Frontiers in Bioengineeringand Biotechnology

Bevezetés

A szérumalbuminok a biodiagnosztikában és a bio-felület kutatásában modellként gyakran használt fehérjék (Rosi és Mirkin, 2005; Singh et al., 2005; Arcot et al., 2015). Ezek közül a szarvasmarha-szérumalbumin (BSA) a legolcsóbb és az ELISA-tesztekben széles körben használt blokkolóanyagként használt fehérje (Maingonnat et al., 1999). A papírdiagnosztikában a BSA (Huang et al., 2018) szelektíven növeli a papír hidrofobicitását a biofolyadékok és az elúció áramlásának javítása érdekében a folyadékfelvétel csökkentésével. A BSA védi és növeli a papírra szárított funkcionális biomolekulák élettartamát. A BSA-val kezelt felületeken szárított immunglobin G és immunglobin M funkcionalitása és élettartama nagyságrendekkel nőhet (van Remoortere et al., 2001). A BSA megakadályozza az analitfehérjék nem specifikus adszorpcióját is a kvantitatív elemzéshez.

A BSA molekulák szorpciós jelenségéről különböző határfelületeken, például arany (Dennison et al., 2017), csillám (Fitzpatrick et al., 1992), szilícium (Jachimska et al., 2016; Givens et al., 2017) és cellulóz (Mohan et al., 2014; Lombardo et al., 2017), több cikk is részletesen beszámolt. Az adszorbeált BSA molekula konformációját és a kialakult réteg topológiáját erősen befolyásolja a pH, az ionerősség és a hőmérséklet. A BSA molekulák megőrzik natív szerkezetüket pH 4,0 és 8,0 között. A pH 4,0 alatt és 8,0 felett a BSA molekulák megváltoztatják hajtogatott konformációjukat, amely eltér a natív szerkezetüktől (Su et al., 1998a; Barbosa et al., 2010; Phan et al., 2015). A BSA izoelektromos pontja pH 4,5-nél van. Ennél a pH-nál a nettó felületi töltés nulla lesz, és a BSA molekulák aggregálódnak. A pH növelése növeli a BSA töltését, és a domináns elektrosztatikus taszítás stabilizálja a BSA molekulákat és megakadályozza az aggregációt (Li et al., 2008).

Mégis annak ellenére, hogy a legtöbbet vizsgált fehérjék közé tartozik, több kérdés is felmerül azzal kapcsolatban, hogy a pH és az ionerősség milyen hatással van a BSA konformációjára az adszorpció során. Ebben az összefüggésben a felületi fedettség fogalma, amelyet kizárólag a felületi frakció vagy a tömegsűrűség határoz meg, nem egyértelmű. Szükség van a BSA szilárd-folyadék határfelületet meghatározó változók jobb megértésére, hogy robusztus biodiagnosztikai eszközöket tervezhessünk.

A szarvasmarha szérumalbumin molekulák egy nanométeres vastagságú réteget alkotva adszorbeálódnak egy határfelületen. Néhány jellemzési módszer, mint például a reflektivitás (Su et al., 1998b, 2016; Raghuwanshi et al., 2017a, b), az ellipszométer, az atomerő-mikroszkóp (AFM), a felületi plazmon-rezonancia (SPR) és a kvarckristály-mikromérleg disszipációval (QCM-D) képes mérni az adszorbeált fehérjeréteg vastagságát a szükséges nanométeres skálán. Különösen a QCM-D képes kinetikusan nyomon követni a biomolekulák szorpciós folyamatát a határfelületen adszorbeált fehérje tömegének nanogrammban történő mérésével (Kristensen és mtsai., 2013; Luan és mtsai., 2017). A QCM-D lehetővé teszi a hőmérséklet, az ionerősség és a pH-környezet szabályozását. A QCM disszipációs módja feltárja az adszorbeált fehérje rétegek merevségét.

Ebben a tanulmányban az arany-só határfelületen adszorbeált BSA molekulák reverzibilis pH-ra reagáló viselkedését írjuk le. Az adszorbeált BSA-réteg pH-érzékeny szivacsként viselkedik, ahol a vízmolekulák a környező pH 4 és 8 közötti értékétől függően adszorbeálódnak és deszorbálódnak. Ez a munka nyomon követi és számszerűsíti a vízszorpció jelenségét a BSA szivacsszerű rétegben, és megvilágítja a különböző pH-értékek és ionerősség mellett lejátszódó mechanizmusokat. Célunk a BSA fedettség leírása a szilárd-folyadék határfelületen a molekulák száma és a réteg súlya/vastagsága alapján. Ezzel tisztázzuk a biomolekula felületi fedettség fogalmát, és megvilágítjuk az adszorbeált BSA molekulák dinamikus viselkedését a biodiagnosztika összefüggésében.

Az anyagok és kísérletek

Az anyagok

A szarvasmarha szérumalbumin liofilizált por (97%) és nátrium-klorid (NaCl) só (99,5%) a Sigma Aldrich-tól (Castle Hill, NSW, Ausztrália) vásároltuk. A sósavat (HCl) és a nátrium-hidroxidot (NaOH) a Merck Kft. Minden vegyszer analitikai minőségű, és tisztítás nélkül került felhasználásra.

QCM-D mérések

Kvarckristályos mikrobalance disszipációs méréseket végeztünk a Biolin Scientific Ltd. E4-QCM-D műszerén. Aranybevonatú kvarckristály szenzorokat használtunk, miután 15 percig H2O2:NH3:H2O (1:5:5) oldatban tisztítottuk, majd 10 percig UV-Ozon tisztítás következett.

Az aranyszenzorokat folyadékcellás modulokba helyeztük. A sóoldatban (0,9% NaCl) 1 mg/ml BSA-t oldottunk fel, és az oldat pH-ját pH 7,0 és 4,5 értékre állítottuk be. Külön állítottuk be a sóoldat pH-ját 7,0-ra és 4,5-re. Az elkészített oldatokat perisztaltikus szivattyúval juttattuk át a folyadékcellás modulokon. A kvarcérzékelő rezonanciafrekvenciájának (F) és disszipációjának (D) változásait az 5 MHz-es alapfrekvenciához és hat különböző páratlan felhanghoz (1, 3, 5, 7, 9 és 13) viszonyítva egyidejűleg figyeltük.

Először egy sóoldatot pumpáltunk a folyadékcellába, és hagytuk, hogy egyensúlyba kerüljön, hogy stabil alapvonalat hozzunk létre. Ezt követően BSA sóoldatban lévő BSA-t juttattunk át a cellán, és lehetővé tettük, hogy a BSA molekulák adszorbeálódjanak az arany határfelületen. Ezután sóoldatot pumpáltunk, hogy eltávolítsuk a meg nem kötött BSA-molekulákat. A különböző pH-jú sóoldatok és a víz öblítési ciklusai ezután a következők voltak:

A rezonanciafrekvencia ΔF és a disszipáció ΔD kapott változásait a Sauerbrey-modellel illesztettük a Dfind szoftver segítségével.

DLS mérések

A dinamikus fényszórást (DLS) a sóoldatban diszpergált BSA-n különböző pH-n (4,5 és 7,0) DLS részecskeméret-elemző készülékkel (Brookhaven Nanobrook Omni) mértük. Egy 40 mW-os (640 nm) hőmérséklet-szabályozott vörös félvezető lézerforrást használtunk. A méréseket háromszor végeztük el és átlagoltuk. Minden mérést szobahőmérsékleten (22°C) végeztünk.

Kontakt-szög mérések

Az arany és az arany határfelületen különböző pH-n adszorbeált BSA érintkezési szögét egy OCA 35 DataPhysics Instruments GmbH (Németország) berendezéssel mértük. A méréseket közvetlenül a mérés után a QCM beállításból kivett érzékelőfelületen végeztük. Minden mérést szobahőmérsékleten (22°C) végeztünk. A szenzor felületén legalább öt érintkezési szög mérést végeztünk és átlagoltunk.

Atomikus erő mikroszkópos (AFM)

Az atomerő mikroszkópos méréseket csapoló üzemmódban végeztük egy JPK Nanowizard III AFM készülékkel. A képalkotáshoz kiválasztott konzolok (AC160TS-R3) névleges frekvenciája 300 kHz, rugóállandója 26 N/m volt. A képalkotást a csupasz arany határfelületen és az adszorbeált BSA-rétegen végeztük pH 4,5 mellett az arany határfelületen. A képeket közvetlenül a mérés után a QCM-berendezésből kivett érzékelőfelületen készítettük. Minden mérést szobahőmérsékleten (22°C) végeztünk.

Eredmények

A szilárd-folyadék határfelületen adszorbeált BSA molekulák reverzibilis pH-ra reagáló vízszorpciós jelenségét vizsgáltuk QCM-D-vel, 7,0 és 4,5 pH-jú sóoldat öblítési ciklusokkal. Az aranyat választottuk szilárd határfelületnek, mivel hidrofóbsága irányítja a BSA adszorpcióját (Lori és Hanawa, 2004; Phan és mtsai., 2015; Ozboyaci és mtsai., 2016). A különböző pH-értékeken adszorbeált BSA-rétegeket váltakozó ciklusokban 4,5 és 7,0 pH-jú sóoldatokkal öblítettük. Ezenkívül tiszta Milli-Q vízzel történő öblítést is végeztünk, hogy értékeljük az ionerősség hatását az adszorbeált BSA-rétegre.

Az 1. ábra (fent) a 7,0 pH-n adszorbeált BSA-molekulák frekvenciaváltozását (F5 és F7) mutatja a BSA/sóoldatból 7,0 pH-n adszorbeált BSA-molekulák esetében, majd az eredeti sóoldattal (pH 7) történő öblítést követően. A következő öblítési ciklust a 4,5 pH-jú sóoldattal végeztük. Ezután 4,5 és 7 pH-jú sóoldatok váltakozó ciklusai következnek.

Az 1. ábrán a kezdeti stabil alapvonal után az F hirtelen csökkenése volt megfigyelhető, ami a BSA molekulák adszorpciójára utal az arany-folyadék határfelületen. Az F ΔF = -35,5-ig csökkent, majd stabilizálódott. Sós oldattal (pH 7) történő öblítéskor az F értéke ΔF = -35,5 értékről ΔF = -34,0 értékre nőtt, ami a nem adszorbeált BSA molekulák eltávolítását mutatja a felületről. A sóoldattal (pH 4,5) történő öblítést követően az F tovább nőtt ΔF = -30,0-ra, ami az érzékelő felületéről történő további tömeglebomlásról árulkodik. Meglepő módon a későbbi sóoldatos (pH 7,0) öblítési ciklusok az F-et ΔF = -34,0-ra csökkentették, ami a BSA-rétegben lévő vízmolekulák felszívódása miatt tömegnövekedést jelent az érzékelő felületén. A későbbi sóoldatos öblítési ciklusok ugyanezt a ciklikus tömegváltozást követik az arany határfelületen.

A második kísérletben az első kísérlethez hasonlóan a BSA molekulák 4,5 pH-n történő adszorpcióját sóoldatos öblítési ciklusok követték különböző pH-n (1. ábra: alul). Az adszorbeált BSA molekulák megfelelnek az F csökkenésének ΔF = -38,5-re. A sóoldattal történő öblítés (pH 4,5) eltávolítja a nem adszorbeált BSA-t (ΔF = -38,0).

A sóoldattal történő öblítést (pH 7,0) követően tovább nő a réteg tömege az aranyfelületen, ami megfelel az F csökkenésének ΔF = -43-ra. A tömegnövekedés a BSA-rétegben lévő vízmolekulák abszorpciójának köszönhető. Később a sóoldatos (pH 4,5) öblítés deszorbálja a vízmolekulákat és visszaállítja az F értéket ΔF = -37-re. Minden egyes öblítési ciklus ugyanannyi vízmolekulát adszorbeál és deszorpcióz.

Az ionerősség hatását az adszorbeált BSA-rétegre ugyanebben a kísérletben a réteg tiszta vízzel történő öblítésével vizsgáltuk. Az 1. ábra mutatja a BSA adszorpciót pH 7,0 és 4,5 mellett, majd a különböző pH-jú sóoldattal és tiszta Milli-Q vízzel történő öblítési ciklusokat.

A vízzel történő öblítés mindkét esetben növeli a ΔF = -29,2 (pH 4,5-nél adszorbeált BSA) és -26,5 (pH 7,0-nál adszorbeált BSA) értékét. Ez azt jelzi, hogy a vízzel való öblítés tovább csökkenti a tömeget, ami a vízmolekulák további deszorpciójának felel meg a határfelületről. Minden egyes öblítési ciklus fenntartja ugyanazt a viselkedést a tömegváltozásban, ami a BSA-rétegben történő vízszorpciónak köszönhető.

Érdekes, hogy minden kísérletben a 4,5 és 7,0 pH-nál váltakozó sóoldatos öblítési ciklusok a vízmolekulák reverzibilis szorpcióját mutatják az adszorbeált BSA-rétegen belül. A BSA-réteg sóoldattal történő öblítése pH 7,0-nál vízmolekulákat adszorbeál a BSA-réteg szerkezetén belül, ami növeli a szilárd-folyadék határfelület tömegét. Ezzel szemben a BSA-réteg 4,5 pH-értékű sóoldattal történő öblítése vízmolekulákat deszorbál a BSA-rétegből, ami csökkenti a határfelület tömegét. A mért teljesen reverzibilis vízszorpció azt jelzi, hogy a BSA molekulák az öblítés során nem deszorpcióznak, és felületi fedettségük azonos marad; csak a vízmolekulák száma változik a köztes fázisban.

A vízszorpciós jelenség sóoldatos öblítéskor (különböző pH-n) csak az adszorbeált BSA réteg miatt következik be, és ezt egy külön sóoldatos öblítési kísérlet is megerősíti a csupasz aranyszenzoron (S1 kiegészítő anyag). A csupasz aranyszenzor frekvenciáján stabil alapvonalat tart fenn a sóoldat (pH 4,5-nél). Ezt követően az aranyfelületet alternatív, 7,0 és 4,5 pH-jú sóoldatos öblítési ciklussal öblítettük (Kiegészítő anyag S1). Az eredmények egyértelműen azt mutatják, hogy az alternatív sóoldatos öblítés különböző pH-n nincs hatással az aranyérzékelő frekvenciájára. Ezért csak az aranyon adszorbeált BSA-réteg mutatja a frekvencia változását a különböző pH-értékeken végzett sóoldatos öblítési ciklusok hatására.

Az adszorbeált tömeg, a felületi fedettség és az adszorbeált BSA-réteg vastagsága a Sauerbrey-modell QCM-adatokra való illesztésével nyerhető ki. A modell egy merev réteg illesztésére szolgál, ahol a disszipáció értéke kisebb, mint 2, ahogyan azt minden kísérletünkben megfigyeltük (S2 kiegészítő anyag). A Sauerbrey-egyenlet a következő: Δm=-CΔfn, ahol C = 17,7 ng/Hz.cm2 állandó az 5 MHz-es aranybevonatú kvarckristályra, n a felhang, Δm az adszorbeált tömeg és Δf a frekvenciaváltozás.

A BSA-molekulák 6,3 mg/m2 tömegborításig (5,6 nm vastagság) adszorbeálódtak 7,0 pH-n (2A ábra). Az előadszorbeált BSA-réteg öblítése sóoldattal (pH 4,5) 5,6 mg/m2 -re csökkentette a tömegborítást és 4,9 nm-re a vastagságot (1. táblázat), ami a vízmolekulák felszabadulásának köszönhető az adszorbeált BSA-réteg szerkezetéből. További öblítés sóoldattal (pH 7,0-nál) ugyanolyan mennyiségben adszorbeálja újra a vízmolekulákat. A tömegváltozás különbsége Δm = 0,7 mg/m2.

A 2B. ábrához hasonlóan az előadszorbeált BSA-réteg pH 4,5 mellett sóoldattal való öblítése (pH 7,0) 6,4 mg/m2-ről 7,4 mg/m2-re növeli az adszorbeált tömeget és 6,2-ről 6,9 nm-re a vastagságot; ez a vízmolekulák BSA-rétegben való elnyelésének köszönhető. A sóoldatos öblítési ciklus különböző pH-értékek mellett megtartotta a Δm = 1,0 mg/m2 tömegváltozási különbséget, ami 1,4-szer nagyobb, mint a pH 7,0-nál (0,7 mg/m2).

A sóoldatos öblítési ciklus során a BSA-rétegben adszorbeált/deszorpcióban lévő vízmolekulák átlagos számát a különböző pH-értékek mellett adszorbeált tömegek különbségéből számoltuk ki (S3 kiegészítő anyag). A 4,5 pH-n adszorbeált BSA-réteg 3,3 × 1019 vízmolekulát adszorbeál/deszszorbeál az öblítési ciklusok során, ami 570 vízmolekulát/BSA-molekulát jelent (1. táblázat). A pH 7,0-nál adszorbeált BSA-réteg azonban 2,3 × 1019 vízmolekulát, azaz 450 vízmolekulát/BSA-molekulát adszorbeál/deszszorbeál a reverzibilis sóoldatos öblítési ciklus során.

A dinamikus fényszórás (DLS) mérések tisztázzák a BSA aggregált és nem aggregált állapotát sóoldatban pH 4,5 és pH 7,0 mellett (3. ábra). pH 4,5-nél a DLS kimutatja, hogy a BSA molekulák aggregálódnak és többféle méreteloszlást mutatnak: 5 nm, 10 nm, 20 nm és 50 nm. Azonban pH 7,0-nál a BSA molekulák az elektrosztatikus taszítás miatt nem aggregálódnak, és 5 és 10 nm-es méreteloszlással rendelkeznek. A hidratált BSA 5 és 10 nm-es mérete összehasonlítható az egyedi BSA molekulák méretével és alakjával (14 nm × 4 nm × 4 nm) (Anderegg és mtsai., 1955; Wright és Thompson, 1975).

Az atomerő-mikroszkópos felvételek megerősítik a BSA molekula adszorpcióját az arany határfelületen (4. ábra). Ezek a képek a csupasz arany (4a,b ábra) és az arany határfelületen adszorbeált BSA molekula felületi morfológiájának különbségeit mutatják pH 4,5 mellett (4c,d ábra). A csupasz arany (4b. ábra) és a BSA-abszorbeált felület (4d. ábra) kinagyított képeinek összehasonlításakor a felületek közötti különbségek szembetűnőek. Bár mindkét felületet részecskék alkotják, a meghatározás és így a leképezett anyag is eltérő. A csupasz aranyfelület részecskéi határozottabbak (pl. élesebbek az alakzatok közötti határok), ami keményebb anyagra utal a BSA-val bevont felülethez képest. A BSA-val bevont arany további BSA-molekulák aggregátumainak jelenlétét mutatja. A BSA-val bevont arany nagyított AFM-felvételén (4d. ábra) látható, hogy az aggregált BSA-molekulák oldalirányú mérete 30 és 100 nm között változik, magasságuk 5-15 nm között van.

A nedvesíthetőség tisztázása érdekében megmértük a vízcseppek által két felületen: arany és aranyra adszorbeált BSA által képzett érintkezési szöget (5. ábra). Az aranyérzékelő 66°-os érintkezési szöggel hidrofil. A pH 4,5-nél adszorbeált BSA-réteg azonban hidrofilebbé válik, mivel a víz érintkezési szöge 60°-ra csökkent, ami tovább csökkent 55°-ra a pH 7,0-nál adszorbeált BSA-réteg esetében. Hasonló megfigyelésről számoltak be a szilíciumfelületre adszorbeált BSA-rétegek esetében, amikor a vízzel való érintkezési szög 57°-ról (pH 4,5-nél) 54°-ra (pH 7,0-nál) csökkent (Jachimska et al., 2016). A különböző pH-n adszorbeált BSA esetében a kontakt szög és a rétegvastagság változása strukturális és topográfiai különbségekre utal az arany határfelületen történő adszorpciós folyamat során.

Diszkusszió

A BSA izoelektromos pontja pH 4,5-4,8 között van; ez az a pH, ahol a molekula nettó töltése nullává válik. Az izoelektromos pont közelében a BSA molekulák között kisebb a molekulák közötti elektrosztatikus taszítás. A sóoldat nagy ionerőssége (0,15 M) szintén szerepet játszik a töltések szűrésében és az elektrosztatikus kölcsönhatások akadályozásában. Ezért a BSA-molekulák aggregálódnak a BSA-sóoldatos szuszpenzióban. A DLS-mérések (3A. ábra) megerősítik az akár 60 nm méretű BSA-aggregátumok jelenlétét a BSA/sóoldatos szuszpenzióban pH 4,5-nél.

A BSA adszorpciója során (pH 4,5-nél) az arany határfelületen nem várható a BSA elektrosztatikus vonzása az arany határfelület felé. A globuláris BSA fehérje gyenge pozitív töltése azonban elegendő sodrást biztosíthat a határfelületen történő adszorpcióhoz (Su és mtsai., 1998a; Jachimska és mtsai., 2016). Korábban több cikk is beszámolt arról, hogy a BSA és hasonló fehérjék adszorpcióját az izoelektromos pont közelében az elektrosztatikus kölcsönhatásokat felülmúló hidrofób kölcsönhatások hajtják (Uyen et al., 1990; Tilton et al., 1991; Figueira és Jones, 2008; Norde, 2008; Jeyachandran et al., 2009; Rabe et al., 2011; Huang et al., 2017; Xu et al., 2018; Attwood et al., 2019). A kontakt szög mérések (5. ábra) azt mutatják, hogy a csupasz arany határfelület kevésbé hidrofób, és az albumin hidrofób kölcsönhatásokon keresztül kötődik az aranyhoz (Norde és Giacomelli, 2000; Figueira és Jones, 2008). Mivel a BSA molekulák közötti taszítások kiszűrődnek, a hidratált BSA molekulák nagy mennyiségben (6,4 mg/m2 ) aggregátumokként és több érintkezési ponttal adszorbeálódnak az arany határfelületre (6A ábra). Az AFM-kép (4c,d ábra) megerősíti a BSA-molekulák adszorpcióját és aggregációját az arany határfelületen. Az AFM-felvételek azt mutatják, hogy az aggregátumok oldalirányú mérete 30 és 100 nm között mozog, magasságuk 5 és 15 nm között oszlik meg. Ez megerősíti, hogy a BSA molekulák az álló és a lapos konformáció kombinációjaként adszorbeálódtak.

A pH 7,0-nál a BSA-molekulák negatív töltésűek. Ez elektrosztatikus taszítást hoz létre a BSA-molekulák között, ami akadályozza a BSA agglomerálódását az oldatban. A DLS mérések az 5 és 10 nm méretű, nem aggregált BSA molekulák eloszlását mutatják (3B ábra). Ezek a méretek összehasonlíthatók az egyedi BSA-molekulák méreteivel (14 nm × 4 nm × 4 nm) (Anderegg és mtsai., 1955; Wright és Thompson, 1975). A BSA aranyon történő adszorpciója során az elektrosztatikus taszítás és a hidrofób kölcsönhatások kombinációja egy BSA-réteget képez a határfelületen. Az adszorbeált BSA-molekulák közötti erős laterális molekulák közötti taszítás csökkenti a BSA adszorpciós kapacitását (5,6 mg/m2 ) a határfelületen. Ezért a BSA molekulák egyedi molekulákként (nem aggregátumokként) adszorbeálódnak és monoréteget képeznek az arany határfelületen (6A ábra).

A QCM-D kísérletekben (1. ábra) az előhidratált BSA molekulák adszorbeálódnak a határfelületen. A különböző pH-jú alternatív sóoldatos öblítés hatására a BSA-réteg tovább adszorbeál/deszorbál vízmolekulákat. A 4,5 pH-n adszorbeált BSA több vízmolekulát (1,0 mg/m2) vesz fel és bocsát ki, mint a 7,0 pH-n adszorbeált BSA-molekulák (0,7 mg/m2). Ennek oka, hogy a pH 4,5-nél adszorbeált BSA mennyisége (6,4 mg/m2) nagyobb, mint a pH 7,0-nál (5,6 mg/m2).

Az aranyérzékelő teljes felületi fedettségéhez adszorbeált BSA-molekulák számított száraz (nem hidratált) tömege körülbelül 2 mg/m2 (S3 kiegészítő anyag). A számított száraz tömeg összehasonlítható a közölt irodalmi adatokkal (Jachimska et al., 2016). Amikor a száraz BSA molekula hidratálódik, hidrofil csoportjai gyorsan kötődnek a vízhez. A kötődés a víz dipoláris szerkezetének köszönhető, amely kölcsönhatásba lép a BSA poláris csoportjaival. A hidratált BSA-ban egyes vízmolekulák szilárdan kötődnek, míg más vízmolekulák lazán kötődnek, vagy egyszerűen a BSA hurokszerkezete közé szorulnak. A BSA-réteget hidratáló víz mennyisége növeli az adszorbeált tömeghányadot a határfelületen. A sóoldatos öblítési ciklusban a különböző pH-értékek a töltések újraeloszlásához vezetnek az adszorbeált BSA-rétegen. Ez a töltésátrendeződés gradienst hoz létre az adszorbeált BSA-réteg és az ömlesztett oldat között. A gradiens hajtóerőként hat a lazán kötött vízmolekuláknak a BSA-rétegből történő csapdázására és felszabadítására.

A BSA-réteg vastagságát a Sauerbrey-modellnek a QCM-D adatokra való illesztésével értékeltük (2. ábra). A 4,5 pH-n adszorbeált és sóoldattal (pH 7,0) öblített hidratált BSA-réteg a nagyobb, 6,9 nm-es vastagságot adja (6B ábra). A nagy mennyiségű adszorbeált BSA-molekula (6,4 mg/m2 ) sok vízmolekulát von be, ami megduzzasztja a BSA-réteget. Ugyanennek a rétegnek a sóoldattal (pH 4,5) történő öblítése 6,4 nm-re csökkenti a rétegvastagságot, ami a vízmolekulák rétegből való felszabadulásának köszönhető. Hasonló jelenség figyelhető meg a pH 7,0-nál adszorbeált BSA molekulák esetében is. A BSA-réteg vastagsága azonban vékonyabb, mint a pH 4,5-nél adszorbeált BSA-réteg esetében (6B ábra).

Továbbá az adszorbeált BSA-réteg mindkét pH-értéknél merev marad és visszafordíthatatlanul rögzül a sóoldatos öblítési ciklusok során. A pH-változás során csak a vízmolekulák szorpciója következik be. Az adszorbeált BSA merevsége és irreverzibilitása a BSA nagy méretének és nagy molekulatömegének köszönhető. A BSA molekula elektrosztatikus és hidrofób kölcsönhatások révén számos érintkezési pontot képez az arany-folyadék határfelületen, amelyek megakadályozzák a BSA molekulák deszorpcióját a határfelületről.

A BSA réteg még az oldat ionerősségének változásakor (deionizált vízzel történő öblítés) sem válik le az arany határfelületről. A vizes öblítés csak több vízmolekulát deszorbál a BSA-rétegből, és a szenzor felületén lévő tömeg tovább csökken (2. ábra). A hidratált BSA ionerősségének tiszta vízzel történő változtatása több vízmolekulát szabadít fel a rétegből. A BSA-réteg 4,8 nm vastagságúra zsugorodik (4,5 pH-n történő adszorpció esetén) és 4,3 nm vastagságúra (7,0 pH-n történő adszorpció esetén), amint az a 6B. ábrán látható. A további sóoldatos öblítési ciklusok ugyanezt a reverzibilis vízszorpciós jelenséget eredményezik.

Következtetés

A szarvasmarha szérum albumin sóoldatban (0,9% NaCl) adszorbeálódott az arany-folyadék határfelületen pH 7,0 és 4,5 mellett. A dinamikus folyamatot QCM-D-vel mértük és AFM, DLS és kontakt szög mérésekkel igazoltuk. Az adszorbeált BSA-réteg esetében reverzibilis, gyors és pH-függő vízszorpciós jelenséget figyeltünk meg sóoldattal történő öblítési ciklusok elvégzésével 4,5 és 7,0 pH-nál. A vízmolekulák pH 7,0-nál hidratálják a BSA-réteget, pH 4,5-nél pedig dehidratálják azt. A 4,5 pH-n adszorbeált BSA-réteget 1,4-szer több vízmolekula hidratálja, mint a 7,0 pH-n adszorbeált BSA-réteget. Ezt a jelenséget a különböző pH-n adszorbeált BSA molekulák által felvett eltérő konformációkkal magyarázzák. Az izoelektromos pont közelében, pH 4,5-nél a BSA molekulák semlegesednek és nagy mennyiségben aggregátumként adszorbeálódnak: 6,4 mg/m2 . A pH 7,0-nál a BSA-molekulák feltöltődnek (elektrosztatikus taszítás) és egyedi molekulákból álló rétegként adszorbeálódnak: 5,6 mg/m2. Az aggregált BSA molekulák rétege (pH 4,5-nél), amely az arany határfelületen adszorbeálódik, több vízmolekulát (570 vízmolekula/BSA) tart vissza, mint az egyedi BSA molekulák rétege (pH 7,0-nál), amely 450 vízmolekulát/BSA-t tart vissza. Az ionerősség megváltoztatása a BSA-réteg tiszta vízzel történő öblítésével csak több vizet deszorbál az adszorbeált rétegszerkezetből. A BSA-réteg minden esetben merev és irreverzibilisen adszorbeálódik az arany határfelületre, és az öblítési ciklus során csak a vízmolekulák adszorbeálódnak/deszorbálódnak. A megfigyelt jelenség fontos az alapvető megértéshez, valamint új biodiagnosztikai eszközök és robusztus szenzorok tervezéséhez.

Adatok hozzáférhetőségi nyilatkozata

A cikk következtetéseit alátámasztó nyers adatokat a szerzők indokolatlan fenntartás nélkül bármely jogosult kutató rendelkezésére bocsátják.

A szerzők hozzájárulása

VR, CB és BY végezte a kísérleteket. VR és GG végezték az adatelemzést és írták a kéziratot.

Finanszírozás

Ezt a munkát az Australian Research Council (ARC), az Australian paper, a Norske Skog, az Orora és a Visy támogatta az Industry Transformation Research Hub IH170100020 támogatásán keresztül.

Érdekütközés

A szerzők kijelentik, hogy a kutatást olyan kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolatok hiányában végezték, amelyek potenciális összeférhetetlenségként értelmezhetők.

Kiegészítő anyagok

.