Frontiers in Pharmacology

Introduction

A biológiailag aktív peptidek a természetes aminosavak különböző összetételét és elrendezését alkotó különböző peptidek általános megnevezése. Köztudott, hogy számos biológiai funkcióval rendelkeznek, mint például antioxidáns, immunerősítő, hormonmoduláló, antibakteriális, antitrombotikus, antivirális és vérnyomáscsökkentő hatásuk van az állati vagy növényi fehérjékből származó multifunkcionális vegyületek miatt (Wang és mtsai., 2017). Ezenkívül nagyfokú élelmiszer-biztonsággal és magas biológiai hozzáférhetőséggel rendelkeznek, ami potenciális jelöltekké teszi őket funkcionális peptidgyógyszerek és funkcionális élelmiszer-adalékanyagok kifejlesztésére (Sarmadia és Ismaila, 2010).

Az Egészségügyi Világszervezet becslése szerint a CVD évente több mint 17,5 millió ember haláláért felelős. A CVD fontos jellemzői közül a magas vérnyomás a CVD megelőzésének és kezelésének alapvető célpontja (Celermajer et al., 2012). A jelenleg használt vérnyomáscsökkentő gyógyszerek, például a kaptopril és az enalapril alkalmazása korlátozott az olyan mellékhatások miatt, mint a köhögés, kiütés és fejfájás (Yu et al., 2018). A CVD egyre növekvő előfordulása miatt azonban szükség van néhány új és biztonságos alternatívára, például az élelmiszerekből származó aktív peptidekre. Az utóbbi időben jelentős előrelépés történt a szív- és érrendszeri egészséget pozitívan befolyásoló élelmiszer-összetevők azonosítása és szűrése terén (Martinez-Maqueda et al., 2012; Liu et al., 2018). Az ilyen vegyületek közül a peptidek kiemelt figyelmet kaptak vérnyomáscsökkentő hatásuk miatt. Korábban a peptidek in vitro vérnyomáscsökkentő hatását elsősorban az angiotenzin konvertáló enzim (ACE) gátló hatásának mérésével határozták meg, amely a sejtmembránon elhelyezkedő dipeptidil-karboxi-peptidáz, és a vérnyomást és a folyadékháztartást szabályozó két hormonális rendszer egyensúlyának megbontásával nagyfokú károsodást okozhat (Clayton et al., 2015; Gebre et al., 2018). Ezen túlmenően az élelmiszerekből származó vérnyomáscsökkentő peptidek igazoltan vérnyomáscsökkentő hatást fejtettek ki a hipertóniás betegekre mindenféle toxicitás vagy mellékhatás nélkül (Martinez-Maqueda és mtsai., 2012). Az antihipertenzív peptidek elkülönítése és tisztítása az élelmiszerfehérjékből új irányt adna a természetes vérnyomáscsökkentő gyógyszerek fejlesztésének.

A ginkgo biloba magforrások világszerte széles körben tanulmányozták figyelemre méltó biológiai aktivitásuk és farmakológiai hatásuk miatt. A ginkgo mag, mint hagyományos kínai gyógyászat, több mint 600 éves múltra tekint vissza, de fő aktív összetevőiről keveset tudunk. Csak néhány tanulmány számolt be a G. biloba magok fehérjeizolátumának antioxidáns, fáradtság elleni és bakteriosztatikus hatásairól (Lena és Philip, 2002; Huang és mtsai., 2010). Wu és munkatársai (2013) a Ginkgo peptidet alkalázzal és pepszinnel hidrolizálták, hogy két antioxidáns peptidet kapjanak, amelyek képesek a szabad gyökök elnyelésére és a lipidperoxidáció gátlására. A Ginkgo hipotenzív peptideket azonban tovább kell kutatni, hogy feltárjuk a magasabb hatás mögöttes mechanizmusait.

Ezekben négyféle proteázt használtunk a GPI hidrolizálásához, hogy kiválasszuk a magas ACE-gátló aktivitású hidrolizátumok közül az egyiket, és ultraszűrést végezzünk, hogy különböző MW-értékű komponenseket kapjunk. Megvizsgáltuk a MW-k hatását a GPH-k ACE-gátló aktivitására. Az aminosav-összetétel és a peptidaktivitás közötti kapcsolatot is megállapították. Az újonnan kivont ACE-gátló peptideket tisztítottuk, azonosítottuk és szintetizáltuk; IC50-értékeiket teszteltük, és a peptidgátlási mintázatokat Lineweaver-Burk-diagramokkal vizsgáltuk. Az ACE-gátlási mechanizmust molekuláris dokkoló elemzéssel is megvilágítottuk.

Anyagok és módszerek

Anyagok

A G. biloba L. magokat a kínai Shandong tartomány Linyi városából vásároltuk. A magokat meghámozták, meghántolták és felhasználták a további kísérletekhez. Az angiotenzin I-konvertáló enzimet és a hippuril-l-hisztidil-L-leucint (HHL), hippursavat a Sigmától (St. Louis, MO, Egyesült Államok), illetve a Yuanye Bio-Technology-tól (Sanghaj, Kína) vásároltuk. A kaptoprilt a MedChem Express-től (NJ, Egyesült Államok) szereztük be.

A GPI előállítása

A G. biloba L. magokat 45°C-on szárítottuk, majd porrá zúztuk és 80-as rostán átszitáltuk. A port a fenolízis és zsírtalanító kezelés után fagyasztva szárítottuk. Az így kapott G. biloba magvak porát feloldottuk DW-ben (1:20, w/v; pH 10,0). A fenti szuszpenziót 12 órán át kevertettük és extraháltuk, majd 30 percig 10 000 g-nél centrifugáltuk. A kapott felülúszót a ginkgo fehérje pH 4,62 izoelektromos pontjára állítottuk, és 60 percig inkubáltuk, majd további 30 percig 10 000 g-nél centrifugáltuk. A kapott csapadékot desztillált vízzel reszuszpendáltuk, és az oldatot pH 7-re állítottuk be. Ezt követően a kapott GPI-t a következő felhasználásig fagyasztva szárítottuk.

Ginkgo fehérje hidrolizátumok (GPH) előállítása

Ezért 4%-os GPI oldatot készítettünk, és négy proteázzal külön-külön hidrolizáltuk az optimális hidrolízisfeltételek mellett 5 órán keresztül. Az enzimadagok 2000 U-t tettek ki. A hidrolízis után az enzimeket 10 percig 90°C-on inaktiváltuk, majd az oldatot 30 percig 3000 g-n centrifugáltuk, hogy megkapjuk a négy enzimből nyert egyedi felülúszókat.

Hidrolízisfok

A hidrolízisfokot (DH) Kimatu et al. módszerére hivatkozva számoltuk ki. (2017) szerint a következők szerint:

melyben B a hidrolízis során a pH állandó szinten tartásához hozzáadott NaOH mennyiségét (mL) jelentette; Nb a NaOH-oldat moláris koncentrációja volt; MP a fehérje tömege (g); α a fehérje szubsztrátokban a hidrolízis során bekövetkező átlagos disszociációs fokot jelölte; htot a fehérjében lévő peptidkötések teljes száma volt.

Az ACE-gátló peptid izolálása és tisztítása

A minta ultraszűrését MSC300 csésze típusú ultraszűrővel (MoSu, Shanghai, Kína) végeztük. A mintát az adagolónyílásból adtuk hozzá, és a nitrogénpalackot az ultraszűrő csésze tömlőcsatlakozásához csatlakoztattuk. Ezután az ultraszűrő csészét a nitrogén gázpalackkal összekapcsolt mágneses keverőre helyeztük és csomagoltuk, legfeljebb 0,22 MPa nyomással. A mintákat egymás után 1, 3, 5 és 10 kDa-os ultraszűrőmembránokon vezettük át, és négy komponenst kaptunk (<1, 1-3, 3-5 és 5-10 kDa). A négy frakciót összegyűjtöttük, fagyasztva szárítottuk, majd az ACE-gátló aktivitás vizsgálatára használtuk. A nagyobb ACE-aktivitással rendelkező komponenseket választottuk ki további tisztításra a Zheng és munkatársai (2017) által megadott eljárás szerint. Az ultraszűrés után kapott fagyasztva szárított hidrolizátumot (200 mg) tisztított vízben reszuszpendáltuk, hogy 50 mg/ml végső koncentrációt kapjunk, és további tisztításnak vetettük alá Sephadex G-15 gélszűrő oszlop (1,5 cm × 60 cm) segítségével. A mikroszűrőmembránnal szűrt mintákat és az elúciót desztillált vízzel végeztük 1 ml/perc áramlási sebességgel. A mintát 220 nm-es hullámhosszon P270 félpreparatív HPLC (Aixin, Guangzhou, Kína) segítségével követtük nyomon és választottuk szét. A frakciókat (egyenként 7,5 ml) összegyűjtöttük és fagyasztva szárítottuk.

Az ACE-gátló aktivitás meghatározása

Ezt a vizsgálatot az O’Loughlin és munkatársai (2014) korábbi jelentésében leírtak szerint végeztük, néhány módosítással. Röviden, a hippuril-hisztidil-leucin (HHL, 5 mM) szubsztrátot és a mintákat 0,1 M Na2 (pH 8,3) 0,3 M nátrium-kloriddal kevertük. Ezután 50 μL mintát és 150 μL szubsztrátot adtunk egy centrifugacsőbe, összekevertük, és 5 percig 37 °C-os vízben állni hagytuk. Ezt követően hozzáadtuk az ACE-oldatot (50 mU/mL), és 37°C-on 45 percig inkubáltuk. A reakciót 250 μL 1M HCl hozzáadásával fejeztük be, majd az oldatot 0,45 μM nejlon fecskendőszűrőn szűrtük, mielőtt RP-HPLC-vel (Waters, Milford, MA, Egyesült Államok) elemeztük Inertsil ODS-3 (250 × 4,6 mm, 5 μm szemcseméret) berendezésen. A mobilfázis desztillált víz: acetonitril = 75:25 (V/V, 0,1% TFA-val) volt, 0,5 ml/perc áramlási sebességgel és 228 nm-en történő detektálással. Kontrollként kaptoprilt használtunk, és az inhibitoros aktivitást (%) az alábbiak szerint határoztuk meg:

ahol A a hippurinsav csúcsterülete a mintával, B a minta nélkül.

LC-MS/MS analízis és a tisztított peptidszekvenciák azonosítása

A tisztított mintákat Q Exactive (Thermo Fisher Scientific, MA, Egyesült Államok) Easy-nLC 1000 (Thermo Fisher Scientific, MA, Egyesült Államok) segítségével elemeztük. A mintát sótalanítottuk és liofilizáltuk, 0,1%-os FA oldatban visszaállítottuk és -20°C-on tároltuk a következő felhasználásig. A két mobilfázis a következő volt: az A mobilfázis 0,1%-os hangyasav vizes oldatát képezte, a B mobilfázis pedig 0,1%-os hangyasavas acetonitril vizes oldata volt (az acetonitril 84%-os volt). Miután az oszlopot kiegyenlítettük az A oldat 95%-ával, a mintát az automatikus mintavevőből a Trap oszlopra töltöttük. A peptidek fragmentumainak tömeg-töltés arányát a következőképpen gyűjtöttük össze: összesen 20 fragmentum mintát vettünk minden egyes teljes letapogatás után. A tömegspektrometriás vizsgálat nyers fájlját a Mascot 2.2 szoftverrel kerestük a megfelelő adatbázisban.

Peptidek szintézise

Az LC-MS/MS segítségével azonosított potenciális ACE-gátló peptideket a GL Biochem (Sanghaj, Kína) cégnél szintetizáltuk. A szintetikus peptidek tisztaságát HPLC-vel is megerősítették, amely nagyobb volt, mint 95%.

Az ACE-gátlás kinetikája

A G. biloba peptid kinetikai gátlási modelljét Lin és munkatársai (2017) módszerével vizsgálták. Röviden, a HHL szubsztrát különböző koncentrációit (0,5, 1, 1, 2 és 5 mM) hagyták reagálni az ACE-vel. A Lineweaver-Burk-diagram a reakciósebesség (1/v) és a szubsztrátkoncentráció (1/) reciproka alapján készült. Az X- és Y-tengely metszéspontjai a Km és a Vmax reciprokát jelentették.

Docking analízis

Ezért az ACE fehérje (PDB ID: 1O8A) háromdimenziós szerkezetfájlját töltöttük le az RCSB Protein Data Bankból (PDB1). A G. biloba peptidek háromdimenziós szerkezetét a Discovery Studio 3.5 molekuláris szimulációs szoftverrel rajzoltuk meg. A hidrogénfeldolgozást és az energia minimalizálását a CHARMM programmal végeztük el. Ezenkívül a Zn2+-t megtartottuk az ACE modellben. A DS 3.5 szoftver saját pontozási függvénye szerint pontozta a dokkolási eredményt, a pontszámok és az egyes eredmények kombinált szabad energiája alapján. Az összes eredmény közül a jobban illeszkedő eredményt választottuk ki.

Statisztikai elemzés

Egyirányú ANOVA, majd Duncan-féle többszörös tartománytesztek az SPSS Statistics 20.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL, Egyesült Államok) szignifikancia különbséggel (P ≤ 0,05) az adatok elemzéséhez használtuk.

Eredmények

A GPH-k DH és ACE gátló aktivitása

Amint az 1A. ábrán látható, a DH a teljes hidrolízisfolyamat során idővel meghosszabbodott. A DH a 2 órás intervallum előtt gyorsan növekedett, majd ezt követően a növekedés üteme az idővel fokozatosan lelassult. Általánosságban elmondható, hogy a hidrolízis sebessége a kezdeti 1 órában magas volt, ami ezt követően csökkent vagy állandóvá vált. A négy proteáz közül az alkaláznak volt a legmagasabb DH-ja, amely 5 óra elteltével elérte a 14,7%-ot, amelyet a tripszin (8,91%) és a diszpáz (6,91%) követett. A legalacsonyabb DH értéket az aromazim esetében figyeltük meg, amely 5 óra elteltével mindössze 3,23% volt. Ezek az eredmények arra utaltak, hogy a GPI-t a proteázok különböző helyeken hasították, ami különböző peptidösszetételű fehérje-hidrolizátumokat eredményezett.

A négy proteáz-hidrolizátum ACE-gátló aktivitását tekintve az aktivitás a DH-val együtt nőtt a vizsgált időszakban. Amint az 1B. ábrán látható, az alkaláz, a tripszin, a diszpáz és a flavourzyme gátló aktivitása 5 óra alatt 62,70, 39,81, 48,39 és 25,95% volt. A különböző hasadási helyek miatt különböző ACE-gátló aktivitású peptideket kaptunk. Közülük a lúgos hidrolizátum aktivitása viszonylag erősebb volt, ami azt jelezte, hogy a lúgos proteáz hatékonyan képes nagyobb ACE-gátló hatású hidrolizátumot előállítani.

A GPH-k és a membránfrakció ACE-gátló aktivitása

A GPH-k és a kapott frakciók ACE-gátló aktivitása jelentősen függött a MW-tól, amint azt az 1C,D ábrák mutatják. Az 1 mg/ml mintakoncentrációknál az ACE gátló aktivitása fokozatosan nőtt, ahogy a komponensek MW-értéke csökkent. A gátló aktivitás 3-5 és 5-10 kDa esetén 44,94% (IC50 = 1,257 mg/ml), illetve 44,04% (IC50 = 1,765 mg/ml) volt. Ezt követően az aktivitás fokozatosan nőtt az alacsonyabb MW-val és elérte a legmagasabb szintet (69,86%; IC50 = 0,224 mg/ml) <1 kDa-nál.

Ginkgo peptidek tisztítása

Az alkalázt gyakran használják aktív peptidek előállítására, mivel széleskörű specificitása és erős fehérjebontó képessége miatt. Az ultraszűréses kezelésből kiderült, hogy az ACE-gátló aktivitás a polipeptid MW-értékének csökkenésével javult. Ezért a <1 kDa frakció peptidjét Sephadex G-15 oszlop segítségével tovább tisztítottuk. A 2A ábrán látható, hogy a Sephadex G-15 három komponensre (A1, A2 és A3) oszlott. A három komponenst összegyűjtöttük és liofilizáltuk, majd megmértük ACE-gátló aktivitásukat. Az eredményeket a 2B. ábra mutatja. A három komponens ACE-gátló aktivitása (1 mg/ml) 64,08, 58,55 és 74,96% volt. Ezért a következő lépésben a legaktívabb A3 komponenst választottuk ki a szerkezeti azonosításhoz.

Ginkgo peptidek azonosítása és peptidszintézis

A potenciális ACE-gátló peptid azonosítása érdekében a legaktívabb A3 komponenst LC-MS/MS módszerrel elemeztük (Kiegészítő S1 táblázat). Ennek alapján az A3 komponensből három peptidet szűrtünk ki, amelyek aminosav-szekvenciája a következő volt: Thr-Asn-Leu-Asp-Trp-Tyr (TNLDWY), Arg-Ala-Asp-Phe-Tyr (RADFY) és Arg-Val-Phe-Asp-Gly-Ala-Val (RVFDGAV) (3. ábra). E peptidek azonosított szekvenciái 5-7 aminosavmaradványból álltak. E három peptidfrakció ACE-gátló aktivitásának azonosítása érdekében a peptideket kémiai úton szintetizáltuk. A kapott szintetizált peptideket tömegspektrometriával azonosítottuk (4A-C ábrák). Az eredmények azt mutatták, hogy a TNLDWY, RADFY és RVFDGAV IC50 értéke 1,932, 1,35 és 1,006 mM volt (4D. ábra).

A Ginkgo peptidek gátlási mechanizmusa

A G. biloba peptidek gátlási módját a Lineweaver-Burk plot alapján elemeztük. Amint az 5. ábrából látható, a TNLDWY Ginkgo peptid hozzáadásakor mind a Vmax, mind a Km megváltozott, a Vmax nőtt a peptidkoncentráció növekedésével; míg a Km nem változott jelentősen a peptidkoncentrációval, ami azt jelezte, hogy a gátlási mintázat nem kompetitív gátlási mód lehet. A RADFY és RVFDGAV esetében a Vmax nem változott jelentősen a koncentrációval; míg a Km a peptidkoncentráció növekedésével nőtt, ami azt jelzi, hogy mindkét peptid kompetitív inhibitor, amely képes az ACE aktív helyeihez kötődni, így blokkolva az ACE szubsztráthoz való kötődését és gátolva az ACE aktivitását.

Molekuláris dokkolási szimuláció a peptidek és az ACE között

Ebben a tanulmányban három peptid és az ACE kölcsönhatását vizsgáltuk. Az eredmények azt mutatták, hogy valamennyi peptid jól kötődik az ACE-hez és stabil komplexet képez, ami potenciális ACE-gátlóként való felhasználásukra utal. A – Cdocker kölcsönhatási energia pontszámát az 1. táblázat mutatja. A TNLDWY, RADFY és RVFDGAV frakciók pontszáma 102,995, 105,335 és 117,706 volt. A molekuláris dokkolási eredményeket a 6. ábra és a 2. táblázat mutatja. A TNLDWY optimális dokkolási pozíciója hat hidrogénkötést képes kialakítani, ezek közül hidrogénkötést alakított ki Ala 354, Tyr523 az S1 aktív zsebben, His353, His513 az S2 aktív zsebben és Zn2+ maradékokkal, és mindegyikhez stabilan kötődött. Ez összefügghet a peptid erős ACE-gátló hatásával. A 6B. ábrán megfigyelhető volt, hogy a RADFY hét hidrogénkötést képes kialakítani aminosav-maradékokkal, és intermolekuláris hidrogénkötéseket a Gln281, His353, His513 és Tyr520 maradékokkal az S2 aktív zsebben. E hidrogénkötések kialakulása nagymértékben stabilizálta az enzim-peptid komplexet. Ezenkívül a RADFY ionos kötést alakított ki a Zn2+-val, konjugációs erőket a Val380, His383, Glu384, His387, Glu411, Lys511 és Tyr523 aminosavmaradékkal, valamint van der Waals-erőt a Trp356 aminosavmaradékkal. Ezek a kölcsönhatások a Zn2+ ligandum deformációját és az ACE inaktiválását eredményezhetik. A TNLDWY-hoz és a RADFY-hoz képest az RVFDGAV négy hidrogénkötést képes kialakítani aminosavmaradványokkal, amely stabilan kapcsolódott az ALA354-hez, a TYR523-hoz az S1 aktív zsebben és a Glu162-hez az S1′ aktív zsebben. Az RVFDGAV azonban ionos kötéseket tudott kialakítani a Zn2+ -al, ami közvetlenül az ACE-molekulák deaktiválásához vezetett. Ezenkívül konjugátumot képzett az olyan aminosavmaradványokkal, mint a Glu162, His353, Glu376, Val379, His387, Phe391, His410, Phe457 és Phe527 (6C ábra).

Diszkusszió

Az utóbbi években a növényi fehérjékből származó, élelmiszerből származó ACE-gátló peptidek egyre nagyobb figyelmet kaptak a kevesebb mellékhatásuk miatt. Ebben a vizsgálatban alkalázt, diszpázt, tripszint és flavenzimet használtak a Ginkgo fehérje hidrolizálásához. Az alkaláz hidrolízisével nyert Ginkgo fehérje hidrolizátum DH és ACE gátló aktivitása a legmagasabbnak bizonyult. A hidrolízis folyamata a kezdeti szakaszban gyorsan zajlott, ami sok peptidkötés hidrolízisét eredményezte, majd ezt követően a hidrolízis sebessége lelassult a hidrolízishez rendelkezésre álló szubsztrátok fokozatos csökkenése miatt (Ketnawa et al., 2017; Hu et al., 2018; Wei et al., 2018). Ezek az eredmények összhangban voltak azzal a korábbi jelentéssel, amely szerint a repcefehérje-hidrolizátumok hatékony ACE-gátló hatással rendelkeznek, ha alkalázzal hidrolizálják őket (He és mtsai., 2013).

Az angiotenzin konvertáló enzim egy multifunkcionális extracelluláris dipeptidáz, amely különböző szövetekben van jelen. Az ACE gátló aktivitása csökkenti a vérnyomást azáltal, hogy csökkenti az angiotenzin II termelését és csökkenti a kininek pusztulását (Zheng és mtsai., 2017). A hidrolizátum ACE-gátló aktivitása összefüggött a molekulatömeg-eloszlással. Az ultraszűréssel a Ginkgo hidrolizátumot öt komponensre választották szét. A <1 kDa molekulatömegnél jelentették a Ginkgo hidrolizátum ACE-gátló aktivitását a legmagasabbnak. Ez a megfigyelés összhangban volt a korábbi tanulmányokkal, amelyek az alacsony MW-értékű polipeptidek magasabb ACE-aktivitásáról számoltak be (Wang et al., 2015; Ola et al., 2017). Továbbá Silvestre és munkatársai (2012) megerősítették, hogy az ultraszűréses kezelés visszatarthatja a C-terminális pozícióban lévő peptideket (AAA) az ACE-gátló aktivitás elősegítése érdekében.

A magasan aktív ACE-gátló peptid további tisztítása érdekében a Ginkgo-komponenst (<1 kDa) gélszűrési kromatográfiával választották el, majd LC-MS/MS segítségével azonosították az aminosav-szekvenciát. Így három új ACE-gátló peptidet kaptunk: TNLDWY (1,932 mM), RADFY (1,35 mM) és RVFDGAV (1,006 mM), amelyek erős ACE-gátló hatást mutattak. Hernández-Ledesma és munkatársai (2011) jelentése szerint az ACE-gátló peptidek többsége rövid, 2-12 aminosavból álló szekvencia volt. Ezenkívül az ACE-gátló peptid aktivitása erősen összefüggött a C-terminális aminosav, az aromás aminosav és a hidrofób aminosav jelenlétével. Például az aromás aminosav (Tyr, Phe és Trp) jelenléte jelentősen fokozta az ACE-gátló peptid aktivitását. Ezenkívül az Arg is ismert, hogy fontos szerepet játszik a gátló peptidben. Toopcham és munkatársai (2017) kimutatták, hogy a polipeptid gátló aktivitása jelentősen csökkent az Arg eltávolítása után. Továbbá Liu és munkatársai (2018) bebizonyították, hogy a peptidben lévő olyan aminosav, mint a Leu, jelentősen befolyásolta az ACE-gátló aktivitást, függetlenül attól, hogy a C-terminálison vagy az N-terminálison helyezkedik el. Hasonló eredményekről számolt be Lee és Hur (2017) is. Ezek a vizsgálatok arról számoltak be, hogy a különböző fehérjeanyagokból származó KPLL, VLAQYK és DLP peptidek hidrofób aminosav (Leu) jelenlétében jelentős ACE-gátló aktivitást mutattak. A mi vizsgálatunkban a TNLDWY és a RADFY C-terminálisán helyezkedett el a Tyr. Ezenkívül a RADFY és az RVFDGAV két peptidje Arg-ot tartalmazott az N-terminuson, és a hidrofób aminosavak tartalma a három peptidben magasabb volt. Mindenekelőtt a peptidfragmentumok megfeleltek az ACE-gátló peptidek szerkezeti jellemzőinek.

Az ACE-gátló peptidek gátlási módját általában nem-kompetitív, kompetitív és vegyes gátlási módot figyeltek meg. A rövid peptidek (2-12 aminosav) esetében a legtöbbjük kompetitív inhibitor volt, és az ACE enzimhez kapcsolódva megakadályozták a szubsztrát HHL kötődését. Lin és munkatársai (2017) hasonló tanulmánya bizonyította, hogy a Qula kazeinből származó KYIPIQ és LPLPLL peptidek kompetitív gátlási módot mutattak. A nem kompetitív inhibitorok esetében azonban az enzim szubsztrátkötő helyétől eltérő helyeken kötődnek, és végső soron befolyásolják a szubsztrát enzimhez való kötődését. Hasonló mintázatot figyeltek meg az élelmiszer eredetű gátló peptidek, például a Qula kazeinből származó PFPGPIPN és a mogyoró peptid YLVR esetében is (Lin és mtsai., 2017; Liu és mtsai., 2018). Ebben a kompetitív módban az ACE, a szubsztrát és a peptid enzim-szubsztrát-inhibitor komplexet alkotott, amely megakadályozta a termék további felszabadulását, és a Vmax csökkenését eredményezte (Barbana és Boye, 2011).

Az ACE és a gátló peptidek közötti molekuláris kölcsönhatási mechanizmus tanulmányozása hasznos az új ACE-gátló peptidek szűréséhez és tervezéséhez. A gátló peptidek molekuláris kölcsönhatásairól azonban nem áll rendelkezésre elegendő információ. A molekuláris dokkolás a ligandumok és receptorok “zár és kulcs” elvén alapul, és a kis molekulájú ligandumok és a receptor biomakromolekulák közötti kölcsönhatást szimulálja. A köztük lévő kötődési mód és affinitás lehetővé teszi a gyógyszerek virtuális szűrését. Az ACE egy Zn2+-függő karboxidipeptid enzim, amelyben a Zn2+ az ACE aktív központjának fontos része (Pina és Roque, 2009). Korábban közölt adatok szerint (Pan és mtsai., 2012) az ACE aktív helyén lévő fő kölcsönhatási maradékokat három aktív zsebre (S1, S2 és S1′) osztották fel. S1 (Ala354, Glu384 és Tyr523); S2 (Gln281, His353, Lys511, His513 és Tyr520); és S1′ (Glu162 maradék). Az ACE aktív helyén két hisztidin (His383 és His387) a Glu 411-gyel együtt Zn2+ ligandumot alkotott. Arról számoltak be, hogy a peptidek által kiváltott ACE-aktivitás gátlása hidrogénkötés-stabil enzim-peptid komplexek kombinációjával érhető el (Fu és mtsai., 2017). Emellett a van der Waals-erők kialakulása olyan aminosavmaradványokkal, mint a His353, Ala 354, Ser355, Glu384, His513 és Pro519, a konjugált kölcsönhatás a Tyr360-mal és a nem kovalens kölcsönhatások a Glu384, Arg522-vel szintén hozzájárulhatnak az enzim-peptidkomplexek stabilitásához. Ezen erők jelenléte stabilabbá teszi az enzim-peptid komplex szerkezetét, ami jobban elősegíti az ACE aktivitás gátlását, ez lehet az oka a TNLDWY, RADFY és RVFDGAV erős ACE gátló hatásának.

Következtetés

Ebben a tanulmányban a G. biloba magokat használtuk fel potenciális ACE gátló peptidek előállítására. A különböző proteázokból előállított GPH-k változatos ACE-gátló aktivitást mutattak in vitro. A legmagasabb DH és in vitro ACE-gátló aktivitást az alkalázból előállított GPH-knál figyelték meg. Az alkalázzal végzett ultraszűréssel nyert komponensek azt mutatták, hogy a kisebb MW-értékű peptidek erősebb ACE-gátló aktivitást biztosítottak. A peptidfrakcióból (<1 kDa) három potenciális ACE-gátló peptidet (TNLDWY, RADFY és RVFDGAV) nyertünk LC-MS/MS módszerrel. Az RVFDGAV mutatta a legnagyobb ACE-gátló aktivitást 1,006 mM-os IC50-értékkel, és kompetitív inhibitornak tűnt. A molekuláris dokkolási eredmények azt mutatták, hogy a peptidek szilárdan kötődnek az ACE-hez, és további kölcsönhatásba lépnek az ACE aktív helyén lévő aminosavmaradványokkal. Eredményeink azt jelezték, hogy az alcaláz enzimatikus hidrolízisével nyert peptidek hatékony ACE-gátló aktivitást mutattak in vitro, ami potenciális jelöltekké teszi őket funkcionális élelmiszerek vagy vérnyomáscsökkentő gyógyszerek fejlesztésére a jövőben.

A szerzők hozzájárulása

F-FM, HW, C-KW és KT részt vettek a projekt tervezésében, elvégezték a kísérletek nagy részét, és megszerkesztették a kéziratot. Z-JW és LJ hozzájárult a kísérleti tervezéshez, a kézirat elkészítéséhez és benyújtásához. Minden szerző részt vett a kézirat megírásában és/vagy kritikusan átdolgozta azt a fontos szellemi tartalom miatt.

Finanszírozás

Ezt a tanulmányt az Anhui tartomány tudományos és technológiai főprojektjei (17030701024, 17030701058 és 17030701028) és Anhui tartomány kulcsfontosságú kutatási és fejlesztési projektje (1704g07020110 és 1804b06020347) támogatta.

Enyilatkozat az összeférhetetlenségről

HW az Anhui Habopharmqnceutical Co. alkalmazásában állt, Ltd. Z-JW az Anhui Qiangwang Seasoning Food Co., Ltd. alkalmazásában állt.

A többi szerző kijelenti, hogy a kutatást olyan kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolatok hiányában végezték, amelyek potenciális összeférhetetlenségként értelmezhetők.

Kiegészítő anyagok

A cikkhez tartozó kiegészítő anyagok online elérhetők a következő címen: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2018.01579/full#supplementary-material

Lábjegyzetek

1. ^ http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do