PEG-csapadék:

A pellet befogásának módszere jelentős hatással van az újraoldott termék tisztaságára. A kicsapási lépés könnyen skálázható és illeszkedik egy teljesen eldobható downstream folyamathoz.

Percivia LLC

Folyamatban vannak a törekvések a töltött ágyas kromatográfia alternatíváinak azonosítására, hogy csökkentsék a magas titerű termékáramok feldolgozásának idejét és költségeit. Bár sok erőfeszítés olyan membránadszorberekre összpontosít, amelyek közvetlenül helyettesítik az azonos vagy hasonló kémiai összetételű oszlopokat, néhány régebbi technológia kezd teret nyerni a rekombináns fehérjék gyártásában. A kromatográfia egyik vonzó alternatívája a kicsapás, amelyet a plazmafehérje-iparban már évek óta alkalmaznak.1 A kicsapás egyszerű módszere a folyamatfolyadéknak a kicsapni kívánt fehérje izoelektromos pontjáig történő titrálását jelenti.2 A liotróp sók, mint például az ammónium-szulfát, szintén régóta használatosak a kicsapási eljárásokban.3 A rövid láncú zsírsavak, mint például a kaprilsav, jól ismertek arról, hogy képesek kicsapni a DNS-t és a gazdasejt fehérjéket (HCP-k).4 A poliionos fajok szintén hasznos kicsapószerek az érdeklődésre számot tartó termék befogására vagy a szennyező fehérjék eltávolítására.5,6

A polietilénglikolt (PEG) használták a termék és a szennyeződések kicsapására.7,8 Izoelektromos kicsapással is kombinálható az elválasztás hatékonyságának javítása érdekében.9,10 A kicsapást követően centrifugálás vagy szűrés alkalmazható a szilárd-folyadék elválasztáshoz.11 Bár a centrifugálás jól bevált módszer az elválasztás elérésére, a termék pelletjének mosása a szennyeződések eltávolítása érdekében problémás lehet, és nem alkalmas egyszer használatos eljárásra. A szűrés – normál vagy érintőleges áramlású – több fejlesztést igényel, de a pellet mosása egyszerűbb, és könnyen adaptálható egyszer használatos folyamathoz.

Ezekben a munkákban egy PEG-et használó termékkiválasztási lépést fejlesztettek ki egy monoklonális antitest (MAb) kinyerésére a tisztított PER.C6 sejttenyésztési közegből. A megfelelő kicsapási feltételeket teljes faktoriális kísérleti tervek alkalmazásával azonosították. Két szűrési lépést értékeltünk a kicsapott termék befogására és mosására, és a jobb módszert 10-szeresére méreteztük. A teljes kicsapási folyamat körülbelül 90%-os hozamot és 1 LRV HCP-csökkentést eredményezett, az újraoldott MAb aggregátumszintjének jelentős növekedése nélkül. Végezetül megvizsgáltuk a kicsapási lépés hatását az azt követő kationcsere (CEX) befogási lépésre.

Az anyagok és módszerek Reagensek

USP minőségű sókat, Tween 20-at, sósavat, ecetsavat és nátrium-hidroxidot a JT Baker (Phillipsburg, NJ) cégtől vásároltunk. A PEG reagens minőségű volt, és a JT Baker-től vagy az EMD Chemicals-tól (Gibbstown, NJ) vásárolták. Minden puffert MilliQ minőségű vízzel (Millipore, Billerica, MA) készítettünk, és felhasználás előtt 0,22 µm-es szűréssel szűrtük.

Feedstock

A humán MAb (IgG1, pI = 8,3, 150 kDa) a Percivia, LLC-nél készült PER.C6 sejtvonal felhasználásával. A PER.C6 sejtek az 5,994,128 számú amerikai szabadalomban leírtak szerint adenovírus E1 génnel immortalizált humán embrionális retinasejtek.12 A sejteket standard fed-batch eljárással vagy XD eljárással tenyésztették, mindkettő kémiailag definiált táptalajt használ.13,14 A fed-batch médiumokat ülepítéssel és mélyszűréssel tisztították, az XD médiumokat pedig az ECS (enhanced cell settling) módszerrel, majd mélyszűréssel tisztították.15 Az ECS során Silica-PEI gyantát használtak a sejtek ülepítésének fokozására, valamint a DNS és a HCP csökkentésére.

A kicsapási feltételek optimalizálása

A MAb kicsapásához használt feltételeket – PEG molekulatömeg, PEG koncentráció és pH – teljes faktoriális kísérleti tervekkel optimalizáltuk Minitab szoftver (State College, PA) segítségével. A tisztított XD közeg pH-ját 2 M Trisszel állítottuk be a kívánt szintre egy 15 ml-es kúpos csőben. A PEG-t 40%-os (w/w) törzsoldatként adtuk hozzá a kívánt végső koncentrációig. Ezután a csövet 1000 g-nél centrifugáltuk, és a felülúszót dekantáltuk. Végül a pelletet újra feloldottuk foszfáttal pufferelt sóoldatban (PBS).

Pellet befogása mélyszűréssel vagy mikroszűréssel

Mélyszűrést végeztünk különböző minőségű szűrőközegekkel. A Millistak+HC D0HC, C0HC és X0HC a Millipore Corp. (Billerica, MA), a ZetaPlus 60SP02A-t pedig a Cuno (Meriden, CT) cégtől vásároltuk. A kicsapást a PEG-3350 40%-os (w/w) törzsoldatával végeztük, és a kicsapott közeget 50 L/m2 /h betáplálási fluxus mellett töltöttük, amíg az összes anyag be nem töltődött, vagy a transzmembránnyomás (TMP) el nem érte a 15 psid értéket. Ezután a szűrőket 20-30 L/m2 20 mM Tris pH 8,5 + 14,4% (w/w) PEG-3350-gyel mostuk. A mosás után 80 L/m2 reszolubilizáló puffert engedtünk át a szűrőkön 100 L/m2 /h sebességgel, és a permeátumot 600 L/m2 /h sebességgel keringtettük vissza a készüléken mindaddig, amíg a permeátum-medence A280 értéke stabil nem lett, ami a MAb teljes feloldódását jelzi. Végül a visszatartott terméket 20 L/m2 pufferöblítéssel és a szűrőmodul levegővel történő kifúvásával visszanyertük. Néhány vizsgálatban a szűrőközeget ezt követően 85 mM acetáttal pH 5,3, majd 1 M NaCl-lal mostuk. A nyomás- és áramlási adatokat az ARC Technology Services (Nashua, NH) egyedi fejlesztésű rendszerével gyűjtötték.

A mikroszűrést a GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ) 0,22 µm-es üreges szálas membránjával végeztük. A PEG-3350-et a kisléptékű kísérlethez 40%-os (w/w) törzsoldatként, a scale-up munkához pedig por alakban adtuk hozzá. A betáplálási fluxus 710 L/m2 /h volt, a retentátum és a permeátum pedig korlátlan volt. A csapadékot először 10- 14-szeresére koncentráltuk, majd három térfogatnyi 20 mM Tris pH 8,5 és 14,4% (w/w) PEG-3350 diaszűrővel mostuk. Végül a csapadékot újra feloldottuk 85 mM nátrium-acetát pH 5,3-ban vagy 20 mM Tris plus 50 mM NaCl pH 7,5-ben. A nyomás, az áramlás és a vezetőképesség adatait egy Slice 200 asztali rendszerrel (Sartorius, Gottingen, Németország) gyűjtöttük a kisléptékű vizsgálatokhoz és egy SciPro rendszerrel (SciLog, Middleton, WI) a méretnövelési kísérlethez.

Kationcserélő kromatográfia

A Toyopearl GigaCap S-650-et a Tosoh Bioscience-től (Montgomeryville, PA) szereztük be Toyoscreen 5 ml-es formátumban. Ezt a gyantát korábban már bizonyították, mint nagy kapacitású befogási lépést MAb-ok számára.16 Az oszlopot 74 mM nátrium-acetáttal egyensúlyozták pH 5,3-mal, és 90-95 mg-MAb/mL gyantával töltötték meg, vagy tisztított közeggel, vagy tisztított és PEG-kezelt anyaggal, mindkettőt az egyensúlyozási pufferrel azonos pH-ra és vezetőképességre állítva. Ezután az oszlopot ekvilibrációs pufferrel mostuk, majd az antitestet 50 mM nátrium-acetáttal pH 5,3 plusz 90 mM NaCl-lal eluáltuk.

Analitikai technikák

A médiumot tartalmazó minták MAb-koncentrációját analitikus Protein A HPLC-vel (Applied Biosystems, Foster City, CA) határoztuk meg. Az aggregátumszintet méret-kiválasztásos kromatográfiával (SEC) mértük a Tosoh Bioscience (Montgomeryville, PA) TSKgel G3000SWXL oszlopának használatával, a csúcsok detektálása UV abszorbanciával történt 280 nm-en. A HCP-szinteket a Cygnus Technologies (Southport, NC) PER.C6-specifikus ELISA-jával számszerűsítettük. Az SDS-PAGE vizsgálatot NuPAGE 4-12%-os Bis-Tris gélekkel, a festést pedig SimplyBlue SafeStainnel végeztük, mindkettő az Invitrogen (Carlsbad, CA) cégtől.

Eredmények és megbeszélés Csapadékképzési körülmények

A PEG mindkét molekulatömege, 3350 és 6000 Da esetében a PEG koncentrációja volt a domináns tényező az újraoldott MAb visszanyerése és tisztasága szempontjából. A PEG-3350-gyel történő kicsapás eredményezte a legnagyobb visszanyerést (1. ábra). A nagyobb visszanyerés azonban az újraoldott MAb nagyobb HCP-terhelésének rovására ment. Az aggregált MAb esetében a szintek nem különböztek jelentősen a kiindulási anyagtól, de meg kell jegyezni, hogy az ebben a munkában használt MAb nem hajlamos aggregátumok kialakítására. A HCP-csökkentés javulását a PEG-6000 használatával ellensúlyozta a termékhozam csökkenése. A kiválasztott végső feltétel 14% (w/v) PEG-3350 (ami 14,4% w/w-nek felel meg) és pH 8,5 volt.

1. ábra

Pellet befogása mélyszűréssel

Az első kísérletben az ECS-tisztított XD közeget kicsapattuk, és a pelletet X0HC közeggel mélyszűréssel befogtuk. A 361 g-MAb/m2 betöltése során nem figyeltük meg a transzmembránnyomás (TMP) jelentős növekedését (az adatok nem láthatóak). A mosást követően az immobilizált pellet reszolubilizálását 85 mM acetáttal végeztük, pH 5,3 pH-val. Az antitest még 2 órás recirkuláció után sem oldódott fel teljesen, ezért 0,1% v/v Tween 20-at adtunk a reszolubilizáló pufferhez. További 30 perc reszolubilizálás után az MAb teljesen feloldódott.

1. táblázat. A hozam és a szennyeződések eltávolítása a PEG kicsapási műveletnél, amely során X0HC mélységi szűrést alkalmaztunk a termék visszanyerésére

A tömegmérleg-adatokat az 1. táblázatban foglaltuk össze. A HCP-csökkentés alacsonyabb volt, mint az előző kísérletben (1. ábra), ahol csak 5000 ppm HCP volt a végső medencében, míg ebben a kísérletben 8300 ppm. Egyes mélységi szűrőkről azonban ismert, hogy hidrofób és anioncserélő (AEX) adszorpciós tulajdonságokkal rendelkeznek.17 A kicsapott közeget viszonylag magas pH (8,5) és alacsony vezetőképesség (<10 mS/cm) mellett töltöttük be, ami a savas fehérjék kötődését idézhette elő az AEX mátrixon. Továbbá PEG jelenlétében az ioncserélő mátrixok fehérjekötő kapacitása bizonyítottan növekszik.18,19 Ezért valószínű, hogy a kicsapás után oldatban maradt HCP-k egy része a mélyszűrő közeghez kötődött, és a reszolválás során eluálódott a termékbe. Ezt a hipotézist támasztja alá a kicsapási felülúszó és a mélységi szűrő átfolyása HCP-tartalmának különbsége is (9 900 vs. 240 mg), ami arra utal, hogy a HCP-ket a mélységi szűrő eltávolította az oldatból. Az antitest mélységi szűrőre történő immobilizálását követően az antitest jelentősen alacsonyabb pH-n (5,3) oldódott újra, ami a kötött HCP elúcióját eredményezte, és csökkentette a végtermék tisztaságát. Ez a jelenség enyhíthető kevésbé adszorpciós mélységi szűrőközegek, például Millistak+HC D0HC/C0HC és ZetaPlus SP szűrők, például 60SP02A használatával, vagy a termék alacsony sótartalmú, magasabb pH-jú pufferben, például 20 mM Tris pH 7,5-ben történő újrafeloldásával.

2. ábra

Ezeket a stratégiákat úgy teszteltük, hogy kicsapott tápközeget töltöttünk D0HC, C0HC, X0HC és 60SP02A szűrőkre. Minden szűrőt azonos módon mostunk PEG/Tris pufferrel, de a rezolválás a Millipore szűrők esetében 20 mM Tris pH 7,5 plusz Tween 20, a Cuno szűrők esetében pedig 85 mM acetát pH 5,3 plus Tween 20 pufferrel történt. A Millipore szűrőket alacsony pH-jú pufferrel (85 mM acetát pH 5,3) és magas sótartalmú (1 M NaCl) pufferrel is strippeltük a termék visszanyerése után, hogy meghatározzuk, hogy a megkötött HCP-k eluálhatók-e. A 2. ábra azt mutatja, hogy valamennyi vizsgált szűrőn jelentős mértékű volt a szennyeződés. Mivel a tápoldatot nem tisztították ECS-módszerrel, amelyről kimutatták, hogy jelentősen csökkenti a DNS-szintet az XD-szüretekben, több DNS lehet jelen, amely magas PEG-koncentrációban kicsapódik.20 A csapadék magasabb DNS-tartalma csökkenthette a szűrők kapacitását, de ezt nem vizsgálták. A 2. táblázat azt mutatja, hogy mindegyik kísérlet jobb HCP-csökkentést eredményezett (84-88% versus 46%), és bár a kiindulási HCP-terhelés magasabb volt (49 000 ppm versus 13 000 ppm), az újrafeloldott MAb-medencék HCP-tartalma általában alacsonyabb volt (6000-7 800 ppm versus 8300 ppm). Úgy tűnik, hogy az alacsony adszorpciós képességű szűrők használata és a magasabb pH-jú pufferben történő újrafeloldás megoldja a mélységi szűrőközegből eluálódó HCP-k problémáját. A szalagfrakciók SDS-PAGE vizsgálata kimutatta, hogy mind a HCP-k, mind a termék kötődött a szűrőkhöz – beleértve a kevésbé adszorpciós D0HC és C0HC szűrőket is -, és megerősítette, hogy az X0HC közegek adszorpciósabbak, mint a D0HC és C0HC közegek (3. ábra).

2. táblázat. A hozam és a szennyeződések eltávolítása a PEG kicsapási műveletnél, amely mélyszűrést alkalmaz különböző szűrőközegekkel a termék visszanyerése érdekében

Pelletfogás mikroszűréssel

Bár az újraoldott MAb HCP-terhelése csökkent a magasabb pH-jú puffer és a kevésbé adszorptív mélyszűrőközegek használatával, a mélyszűrők kapacitása alacsony volt a betáplált kötegelt közegek esetében (<400 g-MAb/m2 ). A mikroszűrést (tangenciális áramlású szűrés, MF TFF) a kapacitás javítása céljából teszteltük, azzal a további előnnyel, hogy az üreges szálak alacsony kötődési jellemzője miatt bármilyen puffert használhatunk a reszolváláshoz. Az MF TFF koncentráció és az adagolt csapadék mosásának hidraulikai teljesítményét a 4. ábra mutatja. A permeátum fluxus körülbelül 100 L/m2 /h volt, a TMP pedig 1,0 és 2,5 psid között volt a teljes művelet során. A 475 g-MAb/m2 tömegterhelés jobb volt, mint bármelyik mélyszűrési művelet során elért érték. A termék visszanyerése és a HCP-csökkentés egyaránt 90% körüli volt, ami valamivel jobb, mint a mélyszűrésnél elért érték (3. táblázat).

3. ábra

A reszolválás sokkal egyszerűbb és gyorsabb volt, mint a mélységi szűrésnél; ahelyett, hogy puffert keringtettünk volna a készüléken keresztül, a puffert a lumenek belsején keresztül pumpáltuk a retentátumtartályba, a permeátumot lezárva, és hagytuk, hogy körülbelül 60 percig keveredjen. Ez elegendő volt az ellenanyag újrafeloldásához, és nem volt szükség segédanyagokra. A mélységi szűréssel történő feloldás nehézségei miatt a terméket a tápközegben lévő koncentráción vagy annak közelében oldottuk fel újra. Az MF TFF-eljárásból származó végső pool közel kétszer olyan koncentrált volt, mint a kiindulási anyag.

4. ábra

Mivel a retentátum és a permeátum a légköri nyomás felé nyitott volt, minimális műszerezettségre volt szükség: egy keresztáramú szivattyúra, egy nyomásérzékelőre és egy átvezető szivattyúra a diafiltrációhoz. A nagy kapacitás, a nagy visszanyerés és a HCP-tisztítás, valamint az üzemeltetés egyszerűsége kombinációja az MF TFF-et a mélyszűréshez képest előnyösebb megoldássá teszi a pelletgyűjtésre. A kicsapási és MF TFF lépést 10-szeresére méretezték egy 0,12 m2 -es üreges szálas készülékre, és a teljesítmény hasonló volt a kis léptékhez (4. táblázat).

3. táblázat. A kihozatal és a szennyeződések eltávolítása a mikroszűrést alkalmazó PEG kicsapási műveletnél a termék visszanyerésére bench scale

Kationcserélő kromatográfia

Nagy kapacitású kationcserélő (CEX) kromatográfiát vizsgáltunk PEG kicsapással vagy anélkül előkezelt tápokkal. A kicsapási lépésnek nem volt jelentős hatása a lépés hozamára vagy a HCP-k százalékos csökkentésére, de a kicsapott töltetanyagból származó eluátum hétszer kevesebb HCP-t tartalmazott (5. táblázat).

4. táblázat. Terméshozam és szennyezőanyag-eltávolítás a mikroszűrést alkalmazó PEG kicsapási műveletnél a termék visszanyerésére kísérleti léptékben

Következtetések

A kicsapást már régóta alkalmazzák a plazmafehérje-iparban a fehérjék nagy léptékű tisztítására. A technikát itt adaptáltuk a tisztított feed-batch és XD közegekből történő kezdeti MAb-tisztításhoz, méretezhető módon. Két egyszer használatos szűrési lépést dolgoztunk ki a kicsapott termék befogására és mosására, kiküszöbölve a centrifugálás szükségességét. Kimutatták, hogy a kicsapási művelet nem befolyásolta negatívan a CEX befogási lépés hozamát, és hétszeresére csökkentette az eluátum HCP-tartalmát.

5. táblázat. Kicsapott (+PEG) és nem kicsapott (âPEG) antitesttel töltött GigaCap S-650 hozama és HCP-eltávolítása

A tisztítási láncban a szennyezőanyag-terhelés ilyen messzemenő csökkentésének képessége kulcsfontosságú a downstream folyamat lerövidítéséhez vagy a hagyományos kromatográfia más egyszer használatos technológiákkal való helyettesítéséhez. Az alacsonyabb szennyezőanyag-terhelés javíthatja az átfolyó membránadszorberek és esetleg a vírusszűrők terhelhetőségét, amelyek általában nagyon drága elemek a folyamatban.

Egy további előnye, hogy az antitestet újra fel lehet oldani egy pufferben, ami megkönnyíti a következő egység működését. Például a sejttenyésztési médiumok általában kiterjedt titrálást és hígítást vagy UF-DF lépést igényelnek a kationcserélővel történő befogási kromatográfiához való előkészítéshez. Itt a kicsapott antitest nagy koncentrációban feloldható az ekvilibrációs pufferben, így lerövidül a feldolgozási idő. Ez fontos lehet olyan termékek esetében, amelyek nem tűrik az alacsony pH/kondenzitási körülményeknek való hosszú kitettséget. Az adott antitest esetében a tisztított közeg több mint kétszeres hígítást igényel a CEX-oszlopra való betöltéshez, míg az újrafeloldott MAb közvetlenül a be nem állított közeg koncentrációjának közel kétszeresével tölthető be. Ez a betöltési mennyiség legalább négyszeresét jelenti, ami a modern, nagy kapacitású CEX-gyanták esetében jelentős időmegtakarítást eredményezhet.

Köszönet

A szerzők köszönetet mondanak a Percivia fehérje- és analitikai tudományoknak a munka során nyújtott vizsgálati támogatásért, valamint a Percivia upstream folyamatfejlesztési csoportjának a sejttenyésztési közegek biztosításáért.

Védjegyre vonatkozó megjegyzés

APER.C6 a Crucell Holland BV Corporation bejegyzett védjegye; az XD a DSM NV bejegyzett védjegye; az ECS pedig a DSM NV bejegyzett védjegye. Minden más márkanév a megfelelő tulajdonosok védjegye.

MICHAEL KUCZEWSKI I. tudós, EMILY SCHIRMER, PhD, II. tudós, BLANCA LAIN, PhD, vezető tudós és GREGORY ZARBIS-PAPASTOITSIS, PhD, vezető igazgató, mindannyian a downstream folyamatfejlesztésben, Percivia LLC, Cambridge, MA, 617. 301.8821, [email protected]@percivia.com

1. Cohn EJ, Strong LE, Hughes WL, Mulford DJ, Ashworth JN, Melin M, et al. A szérum- és plazmafehérjék előállítása és tulajdonságai. IV. A biológiai szövetek és folyadékok fehérje- és lipoproteinkomponenseinek frakciókra történő szétválasztására szolgáló rendszer. J Amer Chem Soc. 1946;68(3):459-75.

2. Van der Wielen L, Hofland G, Ottens M, Gulobovic M, Witkam G-J. Fehérje alapú struktúrák előállítása illósav felhasználásával. In: Az Amerikai Kémiai Társaság 224. nemzeti találkozója. Boston, MA; 2002.

3. Habeeb A, Francis R. Humán immunglobulin előállítása ammónium-szulfátos kicsapással. Vox Sanguinis. 1976;31:423-34.

4. Wang J, Diehl T, Aguiar D, Dai X-P, Arunakumari A. A folyamatból származó szennyeződések kicsapása antitestek nem fehérje A tisztítási sémáiban. BioPharm Int. 2009 Oct suppl, Downstream Processing 2010: Embracing Innovation;4-10.

5. McDonald P, Victa C, Carter-Franklin JN, Fahrner R. Szelektív antitest kicsapás polielektrolitok alkalmazásával: A monoklonális antitestek tisztításának új megközelítése. Biotechnol Bioeng. 2009;102(4):1141-51.

6. Moya W, Jaber J, Moya W, feltalálók; Millipore Corp. jogutód. Proteinek tisztítása. Amerikai Egyesült Államok szabadalma US WO/2008/079280. 2006.

7. Polson A, feltaláló; South African Inventions Development Corporation, jogutód. Fehérjetartalmú anyagok keverékeinek frakcionálása polietilénglikol felhasználásával. Amerikai Egyesült Államok szabadalma US 3415804. 1968.

8. Giese G. Monoklonális antitestek polietilénglikolos kicsapása és annak hatása az oszlopkromatográfiára. In: BioProcess Int. Raleigh, NC; 2009.

9. Thrash S, Otto J, Deits T. Kétértékű ionok hatása a fehérjék polietilénglikollal történő kicsapására: hatásmechanizmus és alkalmazások. Fehérje expresszió és tisztítás. 1991;2(1):83-9.

10. Ramanan S, Stenson R, Ramanan S, feltalálók; Amgen, jogutód. Módszer antitestek izolálására kicsapással. Amerikai Egyesült Államok szabadalma US 2008/0214795 A1. 2008 2/13/08.

11. Venkiteshwaran A, Heider P, Teysseyre L, Belfort G. Immunoglobulinok szelektív kicsapással támogatott kinyerése szarvasmarha szérumból kontrollált szennyeződésű keresztáramú membrán mikroszűréssel. Biotechnol Bioeng. 2008;101(5):957-66.

12. Fallaux FJ, Hoeben RC, Eb AJvd, Bout A, Valerio D, Fallaux FJ, Hoeben RC, feltalálók; IntroGene B.V, jogutód. Génterápiában felhasználható humán rekombináns adenovírusok csomagolási rendszerei. Amerikai Egyesült Államok szabadalma US 5994128. 1997.

13. Golden K, Bragg C, Chon J. Az XD eljárás: magas titerű eljárás kifejlesztése PER.C6 sejtekhez. In: Az Európai Állati Sejttechnológiai Társaság 21. találkozója. Dublin, Írország; 2009.

14. Chon J. Fejlemények a PER.C6 humán sejtvonal felhasználásával a platformon történő etetett fogási és XD előállítási folyamatokban. Wilbio Waterside Conference; 2009. április 20-22.; South San Francisco, CA.

15. Schirmer EB, Kuczewski M, Golden K, Lain B, Bragg C, Chon J, et al. Extrém sűrűségű sejttenyészetek elsődleges tisztítása fokozott sejtülepítéssel. Bioprocess Int. 2010;8(1):32-9.

16. Lain B, Cacciuttolo MA, Zarbis-Papastoitsis G. Kationcserélő kromatográfián alapuló nagy kapacitású MAb-felfogó lépés kifejlesztése. Bioprocess Int. 2009;7(5):26-34.

17. Yigzaw Y, Piper R, Tran M, Shukla AA. A mélységi szűrők adszorpciós tulajdonságainak kihasználása a gazdasejtfehérjék eltávolítására monoklonális antitestek tisztítása során. Biotechnol Prog. 2006;22:288-96.

18. Milby KH, Ho SV, Henis JMS. Fehérjék ioncserélő kromatográfiája: a mobilfázisban lévő semleges polimerek hatása. J Chromatogr. 1989;482:133-44.

19. Gagnon P, Godfrey B, Ladd D. Módszer egyedi szelektivitások elérésére ioncserélő kromatográfiában szerves polimerek mobilfázishoz való hozzáadásával. J Chromatogr A. 1996;743:51-5.

20. Paithankar KR, Prasad KS. A DNS kicsapása polietilénglikollal és etanollal. Nucleic Acids Research.1991;19(6):1346.