Isolation, characterization and toxicological potential of Alternaria-mycotoxins (TeA, AOH és AME) különböző Alternaria-fajokban India különböző régióiból

Az Alternaria-fajok gyűjtése és izolálása

A különböző indiai régiókból származó beteg növények fertőzött részeit, például leveleit, gyümölcseit és szárát gyűjtöttük össze és vittük a laboratóriumba. A levélmintákat 0,5%-os nátrium-hipoklorit-oldattal felületfertőtlenítettük, többször alaposan megmostuk steril desztillált vízzel (SDW), majd Petri-csészékben 3-4 napra burgonyadextróz-agar (PDA) táptalajra helyeztük. A fertőzött levéldarabokat tartalmazó PDA-lemezeket 28 °C-on inkubáltuk 12 órás világos/sötét fotoperiódus mellett 6-10 napig57. A bakteriális szennyeződés elkerülése érdekében sztreptomicint adtunk a táptalajhoz. A konídiumokat egyspórásan termeltük, hogy tiszta kolóniákat kapjunk, amelyeket sterilizált szűrőpapírra helyeztünk.

Patogenitási vizsgálat

A formae specialitások meghatározásához az izolátumok virulenciaanalízisét Alternaria-ra érzékeny paradicsomkultúrákon végeztük. Összesen 60 Alternaria izolátumot vizsgáltak patogenitás szempontjából. A paradicsommagokat nátrium-hipokloritban felsebezték, csapvízben leöblítették, majd levegőn szárították. A növényeket külön cserepekben termesztették. A fiziológiai feltételeket, mint például a hőmérsékletet és a páratartalmat a növények növekedéséhez 28-32 °C és 40-60% relatív páratartalom között tartottuk. Az inokulumok optimális koncentrációját tartottuk fenn (2 × 106 spóra/ml), és a levelek területére permeteztük. A kísérleti növényeket harmatkamrában tartottuk 8 órán át 25 °C-on. Ezeket a növényeket 2-3 napon keresztül rendszeresen ellenőriztük a fertőzés súlyosságát és a betegség fejlődését a beoltatlan kontrolllevélhez viszonyítva. A tünetek a spórák beoltása után 1 nappal kezdtek láthatóvá válni. A betegség súlyosságát a beoltást követő 1 naptól 6 napig vizsgáltuk. Az adatok statisztikai elemzése varianciaanalízissel (ANOVA) és Duncan-teszttel történt (P ≤ 0,05).

DNS-kivonás és a kórokozó azonosítása

A kórokozót kezdetben a morfológiai jellemzők, köztük a méret és az alak alapján azonosítottuk, és a konídiumok szerkezete alapján határozták meg, majd ITS-amplifikációval erősítették meg, az ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCCGG-3′) és ITS4 (5′-TCCTCTCCGCTTATTGATATATGC-3′) univerzális primerek segítségével, amelyek az ITS-régiókat és az 5.8S gének gombafajokat kódoló génjeit. A DNS extrakciót a Doyle és Doyle58 által javasolt módszer szerint végeztük. A 0,5 g liofilizált micellás szőnyeget 10 ml CTAB extrakciós pufferrel mozsárban és mozsárban ledaráltuk, majd vízfürdőben 65 °C-on 30 percig inkubáltuk. A mintát ezután azonos térfogatú hűtött kloroform/izoamilalkohol keverékkel kevertük össze, majd óvatosan összekevertük, és 10 000 rpm-en 10 percig 4 °C-on centrifugáltuk. Az így kapott felülúszót egyenlő térfogatú izopropanollal kevertük össze, és 2 órán át 4 °C-on hagytuk állni. A mintát ismét 10 percig 10 000 rpm-en centrifugáltuk 4 °C hőmérsékleten. A pelletet ezután 70%-os etanollal öblítettük, majd 4 órán át levegőn szárítottuk, hogy eltávolítsuk az alkohol nyomait. Az ITS rDNS reakciót 25 μl reakcióelegyben végeztük, amely 2,5 μl 10X reakciópuffert, 5 μl dezoxiribonukleotid-trifoszfátot (dNTP), valamint 1,0 μl ITS és 5,8 S régió univerzális forward primert (ITS1) és reverse primert (ITS4), 0,3 μl Taq DNS-polimerázt, 10-100 ng DNS-t és 2,5 μl MgCl2-t tartalmazott. A PCR optimalizált hőprofilja a következő volt: kezdeti denaturálás 95 °C-on 3 percig, denaturálás 95 °C-on 30 másodpercig, lágyítás 70 °C-on 30 másodpercig és végső hosszabbítás 72 °C-on 1 percig, további 40 ciklussal. Az amplifikációt 1%-os agaróz gélen igazoltuk 0,5X TBE pufferben, standard DNS molekulasúly markerrel párhuzamosan futtatva és UV-transzilluminátor alatt vizualizálva.

ITS szekvenciaelemzés

A kiválasztott izolátumok kapott ITS rDNS régióit tovább vágtuk és tisztítottuk a QIAquick PCR tisztító kit (QIAGEN, Németország) segítségével, a gyártó utasításainak megfelelően. A megtisztított termékeket végül a SciGenome Cochin, Kerala, India részére küldtük el szekvenálás céljából. A szekvenciákat NCBI BLAST segítségével összehasonlítottuk a GenBankban (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) található szekvenciákkal. A BLAST-elemzést teljes hosszúságú ITS-szekvenciákkal végeztük, mint lekérdezésekkel, hogy feltárjuk a publikált szekvenciákkal való kapcsolatokat. A legnagyobb homológiát és az összpontszámot feljegyezték a további elemzéshez. A jelen tanulmányban kapott szekvenciákat benyújtottuk a GenBankba. Az NCBI GenBank adatbázisából letöltöttük más formae speciale Alternaria törzsek ITS-szekvenciáit, amelyeket a filogenetikai elemzések során referenciaszekvenciaként használtunk. Az összes DNS-szekvenciát a BioEdit szekvencia-illesztési szerkesztő programban található Clustal W programmal59, 60 igazítottuk egymáshoz. Az így kapott többszörös illesztési fájlt használtuk a filogenetikai elemzésekhez, amelyeket a MEGA 5.0 programmal, 500 bootstrap ismétlést lehetővé tevő Neighbor-Joining módszerrel végeztünk61.

A toxinok kivonása az Alternaria fajokból

A toxikus metabolitok kivonását Andersen és munkatársai módszerének megfelelően végeztük62 , néhány módosítással. E fitotoxinok extrakcióit 20 napos kultúrák felhasználásával Potato Dextrose Broth (PDB) táptalajon végeztük. Minden Alternaria-kolónia közepéből három agar dugót (3 mm) vágtunk ki, és 200 ml PDB táptalajba oltottuk. A kórokozó kolóniáit dugófúróval (5 mm) vágtuk ki, majd a kolóniákat a PDB táptalajba oltottuk. A húsznapos kultúrákat vákuumszűrő géppel szűrőpapíron keresztül szűrtük. A tenyészetek szűrletéhez azonos mennyiségű metanolt adtunk, megfelelően összekevertük, és 24 órán át 4 °C-on tartottuk. Ezt követően a szűrletet kicsaptuk, és a metanolt 43 °C-on forgó vákuumkoncentrátorban (IKA® RV 10) szárazra pároltuk. A kivont szűrlethez azonos térfogatú etil-acetátot adtunk, és elválasztótölcsérben megfelelően elkevertük. Két fázist kaptunk, az egyik a szerves fázis, a másik a vizes fázis volt. A vizes réteget elválasztottuk és etil-acetáttal extraháltuk. Az etil-acetát kivonatot 44 °C-on vákuumpárologtatóban koncentráltuk és metanolban oldottuk.

Az Alternaria fitotoxin tisztítása és elválasztása oszlopkromatográfiával

A vegyületek tisztítását és elválasztását a Devi et al.63 módszerével végeztük, kisebb módosításokkal. Az oszlopkromatográfiát (CC) üvegoszlopon (700 mm × 30 mm) végeztük, állófázisnak pedig szilikagélt (100-120 szemű Merk) választottunk. A mozgófázis tiszta oldószerből vagy különböző oldószerekből állt, a feltételek követelményeitől függően. Az oszlopot az Alternaria fajok izolátumaiból kivont nyers komplexszel töltöttük meg. A toxikus metabolitok elválasztásához a mobilfázis kloroform: metanol (80:20 és 95:05), benzol: aceton: ecetsav (60:35:05) arányban állt, és gradiens elúciót alkalmaztunk. A CC-ből eluált különböző frakciókat vékonyréteg-kromatográfiával (TLC) választottuk szét, és HPLC-analízissel igazoltuk.

A fitotoxinok vékonyréteg-kromatográfiás (TLC) elemzése

A vékonyréteg-kromatográfiát (TLC) az azonosított Alternaria fajok nagy és kis spórái által termelt különböző fitotoxinok azonosítására használtuk. A TLC-t az Andersen et al.64 módszerével végeztük. Ebben a módszerben 4,5 g G254 szilikagélt (13% CaSO4 ½ H2O kötőanyagként) adtunk 25 ml kétszer desztillált vízhez, és üvegrúddal addig kevertettük, amíg a szilikagél iszapja nem képződött. Ezután az iszapot óvatosan üveglapra vittük, és biztonságos helyre helyeztük levegőn száradásra. A különböző fitotoxinok elválasztásához különböző mobil fázisokat használtunk a következő arányban: kloroform: metanol (80:20; v/v), benzol: aceton: ecetsav (60:35:5; v/v), kloroform: metanol (95:5; v/v), etil-acetát: benzol (95:5; v/v). Ezeket az oldószerkeverékeket ezután exszikkátorokba helyeztük, és 30 percig hagytuk, hogy a benne lévő környezet telítődjön. A TLC elvégzése előtt a szilikagéllel bevont üveglapokat 10 percre 60 °C-os sütőbe helyezve feltöltöttük. A töltés után 5 µl mintát pöttyöztünk az alaptól 2 cm-re lévő különböző pontokra. A minták bepöttyözése után a TLC-lemezeket néhány percig exszikkátorban szárítottuk. Az így kapott foltokat 0,2%-os etanolos vas(III)-kloridnak kitett TLC-lemezekkel fejlesztettük ki, és/vagy 365 nm-es UV-fényben vizualizáltuk. A TLC-lemezeket ezután egy éjszakán át levegőn szárítottuk, majd kiszámítottuk az Rf-értékeket. A különböző metabolitok azon foltjait, amelyek Rf-értékeit hasonlónak találtuk a standardok Rf-értékeivel, kikapartuk, HPLC minőségű metanolban feloldottuk és HPLC-analízisre használtuk.

HPLC-UV analízis

A standard előállítása

TeA (cat No: T1952), AOH (cat No: A4675) és AME (cat No: A4678) a Biogenuix-tól (LKT laboratories, Inc.) vásároltuk, New Delhi, India), és kristályosított formában használtuk fel a standard előállításához. A toxinok törzsoldatát (1000 µg ml-1) és egy külön munkaoldatot (10 µg ml-1) készítettünk HPLC minőségű metanolban, és -20 °C-on tároltuk a további felhasználásig. Ezeket a toxinokat standardként használtuk a HPLC-kalibráláshoz és egyéb további kísérletekhez az elkészített munkaoldatok hígításával.

HPLC-UV analízis feltételei

A HPLC-analízishez a mintákat kromatográfiásan elválasztottuk egy bázisdeaktivált (250 mm hosszú × 4.6 mm, 5,0 µm szemcseméret) C18 Waters Spherisorb, ODS2 oszlop (termékszám: PSS831915, USA), amelyhez védőoszlopot, Waters sorozatú rendszert (Waters, Waters Corporation, Milford, USA) csatlakoztattunk, amely UV-VIS detektorral (2998 PDA) és Waters 600E rendszervezérlővel rendelkezett. A 2998 PDA detektort 254 nm-re állítottuk be integrációs hullámhosszként. A minták befecskendezése a Waters 717plus autosampler (Waters Corporation, Milford, USA) 10 μl-es hurokjával történt. Az oszlopot és a védőoszlopot termosztatikusan 28 °C-on szabályoztuk. Az áramlási sebesség 0,70 ml/perc volt, a mobilfázis pedig 75%-ban HPLC minőségű metanolból (A oldószer), 25%-ban 0,1 M foszfátpuffer vizes oldatából (B oldószer) állt, amelyhez 1 literre 900 ml DW-t adtak, a pH 5,8 foszforsavval fenntartva. A készüléket lineáris izokratikus üzemmódban futtattuk, és a detektálást a 200-400 nm-es tartományban figyeltük. A HPLC-módszer megbízhatóságát az AME, TeA és AOH elemzésére a kimutatási határ (LOD) és a mennyiségi meghatározási határ (LOQ) segítségével validáltuk.

LC-MS/MS elemzés

Az Alternaria toxinok (AME, AOH és TeA) további megerősítésére kromatográfiás-tandem tömegspektrometriai (LC-MS/MS) módszert végeztünk Tölgyesi et al.65 kis módosításával. A módszer szilárd-folyadék extrakciót tartalmaz metanollal, majd a TeA, AOH és AME derivatizálását. Ezután a mintákat szilárd fázisú extrakcióval tisztították polimer alapú patronokon, végül a toxinokat LC-MS/MS módszerrel választották szét. Az LC-MS/MS elemzéshez a mintákat lépésenként készítettük el.

Reagensek, oldószerek és a standard előállítása

Az AME, AOH és TeA szárított analitikai kalibrálóit a Biogenuix-tól (LKT laboratories, Inc., New Delhi, India) vásároltuk. A standardokat 1,0 ml metanollal állítottuk vissza, hogy 0,1 mg ml-1 törzsoldatot kapjunk. Minden törzsoldatot 4 °C-on tartottunk. A 2,4-dinitrofenil-hidrazin (DNPH) és az undekanál a Sigma-Aldrich-tól származott. A derivatizáló reagens (0,58%-os DNPH HCl-oldatban) a Siegel et al.7 által leírtak szerint készült. A stop reagens 5% (v/v) undekanal volt metanolban. A derivált TeA, AOH és AME standardoldatokat (1,91 μg/ml, 2,54 μg/ml, illetve 2,71 μg/ml metanol) úgy készítettük el, hogy 1 ml 10 μg/ml metanolos TeA, AOH és AME oldatot 1 ml DNPH oldattal kevertünk. Az elegyet egy éjszakán át állni hagytuk, majd a mintaextrakció és SPE-tisztítás fejezetekben leírtak szerint dolgoztuk fel. A végső térfogatot metanollal 10 ml-re állítottuk be. Ezeket az oldatokat használtuk az elemzés LC-MS/MS körülményeinek optimalizálásához. Összesen 50 mM ammónium-formiát puffert készítettünk vízben, és pH-ját hangyasavval 3,0-ra állítottuk be. A metanol és az acetonitril a Sigma-Aldrich cégtől származó LC-MS minőségű volt. Az etil-acetát, n-hexán, diklórmetán, hangyasav és ammóniumformiát HPLC minőségű volt, és a Merck-től (Darmstadt, Németország) vásárolták. A Kinetex C-18 UPLC LG 500 oszlopot (3 × 100 mm, 2,6 μm), a Strata SPE patronokat (6 ml, 200 mg) és a regenerált cellulóz (RC) fecskendőszűrőket (15 mm, 0,45 μm) a Phenomenextől (Utrecht, Hollandia) szereztük be. A Supelco Ascentis Express C-18, ciano (ES-CN) és fenil-hexil HPLC oszlopokat (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) a Sigma- Aldrich cégtől vásároltuk. A módszer fejlesztéséhez használt standard toxinmintákat a Biogenuix-tól (LKT laboratories, Inc., New Delhi, India) vásároltuk. A mintákat az elemzésig -20 °C-on tároltuk.

Minták kivonása

A nyers metabolitok kivonását szolgáló mintákat oszlopkromatográfiás módszerrel tisztítottuk, a frakciókat eluáltuk és metanolban oldottuk. Minden frakcióból 50 ml mintát 50 ml-es polipropilén (PP) centrifugacsövekbe kevertünk, amelyeket ezután lezártunk. A mintákat 5 másodpercig örvénykeveréssel kevertük, majd egy CAT S50 rázógépen 600 min-1 sebességgel 45 percig szobahőmérsékleten vízszintesen ráztattuk. Ezután a csöveket 5000 rpm-en 10 percig 20 °C-on centrifugáltuk, majd a felső réteget egy új 50 ml-es PP centrifugacsőbe gyűjtöttük. 100 μl derivatizáló reagens (0,596% DNPH 2 mol/liter HCl-ben) került a mintához, majd 5 másodpercig vortexszel kevertük. A mintát 1 órán át környezeti hőmérsékleten derivatizálásra hagytuk. Ezután 500 μl 5%-os (v/v) undekanált adtunk metanolban, majd 5 másodpercig vortexszel kevertük. A mintát 30 percig állni hagytuk, majd a PP-csőben 35 ml-re hígítottuk 50 mM ammónium-formiát pufferrel (pH 4, hangyasavval beállítva). A mintát 5000 rpm-en 10 percig centrifugáltuk 20 °C-on, majd szilárd fázisú extrakciós tisztításnak vetettük alá.

Szilárd fázisú extrakciós (SPE) tisztítás

Strata-XL (200 mg, 6 ml, 100 μm) patronokat kondicionáltunk 6 ml metanollal, majd 6 ml vízzel és 6 ml 50 mM formiát pufferrel. A patronokra 75 ml-es tartályokat csatlakoztattunk, és a mintákat a tartályokba töltöttük. Ezután a mintákat cseppenként engedtük át. Ezután az SPE oszlopokat 6 ml metanol-víz (15/85, v/v), majd 6 ml n-hexánnal mostuk. A patronokat 5 percig vákuumban szárítottuk, mielőtt a mintákat 5 ml metanollal üvegcsövekbe eluáltuk. A mintákat 45 °C-on, enyhe nitrogénáram alatt szárazra pároltuk, majd 20 másodperces vortexkeveréssel újra feloldottuk 250 μl metanolban. Utolsó lépésként a mintákat regenerált cellulózszűrőn keresztül HPLC-flakonokba szűrtük.

Műszerek és berendezések

A módszer kifejlesztése Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2.7 μm) UPLC LG 500 nm-es rendszer (Accucore RP-MS 100 × 3,0 MM, 2,6UM, ACQ-TQD-QBB1152, Waters acuity PDA detektor, Waters Corporation, Milford, MA, USA), amelyhez egy MassLynx hármas négypólusú MS detektor (Waters, Milford, MA, USA) csatlakozott. Az adatgyűjtést és az értékelést a MassLynx 4.0 verziójával végeztük. A végleges módszert egy Thermo ACQ-TQD Quantum Ultra LC-MS/MS rendszerre (Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA) is átvittük, amely egy Waters acquity QSM bináris szivattyút (SN- L10QSM943A), egy Waters acquity fin autosamplert (SN-M10SDI443M), egy oszloptermosztátot és egy TQD Quantum Ultra hármas négypólusú MS detektort tartalmazott. Az oszlop célhőmérséklete 30 °C és a minta célhőmérséklete 10 °C volt. Az adatgyűjtést és az értékelést az Xcalibur 2.0.7 szoftverrel végeztük. SP1. Mindkét rendszer elektrospray interfésszel (ESI) volt felszerelve, amelyben az adatgyűjtés során kizárólag negatív ionizációt alkalmaztunk. Szárító- és ütközőgázként nitrogént használtunk. Az ionforrás paramétereit a kiegészítő S2. táblázat foglalja össze. A módszer átvihetőségét vizsgáltuk továbbá egy LC-MS/MS rendszerrel, amely egy Agilent 1100 HPLC-ből és egy AB Sciex 4000 tripla négypólusú MS-ből (Framingham, MA, USA) állt.

Készülékfeltételek

Az Alternaria-toxinokat egy Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) UPLC oszlopon választottuk el, amely 2,1 mm-es C-18 előoszloppal volt felszerelve, lineáris gradiens elúcióval. Négy oldószert (A, B, C és D oldószer) kevertünk a bináris szivattyúval. Az A oldószer acetonitrilt (ACN) + vizet (5:95), a B oldószer ACN: 5% izopropil-alkoholt (IPA), a C oldószer 100% metanolt, a D oldószer pedig tiszta ammónium-acetátot tartalmazott. Az áramlási sebesség 0,5 ml/perc volt. Az oldószerek mobil fázisa a kezdeti időben 0,0% A, 30% B, 30% C és 40% D volt. A végső időben (5 perc) az oldószerek 0,0% A, 30% B, 30% C és 40% D voltak. A gradiens programban elegendő mosási lépésre volt szükség a felhalmozódott lipofil mátrix oldott anyagok eltávolításához. A teljes elemzési idő 5 perc volt. Az oszlop termosztátja 30 °C-on tartotta a hőmérsékletet, az injektálási térfogat 1,0 μl volt. Az automatikus mintavevő 20 °C-on működött.

Az UPLC LG 500 nm-es rendszert egy negatív üzemmódban működő elektrospray interfészen (ESI) keresztül MS/MS detektorhoz (Micromass Quattro Ultima PT) kapcsoltuk. Az optimalizált ESI-beállítások a következők voltak: forráshőmérséklet 120 °C, deszolvációs hőmérséklet 350 °C, szárítógáz-áram 650 L/Hr, kúpgáz-áram 30 L/Hr és kapillárisfeszültség 3,50 kV. Szárító- és ütközőgázként nitrogént használtunk (2,67 × 10-6 bar). Az MS-ben a detektálás során többszörös reakciófigyelő (MRM) üzemmódot alkalmaztunk, és minden egyes céltoxin esetében két ionátmenetet pásztáztunk. Az MRM üzemmódot az MS/MS detektorban alkalmaztuk, és minden egyes célvegyülethez két ionátmenetet (mennyiségi és minősítő) rögzítettünk. A kiválasztott ionátmeneteket az optimalizált feszültségekkel (kúp- vagy csőlencse), ütközési energiákkal (CE) és tartózkodási időkkel a táblázatban foglaltuk össze (Kiegészítő S2. táblázat).

A különböző Alternaria mikotoxinok (TeA, AOH és AME)

A különböző mikotoxinok által kiváltott sejthalál mértékének mérése leválasztott levél beoltási módszerrel történt. Ehhez a friss levélmintákat leválasztottuk a növényházban termesztett növényekről, és 3-4 percig folyó csapvízben megfelelően megmostuk, majd 1,0%-os (0,01 g/ml) nátrium-hipokloritban kb. 1 percig sterilizáltuk, majd 70%-os etanollal felületen áttöröltük, végül steril desztillált vízzel aszeptikusan alaposan leöblítettük. Végül a leveleket nedvesített szűrőpapírra helyeztük, és steril tűvel megszúrtuk az alsó felületet. A toxinokat steril ionmentesített vízben 100 μg/ml koncentrációban oldottuk fel. Mindhárom toxinból cseppeket (100 µl) fecskendeztünk a sebzett levelekbe egy finom tűvel (Dispovan, 1 ml). A kontrollmintát steril desztillált víz befecskendezésével állítottuk be. A kezelt levélmintákat nedves kamrában (27 ± 0,5 °C hőmérséklet és 60% relatív páratartalom) tartottuk üvegházi körülmények között (14 órás világos és 10 órás sötét ciklus 27 °C-on). Rendszeres megfigyelést végeztünk (6 napon keresztül 24 óránként), hogy megállapítsuk, hogy a befecskendezett mintákban a toxikológiai hatások szempontjából releváns változásokat tapasztaltunk-e a kontrollmintákhoz képest. A kísérleti elrendezést három ismétlésben tartottuk fenn, és a mérgezés által kiváltott sejthalál miatt érintett levélfelület százalékos arányát (Systronic 211-es levélfelület-mérővel) mértük és az alábbi képlettel számoltuk ki.

A sejthalál meghatározása Evans kék felvételének vizsgálatával

A sejtek életképességének elvesztését (sejthalált) Evans kék festési módszerrel (Baker és Mock, 1994) értékeltük. A paradicsomleveleket mindhárom toxin azonos koncentrációjával (250 μg/ml) kezeltük. A kezelt leveleket 0,25%-os (v/v) Evans-kék vizes oldattal festettük meg 15 percig. Miután 30 percig desztillált vízzel mostuk, a leveleket kivágtuk és 500 µl N, N-dimetil-formamiddal áztattuk 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. A felszabadult Evans-kék optikai sűrűségét 600 nm-en spektrofotometriásan mértük.

Statisztikai elemzés

A statisztikai elemzést az IBM SPSS Statistics ver. 20 szoftver segítségével varianciaanalízissel (egyutas ANOVA), majd Duncan többszörös tartománytesztjével végeztük P ≤ 0,05 szignifikanciaszinten. Az adatokat az egyes metabolitok legalább három ismétlésének átlaga ± standard eltérés (SD) értékeként fejeztük ki. A statisztikai adatelemzéseket az Alternaria fajok kiválasztott 48 izolátumán elemeztük, amelyek patogén jellegűek voltak.