Proximity-Labeling MS (APEX-MS)

Ezzel a módszerrel az érdeklődő fehérjét egy peroxidázhoz (aszkorbinsav-peroxidáz; APEX) fuzionálják. H2O2-vel történő kezelés hatására az APEX az exogén módon adagolt biotin-fenolt biotin-fenoxil gyökké alakítja, ami a fehérje kovalens jelölését eredményezi 20 nm-es sugarú körben. Ezt követően a biotinilált fehérjéket Steptavidin segítségével dúsítjuk. Ez a technológia először teszi lehetővé, hogy egy adott időpontban “pillanatfelvételeket” készítsünk a helyi fehérjekörnyezetről, és rögzítsük az átmeneti fehérje kölcsönhatásokat. A közelségalapú jelölési módszerek az elmúlt néhány évben gyorsan fejlődtek, és bebizonyosodott, hogy a hagyományos affinitásalapú tisztítási módszereket (AP-MS) kiegészítő eredményekkel szolgálnak, így teljesen új kutatási utakat nyithatnak, és új betekintést nyújthatnak a fehérjék funkcióiba.

APEX-et egész organellák proteomjainak nagy időbeli felbontású megragadására használták, de a jelölés szélessége általában úgy gondolják, hogy kizárja a specifikus fehérjehálózatok lekérdezéséhez szükséges nagyobb térbeli felbontást. Erre a problémára a közelmúltban nyújtottunk megoldást a kvantitatív proteomika és a térbeli referenciák rendszerének kombinálásával. Ez az új módszer lehetővé teszi az ismert kötőpartnerek, valamint a korábban nem azonosított hálózati komponensek feloldását, amint azt nemrégiben egy elvi bizonyítékot tartalmazó tanulmányban mutattuk be, amely a G-fehérje-kapcsolt receptorok által bevont fehérjéket kérdezte le, amint azok dinamikusan jeleznek és közlekednek a ligandum-indukált aktiválásra válaszul.