-genotípusok közötti kimutatási aránybeli eltérés. A 6 HCV-genotípus mindegyikének magas volt a kimutatási aránya, és jelentős javulás volt tapasztalható a 2. és 3. HCV-genotípus kimutatásában (a HCV 2.0 és HCV 1.0 tesztekben a 2. vagy 3. HCV-genotípust tartalmazó minták 93%-ának, illetve 67%-ának kimutatása). A második generációs bDNS-teszt érzékenysége is kissé javult a HCV 1.0-teszthez képest (a mennyiségi meghatározás alsó határa 2,0 × 105 vs. 3,5 × 105 ).

    Harmadik generációs bDNS-tesztek a HIV-1 és HCV kimutatására

    A bDNS-tesztek első és második generációjában az oligonukleotid-szondák nem célszekvenciákhoz való nem specifikus hibridizációja korlátozta a teszt érzékenységét. A harmadik generációs bDNS-tesztben (Quantiplex HIV-1 RNS 3.0 assay, Bayer) a nem természetes bázisok, az 5′-metil-2′-deoxi-izoizoguanozin (isoG) és az 5′-metil-2′-izodeoxicitidin (isoC) használata volt a bDNS-rendszer összes szondájának szintézisében, kivéve a célvírusnukleinsavnak a lemezfelületre történő rögzítését közvetítő befogási hosszabbítókat. Mivel az isoG-t és isoC-t tartalmazó oligonukleotidok a természetben nem fordulnak elő, a nemspecifikus hibridizáció jelentősen csökken. Így a nem természetes bázisokkal módosított szondák cél-RNS hiányában nem képeznek stabil hibrideket a befogadó szondával. A harmadik generációs teszt kezdeti leírásában a HIV-1 kimutatási határa 11 beteg plazmamintájában 50 kópia/ml volt, ami a második generációs teszthez képest 10-szeres javulást jelent a kimutatási határban. A magas aktivitású antiretrovirális kezelés során a HIV-1 vírusterhelés mind a 11 beteg esetében a kimutatási határ alá csökkent.

    A VERSANT HIV-1 RNS 3.0 próba dinamikai tartománya 75-5 × 105 HIV RNS-kópia/ml. A 3.0 változatot több más országban is jóváhagyták 50 kópia/ml-nek megfelelő alsó kimutatási határig. Amikor a második generációs HIV-1 bDNS-teszttel (Quantiplex 2.0 verzió) és az Amplicor Monitor 1.0 RT-PCR-teszttel összehasonlították az összehasonlított mintákat, a bDNS-teszttel következetesen alacsonyabb HIV-1 kópiaszámot kaptak. A harmadik generációs (3.0 verziójú) teszt és az Amplicor Monitor 1.5 RT-PCR teszt között azonban szoros mennyiségi korrelációt figyeltek meg a HIV-1 RNS kópiaszámok tekintetében.18 A 3.0 verziójú bDNS teszt és az Amplicor RT-PCR teszt vírusterhelési eredményei körülbelül 2-szer magasabbak voltak, mint a 2.0 verziójú teszté. A 3.0 verziójú bDNS-teszt és az RT-PCR-teszt mennyiségi szempontból hasonló eredményei fontosak a betegellátásban, mivel valószínűleg különböző módszereket fognak alkalmazni az ugyanattól a betegtől származó minták vizsgálatakor az anti-HIV terápiák során. A legújabb adatok azt sugallják, hogy az RT-PCR teszttel vizsgált betegek esetében nem feltétlenül szükséges az újbóli báziskiválasztás.

    A HIV-1 3.0 verziójú bDNS-teszthez hasonlóan a HCV harmadik generációs bDNS-tesztje is isoC- és isoG-szubsztituált oligonukleotidokat használt a nemspecifikus hibridizáció csökkentése érdekében. Az isoC- és isoG-szubsztituált oligonukleotidok használata körülbelül 62-szeresére növelte a vizsgálat érzékenységét. A HCV RNS 3.0 assay alsó kimutatási határa 3,2 × 103 kópia/ml volt, szemben a HCV RNS 2.0 assay 2 × 105 kópiájával/ml. A HCV RNS 3.0 teszt dinamikus lineáris mennyiségi meghatározási tartománya 3,2 × 103 kópiától/ml (615 NE/ml) 4 × 107 HCV RNS-kópiáig/ml (7,7 × 106 NE/ml) terjedt. A HCV RNS 3.0 vizsgálat magas specificitással rendelkezett (98,2%), és a második generációs vizsgálathoz hasonlóan a HCV RNS mennyiségi meghatározásában minden genotípus esetében egyformán hatékony volt. Az ismétlődő minták futásközi és futáson belüli standard eltérése 0,2 log10, illetve 0,14 log10 volt, ami azt jelzi, hogy a harmadik generációs teszt nagymértékben reprodukálható.

    A HCV szérumban történő kiirtása mellett a HCV-ellenes terápiák fontos célja a HCV-szint csökkentése a májban. A HCV RNS 3.0 assay hasznosságát a HCV RNS kimutatására és mennyiségi meghatározására májbiopsziás mintákban 25 HCV-vel és HIV-vel koinfektált betegnél vizsgálták.20 A harmadik generációs HCV bDNS assay reprodukálhatósága hasonló volt a májbiopsziás minták és a szérumminták között. Emellett a HCV RNS kimutatása az 1., 3. és 4. genotípussal fertőzött betegek májmintáiban a HCV RNS 3.0 próbával rendkívül specifikus és érzékeny volt. Ebben a 25 betegen végzett vizsgálatban az intrahepatikus

    HCV magas kezelés előtti szintje korrelált a HCV-ellenes terápiára való válasz alacsony gyakoriságával. A kezelés előtti intrahepatikus HCV-szintek a HCV 1-es genotípusával fertőzött betegeknél voltak a legmagasabbak. A vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy a HCV-betegség progressziójának fontos markerei, a HCV-szintek a májban és a szérumban megbízhatóan számszerűsíthetők bDNS-elemzéssel a kezelés során. A harmadik generációs bDNS-próbák módszerei magukban foglalják a minta előkészítését, a hibridizációt és a HIV-1 RNS és a HCV RNS jelének kimutatását. Mind a 3 s eps a System 340 platform mikrocelláiban történik a HCV RNS 3.0 vizsgálathoz, amely nem igényel külön extrakciós lépést. A 3.0 verziójú HIV-1 RNS-vizsgálatnál a mintaelőkészítés eltér a HCV RNS-módszertől, és a System 340 platformon kívül történik. Egy nemrégiben készült tanulmány a 3.0 verziójú HIV-1 RNS-módszer adaptációját értékelte, amelyben a HIV-1 mintafeldolgozási lépést úgy módosították, hogy az lehetővé tegye a HCV és a HIV-1 egyidejű vizsgálatát a System 340 platformon. A HIV-1 módszert úgy módosították, hogy kihagyták a víruslízishez szükséges 2 órás 63 °C-on történő inkubációt. Ehelyett a HIV-1 és HCV lízist a System 340 platformon végezték. A HCV bDNS vizsgálati módszerek nem változtak a kombinált vizsgálatban. A kombinált bDNS-módszer specificitása és mennyiségi meghatározása az egyes HIV-1 és HCV-tesztekre vonatkozó előírásokon belül volt. A HIV-1 és a HCV egyidejű vizsgálata javította a munkafolyamatokat a klinikai laboratóriumban, és alacsonyabb költségeket eredményezett. Mivel a HIV-1 RNS és a HCV RNS kimutatása és mennyiségi meghatározása kulcsfontosságú a diagnózis és a terápiára adott válaszok értékelése szempontjából, a két vírus egyidejű vizsgálatának lehetősége jelentős előrelépést jelent a molekuláris diagnosztikában.