Frontiers in Cellularand Infection Microbiology

Introduction

A Bacteroides fragilis, amely az ember és a haszonállatok gyomor-bélflórájában található, egy anaerob baktérium. Az egyik kiemelkedő humán komensál és az egyik leggyakrabban izolált Bacteroides a klinikai mintákból, amely hasmenést, hashártyagyulladást, intraabdominális tályogokat, szepszist és endogén gennyes fertőzéseket okoz (Sears et al., 1995, 2014).

Kimutatták, hogy a B. fragilis megelőzi a bélrendszeri gyulladásos betegségeket vastagbélgyulladásban szenvedő állatokban az immunmoduláló molekula poliszacharid A (PSA) termelésének köszönhetően, amely gyulladásellenes immunválaszt indukál a bélszövetben (Mazmanian et al., 2008; Lee et al., 2018). A B. fragilis patogenitása több tényezőnek köszönhető, többek között a kapszulának, a külső membránfehérjéknek (OMP) és speciális enzimeknek, amelyek egy 20 kDa-os metalloproteázból, a Bacteroides fragilis toxinból (BFT) állnak (Sears et al, 1995, 2014).

A BFT-t termelő B. fragilis, az enterotoxigén B. fragilis (ETBF), emberekben és állatokban hasmenéses megbetegedések okozójaként ismert (Myers et al., 1987; Purcell et al., 2017). Az ETBF a gyulladásos bélbetegségek (IBD) kockázati tényezőjeként ismert, és jelen van a betegek székletében és biopsziás mintáiban (Prindiville et al., 2000; Basset et al., 2004; Zamani et al., 2017). Kimutatták, hogy a BFT expressziója hasítja az E-kadherin extracelluláris doménjét, amely a zonula adherens egyik fő szerkezeti alkotóeleme, és a sejtadhézióért felelős. Továbbá a BFT képes aktiválni a B-katenin jelátvitelt és IL8 szekréciót indukálni a vastagbél epitélsejtekben (Wu és mtsai., 1998). Egy tanulmány szerint a HT29/C1 sejtek BFT kezelését követően a membránhoz kapcsolódó E-kadherin elvesztése a ß-katenin nukleáris lokalizációját indította el, ami a c-myc transzlációt indukálta és tartós sejtproliferációhoz vezetett (Wu és mtsai., 2003). A BFT hatásossága és a gasztrointesztinális epitélszerkezetre és fiziológiára gyakorolt hatása arra utal, hogy az ETBF jelenléte hozzájárulhat a krónikus vastagbélbetegségekhez, beleértve az onkogén transzformációt, a bélgyulladást, a krónikus vastagbél diszfunkciókat és a vastagbél prekancerosus és rákos elváltozásait (Wu et al., 1998, 2003; Sears et al., 2014).

A kolorektális rák (CRC) az egyik legelterjedtebb rákos megbetegedés világszerte, az összes rákos megbetegedés 9%-át teszi ki, és világszerte a negyedik oka a rák okozta halálozásnak (Sears et al., 1995; Ferlay et al., 2015). Az egyes országok között azonban jelentős különbség van e daganatos megbetegedés életkor szerinti standardizált előfordulási gyakoriságában; az USA és az európai országok előfordulási aránya több mint 25-szöröse az afrikai és ázsiai országokénak. A CRC megbetegedési és halálozási aránya az utóbbi években csökkent, köszönhetően a továbbfejlesztett szűrővizsgálatoknak, amelyekkel a vastagbélrendszeri elváltozásokat korábbi stádiumban lehet felismerni, valamint a gyógyszeres kezelés és az eljárások fejlesztésének (Boyle és Langman, 2000; Rafiemanesh et al, 2016).

A CRC az egyik leggyakoribb rákos megbetegedés Iránban, és az iráni férfiak körében a harmadik leggyakoribb rákos megbetegedés (8,1-8,3/100 000 lakosra), az iráni nők körében pedig a negyedik leggyakoribb (6,5-7,5/100 000 lakosra) (Moghimi-Dehkordi et al., 2008; Kolahdoozan et al., 2010). A CRC kockázati tényezői az elhízás, a mozgásszegény életmód, a magas zsírtartalmú étrend, a kevés zöldséget és gyümölcsöt tartalmazó étrend, a dohányzás, az alkoholfogyasztás és a nem szteroid gyulladáscsökkentők (NSAID). A krónikus gyulladás, az IBD, a polipok, az adenóma és a diszplázia elváltozásokat okoz a vastagbélsejtekben, és rákra hajlamossá teszi őket (Boyle és Langman, 2000; Johnson és mtsai., 2013).

A CRC előfordulása és halálozása a fejlett nyugati országokban csökken, míg Iránban az utóbbi évtizedekben az életmód és a táplálkozás változásai miatt mindkét nemnél nő az előfordulása. A csökkenés másik oka lehet a létesítmények számának növekedése, valamint a berendezések és a technológia fejlődése, mivel több ember fordul szűrővizsgálatra az egészségügyi intézményekhez, míg korábban előfordulhatott, hogy egy személynek rákja volt, és akár meg is halt, de a rákot nem diagnosztizálták a berendezések és a létesítmények hiánya miatt (Malekzadeh et al., 2009; Siegel et al, 2014).

Ebben a tanulmányban a CRC-ben és rákot megelőző állapotokban szenvedő betegek biopsziás mintáiban az ETBF gyakoriságát és abundanciáját hasonlítottuk össze olyan egyénekével, akiknek nem volt személyes vagy családi kórtörténetében vastagbélbetegség, hogy megvizsgáljuk a BFT jelenléte és a tumor kialakulása közötti összefüggést.

Anyagok és módszerek

Betegek és minták

Ebben az esetkontrollvizsgálatban 120 nyálkahártya-biopsziát gyűjtöttünk kolonoszkópia segítségével prekancerózus és CRC állapotú iráni betegektől (n = 68) és a kontrollcsoporttól (n = 52). A prekancerosus betegek (Serrated lesions, Adenoma include Low-grade Dysplasia: LGD és magas fokú diszplázia: HGD) és rákos állapotok (kolorektális rák: CRC), akiket 2015 márciusa és 2017 januárja között a teheráni Imam Khomeini kórházba utaltak, kiválasztottak a vizsgálatban való részvételre. A Teheráni Orvostudományi Egyetem Etikai Bizottsága jóváhagyta a vizsgálati protokollt. Emellett minden résztvevőtől tájékozott beleegyezést szereztek be. Minden beteget a klinikai tünetek, valamint a szövettani és radiológiai szabványok alapján diagnosztizáltak, amelyek különleges eloszlású tipikus jellemzőket mutattak (Swiderska et al., 2014). Az életkorra, nemre és az elváltozások típusára vonatkozó összes adatot a betegek nyilvántartásából szereztük be. A vizsgálatba bekerülő összes beteget a kolonoszkópia idején diagnosztizálták, és a kemoterápia nem kezdődött meg a kezelésükre.

A vizsgálatba ugyanebben az időszakban 52 egészséges kontrollt vontak be kontrollként, akiknek sem személyes, sem családi kórtörténetében nem szerepelt diagnosztizált kolorektális betegség, és akiknek életkora és neme megegyezett a betegekével. A kontrollok esetében kizáró kritérium volt a közelmúltban előfordult hasmenés és IBD. A vizsgálatban részt vevő személyek egyike sem használt antibiotikumot vagy probiotikumot az elmúlt 3 hónapban. Valamennyi mintát tioglikollát táptalajt (Merck, Németország) tartalmazó steril tartályban tartották, és anaerob állapotban szállították a laboratóriumba azonnali kezelésre. Emellett minden betegtől 2 nyálkahártya-biopsziát vettek tenyésztés és DNS-kivonás céljából.

Bakteriális tenyésztés

Két üveghomogenizálót használtak mechanikus bontáshoz és homogenizáláshoz az összes biopszia esetében; majd Bacteroides Bile Esculin agar (BBE) (Himedia Laboratories Pvt. Ltd, India) táptalajon tenyésztették őket. Ebben a vizsgálatban Anoxomat rendszert (MART Microbiology Drachten, Hollandia) használtunk az anaerobok számára gázos légköri körülmények biztosításához; majd a lemezeket anaerob kamrában inkubáltuk 37°C-on 72 órán keresztül. 72 órán keresztül a B. fragilis-t továbbá valós idejű PCR módszerrel igazoltuk.

DNS extrakció

A DNS-t közvetlenül a biopsziaszövetből nyertük az RTP® Mycobacteria Kit (Invitek, Berlin, Németország) segítségével. A kivont DNS optikai sűrűségét (OD) 260 nanométeren határoztuk meg. Ezután a DNS-t -20°C-on tartósítottuk a későbbi elemzéshez és a valós idejű PCR-hez.

Real-Time PCR

A bft és a 16S rRNS gén szekvenciáit a génbankból nyertük vissza. A primereket és a szondákat a primer 3 plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi) segítségével terveztük. Az összes bft géntípus kimutatására használt primert és szondát korábbi tanulmányunkban (Zamani et al., 2017) terveztük. A bft gén altípusok kimutatásához a valós idejű PCR-t a korábban leírtak szerint végeztük (Merino et al., 2011).

Pozitív kontrollként az ETBF D-134 törzs genomiális DNS-ét és a RIGLD 1 klónt használtuk (Rashidan et al., 2018). A negatív kontroll PCR TaqMan master mix volt, DNS helyett desztillált vízzel.

Az amplifikációhoz standard DNS-t készítettünk, és a templát grammonkénti molekuláinak számát a meghatározott képlet alapján számoltuk ki (Zamani et al., 2017). A bft és a 16S rRNS gén standard görbéjét minden egyes primer és szonda felhasználásával a B. fragilis DNS-minták 10-szeres sorozathígításával értékeltük, ami a biopsziák grammonkénti 101-106 átlagértékének felel meg.

A standard görbe és az y-intercept alapján azokat a mintákat, amelyeknél a fluoreszcens jel nem mutatta a 38-as Ct értéknél korábban a fluoreszcens jelet, negatívnak minősítettük. Azokat a mintákat is hígítottuk, amelyek ≤ 10 Ct értékű fluoreszcenciát produkáltak. A valós idejű PCR hatékonyságát az E = 10(-1/slop) – 1 (Zamani et al., 2017) értékkel határoztuk meg.

A standardgörbék optimalizálása után a hígítási sorozatot minden egyes amplifikációs futtatásba beletettük. A valós idejű PCR-teszteket a LinGene K Real Time PCR eszközzel (Bioer, Hangzhou, PR, Kína) értékeltük ki. Minden tesztet 25 μL térfogatban végeztünk (Zamani et al., 2017). A minőség biztosítása érdekében minden kísérletet másodszor is megismételtünk egymástól függetlenül, és az átlagokat jelentettük.

A PCR specificitásának és a termék várható méretének ellenőrzésére a primereket hagyományos PCR-ben alkalmaztuk, és az amplikonokat agarózgélen futtattuk. Ezenkívül a pozitívan amplifikált fragmentumok specificitását szekvenálással igazoltuk. A PCR-terméket elküldtük a dél-koreai Macrogen Corporationnek szekvenálásra. A szekvenálási eredményeket a Chromas 2.6 szoftverrel elemezték. Ezután az összes szekvenciát az NCBI adatbázisában (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) blastolták. Az összes szekvenált izolátum esetében az NCBI adatbázisban található rokon génekkel (16s rRNS gén és bft gén) való hasonlóság százalékos aránya több mint 95% volt.

Statisztikai elemzés

Az eredményeket Fisher egzakt, Chi-négyzet és Mann-Whitney tesztek segítségével hasonlítottuk össze. A P < 0,05 értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük. A B. fragilis és az ETBF esetében is kiszámítottuk az átlagértékek ± az átlag Std. error of mean (SEM) értékeit. Az adatokat az SPSS 13.0 statisztikai szoftverrel elemeztük.

Ebben a vizsgálatban feltételes logisztikus regressziót használtunk az esélyhányadosok (OR) és a 95%-os konfidenciaintervallumok értékelésére. Ebben a konstrukcióban az esélyhányados konzisztens becslője a CRC arányának, ha ETBF-expozíciónak vannak kitéve a nem exponált alanyokhoz képest.

Eredmények

Ebben a vizsgálatban 68 mintát gyűjtöttek CRC-betegektől (36 férfi és 32 nő; átlagéletkor: 55 év; tartomány: 35-78) és 52 mintát egészséges kontrolloktól (HC) (30 férfi és 22 nő; átlagéletkor: 56 év; tartomány: 42-78). Valamennyi betegnél a mintavétel időpontjában végzett kolonoszkópiás vizsgálat alapján állították fel a diagnózist. A kolonoszkópia időpontjában diagnosztizált összes betegből 26 betegnél invazív CRC, 18 betegnél serrated elváltozás, 24 betegnél adenoma, 14 betegnél LGD és 10 betegnél HGD volt a jelenlegi besorolás szerint (1. ábra). Ezeket a biopsziákat 22, 32, illetve 14 betegnél a jobb oldalról (felszálló), a bal oldalról (leszálló) és mindkét oldalról vették (1. táblázat).

A B. fragilis tenyésztés eredménye 31(51%) és 25 (48%) minta esetében volt pozitív a betegek és az egészséges kontrollok esetében (2. táblázat) (P = 0,7).

A standard görbe szerint az ETBF (kontroll pozitív) DNS 101, 102, 103, 104, 105 és 106-os hígításai 15,08 ± 0,1, 18,04 ± 0,2, 21,42 ± 0,2, 25,02 ± 0,2, 28,02 ± 0,4 és 31,96 ± 0,4 Ct-értékeket adtak. A valós idejű PCR hatékonysága 98 és 100% között volt.

A 16S rRNS gén és a bft gén tekintetében a pozitív minták aránya 63 és 47% volt a betegeknél. Ugyanakkor a HC-minták 81, illetve 3,8%-a mutatott pozitív eredményt (3. táblázat). A bft gén pozitivitása közötti különbség a betegek és a HC esetében statisztikailag szignifikáns volt (P = 0,00).

A 3. táblázatban látható a bft gén pozitív minták száma a CRC-ben és a HC-ban a klinikopatológiai csoportokon belül. A legmagasabb OR-t a serrated elváltozások csoportjában találták, amelyet az LGD-vel járó adenomatosus elváltozások csoportja követett. Szintén az összes betegre vonatkozó OR (OR 22,22, 95% CI: 5, 98,74) írta le az ETBF és az elváltozások megléte közötti összefüggést.

A valós idejű PCR kvantitatív elemzésének eredményeit a B. fragilis 16S rRNS génre és az ETBF bft génre számolt ng DNS-re vonatkoztatva a 4. táblázat mutatja. A betegek és a HC 16S rRNS gén kópiaszámai közötti különbség statisztikailag nem volt szignifikáns (P ≥ 0,05). A bft gén kópiaszáma több volt a betegek mintáiban, mint az egészséges kontrollokéban (P = 0,00). Továbbá, a bft gén kópiaszáma több volt az ETBF pozitív mintákban a prekurzor léziók csoportjában, mint a CRC-ben szenvedőkben; ez a különbség azonban statisztikailag nem volt szignifikáns. A szekvenálási eredmények megerősítették a bft és a 16S rRNS gének jelenlétét (1. adatlap).

Az e minták eredményei továbbá azt mutatták, hogy a bft-gén legelterjedtebb altípusa a bft1, amelyet a bft2 követ. A 32 bft-gént hordozó izolátumból 18 (56,2%) izolátum bft-1 és 14 (43,7%) izolátum bft-2 altípusúnak bizonyult. Ezenkívül a bft-gént a HC-minták közül 2 mintában mutatták ki, és mindegyikük bft-1 altípusú volt. Egyetlen DNS-minta sem hordozta a bft-3 altípust.

Diszkusszió

Egyre több bizonyíték van a mikrobiális diszbiózis hatására a bélben, a kolorektális rák beindulására és kialakulására (Sears és Garrett, 2014; Gagniere és mtsai., 2016). Bár a CRC előfordulását Iránban más országokhoz képest alacsonyabbnak jelentették, a jövőben várhatóan növekedni fog (Hosseini et al., 2004; Malekzadeh et al., 2009). Korábbi tanulmányokban arról is beszámoltak, hogy az ETBF-nek szerepe lehet a hasmenésben és az IBD-ben (Myers et al., 1987; Prindiville et al., 2000; Basset et al., 2004; Merino et al., 2011; Purcell et al., 2017; Zamani et al, 2017).

Egyes vizsgálatok szerint bizonyos baktériumfajok (pl. ETBF) patogén baktériumokként működhetnek, amelyek tisztázzák a bél mikrobiális közösségében kialakuló diszbiózist és kiváltják a CRC-t (Hajishengallis és mtsai., 2012; Hajishengallis és Lamont, 2016). A kolorektális tumorigenezist a BFT okozta immunválaszok és a proinflammatorikus citokinek aktiválódása indukálta (Wu és mtsai., 2004, 2009).

A vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy az ETBF szignifikánsan társult a serrated elváltozásokhoz, amelyeket LGD követett. A magasabb esélyhányados ezeknél az elváltozásoknál azt is mutatta, hogy az ETBF-expozíció a rákos és különösen a rák előtti állapotok kockázati tényezője. Ez alátámasztja azt a hipotézist, hogy a BFT-t termelő törzsek fontos szerepet játszhatnak a gyulladás és az immunológiai válasz kiváltásában a genetikailag fogékony személyeknél, és CRC-hez vezethetnek. Az első tanulmányt, amely az ETBF fokozott előfordulását bizonyította a vastagbélrákos betegek székletmintáiban (38%) a kontrollcsoporthoz (12%) képest, Ulger Toprak és munkatársai (2006) végezték. Ezenkívül néhány korábbi jelentés összefüggést mutatott ki a bft gén és a CRC között, különösen a CRC késői stádiumában (Dejea et al., 2014; Boleij et al., 2015; Viljoen et al., 2015). A Purcell és munkatársai által végzett vizsgálat az ETBF szignifikáns társulását mutatta ki a tubuláris adenómákkal, a serrated elváltozásokkal és az alacsony fokú diszpláziával, ami hasonló volt a jelen vizsgálat eredményeihez (Purcell és munkatársai, 2017).

A jelen vizsgálatban a prekurzor elváltozások, beleértve az alacsony fokú diszpláziával rendelkezőket is, növekvő tendenciát mutattak a bft gén mennyiségében a CRC-vel rendelkezőkhöz képest; ez a különbség azonban statisztikailag nem volt szignifikáns. Továbbá a szerzők korábban már beszámoltak arról, hogy a CRC-re hajlamos, fekélyes vastagbélgyulladásos betegek vastagbelében és terminális ileumában ETBF markereket figyeltek meg (Zamani és mtsai., 2017; Rashidan és mtsai., 2018). Hasonlóképpen, egy korábbi vizsgálatban ennek a génnek csak a bft1 altípusát mutatták ki (Zamani és mtsai., 2017). Bár a bft1 gén volt a legelterjedtebb altípus, ebben a vizsgálatban a bft2 gén is megtalálható volt.

Ebben a vizsgálatban az ETBF-et kimutatták a CRC-betegek lézióiban, és hasonló eredményekről számoltak be korábban más kutatók is, akik vastagbélnyálkahártya-mintákban vizsgálták az ETBF-et (Boleij et al., 2015; Viljoen et al., 2015). A bélmikrobiom szerepével foglalkozó legújabb tanulmányok kimutatták, hogy a CRC-betegek nem tumoros és tumoros régióiban a mikrobiális közösségben diszbiózis lép fel (Dejea és mtsai., 2014; Flemer és mtsai., 2017; Purcell és mtsai., 2017). Ezekben a vizsgálatokban kimutatták, hogy egyes baktériumok, köztük a Fusobacterium nucleatum, ETBF, Escherichia coli, Streptococcus gallolyticus és Enterococcus faecalis, valamint a butiráttermelő baktériumok fontos szerepet játszhatnak a CRC kialakulásában (Dejea et al, 2014; Flemer et al., 2017; Park et al., 2018).

A B. fragilis kimutatására szolgáló valós idejű PCR eredményei azt mutatták, hogy a betegek és a HC több százaléka tartalmazott B. fragilist a tenyésztési módszerhez képest. A baktériumok kimutatásának arany standard módszere a tenyésztésen alapuló módszer, de nagyszámú életképes sejtet igényel, és kifejezetten az anaerob baktériumtenyészet esetében bizonyos korlátok előfordulhatnak. Lehet, hogy ezek a korlátozások befolyásolják az eredmények közötti különbséget.

A B. fragilis kultúrák és a Real-time PCR eredmények közötti különbségek a kontrollok és a CRC minták között nem szignifikánsak. Ezek az adatok arra utalnak, hogy valószínűleg a bft-gént hordozó törzsek, és nem a B. fragilis önmagában járulhatott hozzá a CRC kialakulásához ebben a vizsgálatban. Kimutatták, hogy a B. fragilis kiemelkedő humán komensál, így ez a baktérium a betegekhez hasonlóan egészséges kontrollokból is izolálható. A rákos és rákot megelőző elváltozásokban szenvedő betegeknél azonban a bft-géneket tartalmazó törzsek egy része megnövekedett, és ez a diszbiózis valószínűleg gyulladást idézhet elő. Emellett egyes tanulmányok kimutatták, hogy a humán komensális B. fragilis megakadályozta a vastagbélgyulladás kialakulását, és hatékony terápiás stratégiát jelenthet a CRC kezelésére, míg különböző tanulmányok szerint e baktérium enterotoxigén törzsei az enterotoxin-termelés miatt béldaganatokkal hozhatók összefüggésbe (Sears et al., 1995, 2014; Mazmanian et al., 2008; Lee et al., 2018).

A vizsgálatnak volt néhány korlátozása. Különböző módszereket alkalmaztak a bft gén diagnosztizálására, amelyet közvetlenül a betegek vastagbelében lévő tumorszövetekből vontak ki. Így egy nagy populációs alapú kohorszvizsgálat elvégzése erősen ajánlott. Ezenkívül további vizsgálatokra van szükség a bft gén jelenléte és a serrated léziók, az LGD és a CRC közötti esetleges összefüggés bizonyítására.

Következtetések

A tanulmány eredményei arra utalnak, hogy az ETBF jelen lehet a CRC-s betegek mellett a rákot megelőző állapotokban, például serrated léziókban és LGD-ben szenvedő betegek nyálkahártya-biopsziáiban is. Szignifikáns összefüggést találtunk az ETBF jelenléte az érintett szövetekben és e baktériumok száma között a betegek mintáiban, különösen a rákot megelőző karcinogén elváltozásokban: az alacsony fokú diszpláziával járó adenomákban és a serrated elváltozásokban. Valójában az ETBF gyakrabban mutatható ki a korai elváltozásokban, de a további, nagyobb számú mintával végzett kutatások hasznosnak tűntek a pontos meghatározáshoz.

Akár további kutatásokra van szükség annak megállapítására, hogy az életkor, a nem, az étrend és más környezeti tényezők befolyásolják-e az ETBF diagnózisát az emberekben az idők folyamán.

Végeredményben az ETBF a CRC prognózisának markere lehet, különösen a rákot megelőző elváltozásokban, és felhasználható lenne ezen betegségek szűrésére.

Adatok hozzáférhetőségi nyilatkozata

A kézirat következtetéseit alátámasztó nyers adatokat a szerzők indokolatlan fenntartás nélkül bármely szakképzett kutató rendelkezésére bocsátják.

Etikai nyilatkozat

A humán résztvevőkkel végzett vizsgálatokat a Teheráni Orvostudományi Egyetem Etikai Bizottsága felülvizsgálta és jóváhagyta. A betegek/résztvevők írásbeli beleegyezésüket adták a vizsgálatban való részvételhez.

A szerzők hozzájárulása

SZ az első szerző, aki az összes laboratóriumi kísérletet elvégezte, az adatokat összegyűjtötte és elemezte, valamint a kéziratot megszerkesztette. RT a gasztroenterológus, aki kolonoszkópiát végzett és biztosította a mintákat minden esetből. LS részt vett a vizsgálat tervezésében és koordinálásában, és tanácsot adott a vizsgálat minden részében. AS és SJ részt vett a minták gyűjtésében és a vizsgálatok elvégzésében. MF felügyelte a vizsgálat minden részét. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a kéziratot.

Finanszírozás

Ezt a munkát a Teheráni Orvostudományi Egyetem támogatta (Grant No: 32467).

Érdekütközés

A szerzők kijelentik, hogy a kutatást olyan kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolatok hiányában végezték, amelyek potenciális érdekellentétként értelmezhetők.

Köszönet

A szerzők köszönetet mondanak az Imam Khomeini kórház személyzetének a minták gyűjtésében nyújtott szíves támogatásukért.

Kiegészítő anyag

A cikkhez tartozó kiegészítő anyag online elérhető a következő címen: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2019.00449/full#supplementary-material

Adatlap 1. A bft és 16S rRNS gének szekvenálási eredményei egy izolátumban.