PLOS ONE
Discussion
A kemoterápiás gyógyszerek többsége kifejezetten a DNS-szintézis, a sejtanyagcsere és a sejtosztódás megzavarására szolgál. E hatásmód miatt ezek a gyógyszerek várhatóan többféle mutációt okoznak . A kemoterápiás gyógyszerek mutagén hatása a normális sejtekre az egyik legsúlyosabb probléma a kemoterápiában a másodlagos rosszindulatú daganatok és rendellenes reprodukciós eredmények, mint például a Down-, Klinefelter- és Turner-szindrómák előidézésének lehetősége miatt. Ezért elengedhetetlen a kemoterápiás gyógyszerek normál sejtekre gyakorolt mutagén hatásának meghatározása. A mikronukleusz tesztet széles körben használják a javítatlan genomkárosodás mérésére, és a megnövekedett MN gyakoriság előrejelzi a rák kockázatát emberekben . Mivel az MN származhat kromoszómatörésből (klasztogenitás) vagy elmaradt kromoszómákból (aneugenicitás), az MN kimutatása alkalmas lehet a numerikus kromoszóma-rendellenességek indukciójának szűrésére, ha olyan vizsgálatokat is bevonnak, amelyek lehetővé teszik az MN-en belüli teljes kromoszómák azonosítását, mint például a FISH-teszt.
Az epirubicin mitózis alatti klasztogén aktivitását in vivo a csontvelői MN-teszt segítségével jelentették . Jelenleg az epirubicin által kiváltott MN eredetét még nem határozták meg. Ezért a jelenlegi vizsgálat célja annak vizsgálata volt, hogy az epirubicin képes-e aneuploidia kiváltására hím egerek szomatikus és csírasejtjeiben. A módszer hatékonyságának meghatározásához két modellmutagént, a kolhicint és a mitomicin C-t, amelyek aneugenikus, illetve klasztogén hatásukról ismertek, használtuk pozitív kontrollként. Az MNPCE megfigyelt eredményei és a jelek MN-enkénti eloszlása a kontroll és a két pozitív mutagén esetében a jelen vizsgálatban jól megfelelnek a publikált adatoknak , . Ezek az adatok megerősítették a genotoxikus hatások kimutatásában követett kísérleti protokoll érzékenységét.
Az MN-vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy az epirubicin in vivo egér csontvelőben dózisfüggően növeli az MN-képződést (1. ábra) és a centromer-negatív és centromer-pozitív festett MN-ek számát, ami mind a klasztogenitás, mind az aneugenicitás indukciójára utal (2. ábra). Az epirubicin mind a klasztogén, mind az aneugenikus potenciálja a szomatikus sejtekben másodlagos tumorok kialakulásához vezethet. A klasztogenitásra vonatkozó eredmények megerősítik a korábbi in vivo vizsgálatok eredményeit, ahol az epirubicin kezelést követően hasonló dózistartományban az egér szomatikus sejtekben az MN-képződés és a strukturális kromoszóma-rendellenességek növekedését figyelték meg . E vizsgálatok eredményei megegyeznek az epirubicin által in vitro egér rákos sejtekben , az inkubált tyúktojások eritrocitáiban és a humán limfoblasztoid TK6 sejtvonalban korábban jelentett mikronukleusz indukcióval is . Ezenkívül korábban beszámoltak strukturális és numerikus kromoszóma-rendellenességek indukciójáról is az epirubicin-tartalmú kemoterápiában részesülő rákos betegeknél . Korábbi tanulmányok azt is kimutatták, hogy az epirubicin strukturális kromoszóma-rendellenességeket idéz elő tenyésztett HeLa sejtekben , strukturális és numerikus kromoszóma-rendellenességeket és kromatidacserét egy kínai hörcsög sejtvonalban , valamint kromoszóma-rendellenességeket epirubicin-tartalmú kezeléssel in vitro kezelt emlőrákos nők perifériás vérből származó limfocitakultúráiban .
Az embereken végzett vizsgálatok kimutatták, hogy bizonyos kemoterápiás kezelések növelik az aneuploidia gyakoriságát a csírasejtekben , , ami arra utal, hogy az ilyen betegeknél nagyobb lehet az abnormális reprodukciós eredmények kockázata, különösen a reproduktív korban. Ezért általános aggodalomra ad okot az aneuploidia kialakulásának kockázatának csökkentése, a csírasejtek aneogenitásának kimutatása és az ok-okozati mechanizmusok megértése. A jelenlegi vizsgálatban az aneuploidia meghatározását csírasejtekben spermium-FISH-teszttel végeztük, az egér 8, X és Y kromoszómákra specifikus DNS-szondákkal, amelyek mindegyike más-más színnel volt jelölve. A módszerek megbízhatóságának megállapítása érdekében pozitív kontroll anyagként a kolhicint használtuk, amelyről ismert, hogy túlnyomórészt aneogenikus, és a pozitív és negatív kontroll eredményei a korábbi vizsgálatokkal azonos tartományban voltak , -. Ezek az adatok megerősítették a kísérleti protokoll érzékenységét a vizsgált vegyületek aneuploidogén hatásainak kimutatásában.
Az epirubicin a sejtciklus S és G2 fázisában a legaktívabb, azonban a sejtciklus minden fázisában van némi kimutatható aktivitása . Gyakran jelentették, hogy az aneugenikus tulajdonságokkal rendelkező vegyi anyagok megváltoztathatják a sejtosztódás előrehaladását mind a meiotikus, mind a mitotikus sejtekben . A jelenlegi vizsgálatban a spermatocitákban a meiotikus osztódásoktól a mellékheréjű spermiumokig tartó fejlődési időt a BrdU-inkorporációs teszttel értékelték. Az eredmények egyértelműen azt mutatják, hogy az epirubicin 48 órával meghosszabbította a meiotikus osztódások időtartamát az egér spermatocitákban (3. ábra). Ezek a megfigyelések tehát megerősítik a korábbi eredményeket, miszerint az epirubicin által kiváltott topoizomeráz II funkció gátlása a sejtciklus különböző fázisaiban lelassítja a sejtciklus progresszióját és a sejtek G2/M fázisban való megállását okozza . Az ilyen G2/M megállás a G2 ellenőrzőpont gépezet indukciójának köszönhető, amely lehetővé teszi a sérült DNS javítását, mielőtt a sejtek a következő sejtciklus szakaszba lépnének .
Az epirubicinnek a meiózis során a nem-diszjunkcióra gyakorolt hatásáról szóló in vivo információ korlátozott, de bizonyos más antraciklinek, mint a doxorubicin és származéka, az idarubicin, megakadályozzák a kromoszómális szegregációt és jelentősen növelik a disomikus és diploid spermiumok gyakoriságát . Ezenkívül egy in vitro vizsgálat kimutatta, hogy a kínai hörcsögtenyészetek epirubicinnel történő kezelése számbeli aberrációkat idézett elő hipodiploidia és hiperdiploidia formájában . Ezenkívül az egér spermatogenezis áramlási citometriai és szövettani elemzése a DNS-hisztogram variációs koefficiensének növekedését mutatta ki, mint az aneuploidia mértékét, és a diploid spermatidák számának növekedését epirubicinnel történő kezelés után . A fent idézett jelentésekkel összhangban a jelen kísérlet azt mutatta, hogy az epirubicin expozíció jelentős dózisfüggő növekedést okozott a disomikus és diploid spermiumok gyakoriságában, és hogy az aneuploidia indukciója lineárisan dózisfüggő volt 0 és 12 mg/kg epirubicin között (4. ábra). Ezek az in vivo megfigyelések összhangban vannak egy korábbi, egészséges egyénekből és rákos betegekből tenyésztett humán limfocitákról szóló in vitro jelentéssel is, amelyben a doxorubicin expozíció a 7-es és 17-es kromoszómák triszómiáinak növekedését okozta . Továbbá Ganapathi és munkatársai arról számoltak be, hogy a HL-60 humán leukémiás sejtek, amelyek egyetlen kariotípusos változásként a 8-as monoszómiát hordozzák, doxorubicin expozíciót követően 7q21-es markereket szereztek. Ezenkívül citogenetikai eredmények kimutatták a 8-as triszómiát olyan betegeknél, akik antraciklin szisztémás kemoterápiában részesültek . Monoszómia 7, 7q- és kiegyensúlyozatlan transzlokáció, beleértve a 7-es kromoszómát is, volt megfigyelhető azoknál a betegeknél, akik antraciklin tartalmú kemoterápiában részesültek . Ezenkívül az 1., 9. és 16. kromoszóma strukturális kromoszóma-rendellenességeit is összefüggésbe hozták az antraciklin tartalmú kemoterápiás szerekkel .
A topoizomeráz II gátlók más osztályai közül az etopozidot vizsgálták korábban egér spermatocitákban , . E vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy az etopozid genotoxikus ágensként hat, és a pachytensejtek kezelése után aneuploidiát idéz elő elsősorban a meiotikus csírasejtekben. Másrészt Kallio és Lähdetie, azt találták, hogy az etopoziddal szembeni érzékenység egerekben a primer spermatociták diplotén-diakinesise során volt a legnagyobb, a késői pachytene során csökkent és a preleptotén szakaszokban alacsony; ez egy nagyon eltérő mintázat, mint a DNS-alkiláló vegyszerek esetében. Ezek a szerzők azt feltételezték, hogy az etopozid a rekombinált kromoszómakarok felbontásának kudarcát okozta, ami valószínűleg a sejtciklus leállásával és az apoptotikus útvonal beindításával járt együtt. Részletes citogenetikai vizsgálataikban Marchetti és munkatársai arról számoltak be, hogy a pachytene a spermatogenezis legérzékenyebb szakasza a strukturális kromoszóma-aberrációk és az aneuploidia indukciójára. Mivel Schmid és munkatársai, valamint Kallio és Lähdetie adatai azt tudták bizonyítani, hogy az etopozid meghosszabbította a meiotikus sejtciklust, lehetségesnek tűnik, hogy a Marchetti és munkatársai által a 24,5 napos párosodási csoportban az első hasadási osztódásokban észlelt hatások valójában egy későbbi szakaszban indukálódtak, ill. a meiotikus diakinesis, MMI vagy MMII során a pachytene helyett, ahogy a szerzők feltételezték.
A jelenlegi vizsgálatban spermium-FISH vizsgálatot terveztünk annak megállapítására, hogy a topoizomeráz II gátló epirubicin alacsony dózisával történő szubakut kezelésnek lenne-e hatása, mivel az epirubicin kezelésbe a korábbi profázis szakaszok is beletartoznak. A 0,25, 0,5 és 1 mg/kg epirubicin egyedi adagjait 12 egymást követő napon adták be, és 23 nappal az utolsó epirubicin kezelés után spermamintát vettek. A meiózis teljes profázisára alkalmazott 12 mg/kg epirubicin szignifikánsan növelte a diszomikus és diploid spermiumok gyakoriságát, míg a 3 és 6 mg/kg doxorubicin teljes dózisa negatív volt (5. ábra). Ezzel szemben az MMI/MMII során a spermatocitákra alkalmazott egyszeri 6 mg/kg epirubicin adag pozitív eredményt adott (4. ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a korábbi profázis-stádiumok viszonylag kevésbé járulnak hozzá az epirubicin által kiváltott aneuploiditáshoz a hímivarsejtekben.
A jelen vizsgálatban azt találtuk, hogy az epirubicin az autodiploid spermiumok (XX88 és YY88) számának észrevehető növekedését okozta. Az epirubicin kezelés után az MMII leállásából származó autodiploid spermiumok gyakoribbak voltak, mint az MMI alatti leállásból származó diploid spermiumok (XY88). Így a második meiotikus osztódás érzékenyebb volt az epirubicin kezelésre, mint az első meiotikus osztódás. Azt a következtetést, hogy a második meiotikus osztódások érzékenyebbek voltak az epirubicin kezelésre, mint az első meiotikus osztódások, a disomikus nemi kromoszómák megfigyelt gyakorisága is alátámasztja. Az XX8 vagy YY8 jelű spermiumok gyakoribbak voltak, mint az XY8 jelű spermiumok. Ezek a megfigyelések megerősítik, hogy a disomia vagy diploidia kimutatására szolgáló spermium-FISH vizsgálat képes mindkét meiotikus osztódás során kiváltott hatások kimutatására és a két meiotikus osztódás érzékenységének összehasonlítására, amint arról korábban beszámoltunk , .
A jelen spermium-FISH vizsgálatban azt találtuk, hogy a legkisebb pozitív dózis, amely disomikus vagy diploid spermiumot okoz, 6 mg/kg epirubicin volt. Az egér csontvelő MN vizsgálatok azonban azt mutatták, hogy a 3 mg/kg epirubicin expozíció az MNPCE jelentős növekedését eredményezte. Ez a megfigyelés arra utal, hogy a csontvelőben az MN kisebb dózisok mellett is kiváltható, mint a spermiumokban a disomia vagy diploidia. Ennélfogva a csontvelő az érzékenyebb szövet. A vizsgálatok azonban különböző végpontokat mérnek. A kromoszóma veszteséget és törést az MN vizsgálatban mérik, míg a nem-diszjungiót a spermium-FISH vizsgálatban detektálják. Ezért a jelen adatok megerősítik a veszélyértékelés általános paradigmáját, amely szerint a csontvelő MN-teszt pozitív eredménye a vegyület genotoxikus potenciálját jelzi a csírasejtekben. A kockázatértékelés szempontjából azonban fontos az aneuploidia számszerűsítése a csírasejtekben.
A DNS topoizomeráz inhibitorok egyértelműen hajlamosak kettősszálú DNS töréseket okozni, amelyek elsősorban centromér-negatív MN kialakulását eredményezik . Hasonlóképpen, annak kimutatása, hogy az epirubicin hatékony topoizomeráz II inhibitor, arra utal, hogy az epirubicin ezen a mechanizmuson keresztül váltja ki klasztogén hatásait. Az epirubicin metabolitjai aktiválhatják a sejteket a reaktív oxigénfajok intracelluláris termelésének fokozására is, amelyek stabil és diffúz formái károsíthatják a nukleáris DNS-t . Ha a sejtek javító mechanizmusai túlterheltek, a primer DNS-károsodás strukturális vagy numerikus kromoszóma-aberrációhoz vezethet, és végül tumorokat okozhat . Ezt a feltételezést támasztja alá az a tény, hogy azoknál az egyéneknél, akiknél az első rosszindulatú daganat kezelése után második rosszindulatú daganat alakult ki, a γH2AX intenzitásával mérve alacsonyabb volt a DNS kettősszál-törések javításának képessége, mint azoknál, akiknél nem alakult ki második rosszindulatú daganat . A centromer-pozitív MN epirubicin általi indukciója azt jelzi, hogy az epirubicin genotoxikus hatását más mechanizmuson keresztül is kiválthatja. Ez a megfigyelés aláhúzza az MN-teszt FISH-módosításának fontosságát az indukált MN eredetének meghatározásához. Az a lehetséges mechanizmus, amellyel az epirubicin aneugenikus hatását kifejtheti, a topoizomeráz II gátlásán keresztül valósulhat meg, ami a sejtosztódás során a kromoszómák szétválását eredményezheti. Ez azért következik be, mert a DNS topoizomeráz II szükséges a testvérkromatidák megfelelő szétválasztásához a sejtosztódás során, és hiányában mind a nem szétválás, mind a törés bekövetkezik. Így az epirubicin képes lehet gátolni a topoizomeráz II két kulcsfontosságú szerepét; az újonnan replikálódott kromoszómák megfelelő szétválasztásának képességét, valamint az átmeneti kettősszálú DNS-törések újraligálásában betöltött funkcióját.
Összefoglalva, az erythrocyte MN centromerikus DNS-szondával végzett FISH-teszt alkalmazásával kimutatták, hogy az epirubicin nemcsak klasztogén, hanem aneugenikus is szomatikus sejtekben in vivo. A BrdU-inkorporációs próbával kimutatták, hogy az epirubicin által okozott meiotikus késés körülbelül 48 óra. A sperma-FISH analízissel kimutatták, hogy az epirubicin a meiózis során aneuploidiákat idéz elő, amelyek diszomikus spermiumokat eredményeznek, valamint teljes meiotikus leállást, amely diploid spermiumokat hoz létre. Az autodiploid (XX88, YY88) és disomikus (XX8 vagy YY8) spermiumok előfordulása azt jelzi, hogy a második meiotikus osztódás érzékenyebb az epirubicinre, mint az első meiotikus osztódás. Az eredmények arra is utalnak, hogy a korábbi profázistádiumok viszonylag kevésbé járulnak hozzá az epirubicin által kiváltott aneuploidiához. Az epirubicin klasztogén és aneugenikus potenciálja egyaránt másodlagos daganatok kialakulásához és rendellenes reprodukciós eredményekhez vezethet az epirubicint tartalmazó gyógyszeres kezelésnek kitett rákos betegeknél és egészségügyi személyzetnél. Bár az epirubicin kevésbé szisztémás és szívtoxikus, mint a doxorubicin és más, azonos tumorellenes hatásspektrummal rendelkező antraciklinek , aneuploidogén és citotoxikus hatása van a nem daganatos sejtekben. A gyógyszer ezen aneuploidogén hatása lehet a felelős a rendellenes reprodukciós eredmények és másodlagos daganatok megjelenéséért, amelyeket néhány rákos betegnél valamikor az elsődleges daganatuk epirubicin-tartalmú kemoterápiával történő sikeres kezelése után észlelnek.