Integrativní genomické analýzy APOBEC-mutačního podpisu, exprese a zárodečné delece genů APOBEC3 a imunogenicity u více typů rakoviny

Distinktivní vzorce genů APOBEC3, spojené s APOBEC-mutačním podpisem u více typů rakoviny

V návaznosti na předchozí analýzu APOBEC-mutačního podpisu jsme měřili mutace pomocí počtu deamináz C, které se nacházely v rámci mutací TCW trinukleotidového motivu změny na T nebo G na každý vzorek u 10 typů rakoviny (viz Metody). Provedli jsme univariační analýzy k vyhodnocení asociací APOBEC-mutačního podpisu s celkovými hladinami genové exprese APOBEC3A a APOBEC3B. Zjistili jsme, že úroveň exprese APOBEC3A pozitivně souvisí s APOBEC-mutačním podpisem celkem u šesti typů rakoviny – močového měchýře, prsu, děložního čípku, adenokarcinomu plic, hlavy a krku a štítné žlázy. U zbývajících typů nádorů nebyla pozorována žádná významná asociace, ačkoli byly pozorovány stejné směry asociace (doplňkový soubor 1: tabulka S1). Zajímavé je, že jsme pozorovali, že úroveň exprese APOBEC3B byla pozitivně asociována s APOBEC-mutačním podpisem u všech typů rakoviny, s výjimkou dlaždicového karcinomu plic (Additional file 1: Table S1). Ve srovnání s asociacemi z APOBEC3A byl APOBEC3B specificky asociován s APOBEC-mutačním podpisem u karcinomů žaludku, slinivky břišní a ledvin, a to s P = 5,2 × 10- 11, P = 2,0 × 10- 3, respektive P = 1,1 × 10- 4 (Additional file 1: Table S1). Tato zjištění byla v souladu s předchozími studiemi . Kromě toho jsme také hodnotili asociace APOBEC-mutačního podpisu s genovou expresí dalších genů APOBEC3 : APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3F, APOBEC3G a APOBEC3H. Naše výsledky ukázaly, že exprese těchto genů se v souvislosti s APOBEC-mutačním podpisem lišily u různých typů nádorů (doplňkový soubor 1: tabulka S2). Například exprese genu APOBEC3C byla spojena se zvýšeným APOBEC-mutačním podpisem u karcinomu děložního hrdla a karcinomu hlavy a krku, zatímco jeho exprese byla spojena se sníženým APOBEC-mutačním podpisem u karcinomu žaludku. Náš výsledek také ukázal, že exprese APOBEC3D, APOBEC3F a APOBEC3G byla spojena se zvýšeným APOBEC-mutačním podpisem, zatímco výsledek asociace APOBEC3G byl v souladu s předchozím zjištěním . Zajímavé je, že jsme pozorovali, že exprese APOBEC3H byla spojena se zvýšeným APOBEC-mutačním podpisem u karcinomu děložního čípku, ale nebyla pozorována u karcinomu prsu.

Rozdílné vzorce izoforem APOBEC3A a APOBEC3B, spojené s APOBEC-mutačním podpisem u více typů rakoviny

Dále jsme hodnotili asociace mezi APOBEC-mutačním podpisem a úrovní exprese jednotlivých izoforem přepisovaných z APOBEC3A a APOBEC3B. Celkem bylo analyzováno šest izoforem, včetně uc003awn a uc011aob transkribovaných z APOBEC3A, uc003awo, uc003awp a uc003awq transkribovaných z APOBEC3B a další izoformy, uc011aoc, odvozené z fúzní události zahrnující oblast pokrývající poslední intronik APOBEC3A až po poslední exon APOBEC3B (obr. 1a, b). Potvrdili jsme, že izoformy uc003awn a uc003awo byly primárně transkribovány z APOBEC3A, respektive APOBEC3B (Additional file 1: Figure S1) . Podle očekávání byl směr asociace hladin exprese uc003awn i uc003awo a mutačního podpisu APOBEC v souladu s pozorováním celkových hladin genové exprese napříč všemi typy nádorů (obr. 1c, d; doplňkový soubor 1: tabulka S3). Překvapivě hladina exprese uc011aoc (APOBEC3A/B) pozitivně souvisela s APOBEC-mutačním podpisem pouze u karcinomu prsu (P = 5,0 × 10- 10) (obr. 1e; Additional file 1: Table S3). U zbývajících izoforem však nebyla pozorována žádná asociace u žádného typu rakoviny, s výjimkou slabé asociace pozorované u uc011aob (APOBEC3A) s rakovinou hlavy a krku (P = 0,02; Additional file 1: Table S3).

Pomocí vícenásobné regresní analýzy, která zahrnovala všechny izoformy APOBEC3A i APOBEC3B, jsme zjistili, že hladiny exprese uc003awn (APOBEC3A) a uc003awo (APOBEC3B) byly nezávisle a běžně spojeny s hodnoceným APOBEC-mutačním podpisem u více typů rakoviny: (okrajová asociace pro uc003awn), prsu, děložního čípku, adenokarcinomu plic a hlavy a krku (tabulka 1). Podobně byla další asociace pro uc011awn (APOBEC3A) pozorována u štítné žlázy, zatímco asociace pro uc003awo (APOBEC3B) byly pozorovány u rakoviny žaludku, slinivky břišní a ledvin. V souladu s univariační analýzou byla nápadná asociace pro uc011aoc (APOBEC3A/B) s APOBEC-mutačním podpisem pozorována u karcinomu prsu (P = 5,3 × 10- 11) a další asociace byla pozorována také u adenokarcinomu plic (P = 0,01) (tabulka 1). Tato zjištění naznačují, že uc011aoc hraje tkáňově specifickou roli při ovlivňování APOBEC-mutačního podpisu především u karcinomu prsu, zatímco uc003awn a uc003awo hrají všudypřítomnou, ale odlišnou roli v celém spektru lidských nádorů. Pozoruhodné je, že naše dodatečná analýza prokázala pozitivní korelaci exprese mezi izoformou uc011aoc a APOBEC3A napříč hlavními typy rakoviny, zejména u rakoviny prsu (Additional file 1: Table S4).

Dále jsme provedli asociační analýzu stratifikovanou podle klinických podtypů u karcinomu prsu. Pozorovali jsme, že asociace izoforem uc003awn (APOBEC3A) a uc011aoc (APOBEC3A/B) s APOBEC-mutačním podpisem se liší napříč různými klinickými podtypy, přičemž nejvýznamnější asociace byla pozorována u podtypu LumA (Additional file 1: Table S5).

Zárodečná delece APOBEC3A/B ovlivňující hladiny exprese izoforem genů APOBEC3A a APOBEC3B

Zjistit, jak zárodečná delece APOBEC3A/B ovlivňuje expresi izoforem APOBEC3A a APOBEC3B, jsme nejprve identifikovali 30 vzorků, u nichž se předpokládá homozygotní delece, 239 vzorků, u nichž se předpokládá heterozygotní delece, a 2287 vzorků, u nichž se nepředpokládá žádná delece (doplňkový soubor 1: S6, viz Metody). Dále jsme hodnotili souvislosti mezi zárodečnou delecí APOBEC3A/B a hladinami exprese jednotlivých izoforem pomocí univariační analýzy (viz Metody). Podle očekávání jsme pozorovali, že zárodečná delece APOBEC3A/B byla významně spojena se sníženými hladinami exprese izoformy uc003awo (APOBEC3B) u všech typů rakoviny při P < 0,05, s výjimkou rakoviny slinivky břišní s P = 0,14. Významné asociace se sníženými hladinami exprese uc003awn (APOBEC3A) byly pozorovány také u tří typů rakoviny – močového měchýře, prsu a štítné žlázy (obr. 2; tab. 2). Naše výsledky naopak ukázaly, že zárodečná delece APOBEC3A/B byla významně spojena se zvýšenou hladinou exprese uc011aoc (APOBEC3A/B) u všech typů rakoviny, s výjimkou rakoviny žaludku, slinivky břišní a ledvin. U nich nebyla zjištěna statistická významnost, ale měly stejné směry asociace (obr. 2; tab. 2). Nejvýznamnější asociaci vykazoval zejména karcinom hlavy a krku s P = 3,8 × 10- 65 a karcinom prsu a močového měchýře s P = 3,0 × 10- 8, respektive P = 2,9 × 10- 7. V případě karcinomu prsu a močového měchýře byla asociace s P = 2,9 × 10- 7 nejvýznamnější. Kromě toho jsme provedli stejnou analýzu stratifikovanou podle populace a u těchto typů rakoviny byl pozorován podobný trend (údaje nejsou uvedeny). Naše zjištění naznačují, že téměř u všech zkoumaných typů nádorů byla zárodečná delece APOBEC3A/B významně spojena se sníženou hladinou exprese uc003awn a uc003awo, ale došlo ke zvýšení hladiny exprese uc011aoc.

Zárodečná delece APOBEC3A/B ovlivňující APOBEC-mutační podpis, neoantigenní zátěž a relativní složení imunitních buněk, konkrétně u karcinomu prsu

Předchozí studie ukázala, že zárodečná delece APOBEC3A/B je spojena se zvýšeným APOBEC-mutačním podpisem u karcinomu prsu, zatímco podobný vzorec, ale bez statistické významnosti, byl pozorován u mnoha dalších typů rakoviny, například močového měchýře . Pomocí univariační analýzy k vyhodnocení celkového vlivu zárodečné delece APOBEC3A/B na APOBEC-mutační signaturu jsme zjistili, že delece byla významně spojena se zvýšenou APOBEC-mutační signaturou pouze u karcinomu prsu (P = 5,6 × 10- 3; tab. 3; obr. 3a). U většiny ostatních typů nádorů však byl pozorován opačný trend, i když většina asociací nebyla statisticky významná (tab. 3). Konkrétně u karcinomu močového měchýře jsme pozorovali, že zárodečná delece APOBEC3A/B byla významně spojena se sníženým APOBEC-mutačním podpisem (P = 1,7 × 10- 3; tab. 3). Abychom dále objasnili, zda je vliv zárodečné delece APOBEC3A/B na APOBEC-mutační podpis způsoben jejím vlivem na genovou expresi, hodnotili jsme dále asociace mezi APOBEC-mutačním podpisem a delecí s úpravou na expresi izoforem (viz Metody). Podobně naše výsledky ukázaly, že zárodečná delece APOBEC3A/B byla významně spojena se zvýšeným APOBEC-mutačním podpisem pouze u karcinomu prsu (P = 2,8 × 10- 6; tab. 3; obr. 3b). Ve srovnání s původním pozorováním celkového účinku (Beta = – 0,281; tab. 3) byla pozorována vyšší velikost účinku (Beta = – 0,620) delece s upravenou expresí izoforem. Abychom zhodnotili, zda zárodečná delece může přispívat k podílu APOBEC-mutačního podpisu, analyzovali jsme také podíl APOBEC-mutačního podpisu vzhledem k celkovým mutacím pro každý vzorek (viz Metody). V souladu s původním pozorováním APOBEC-mutačního podpisu jsme pozorovali, že zárodečná delece byla významně spojena se zvýšeným podílem APOBEC-mutačního podpisu pouze u karcinomu prsu (Beta = – 0,287, P = 4,8 × 10- 3 a Beta = – 0,5, P = 1,4 × 10- 4 pro celkový účinek a účinky s upravenou genovou expresí; viz tabulka 3). Tyto výsledky naznačují, že zárodečná delece APOBEC3A/B, která vede ke zvýšené APOBEC-mutační signatuře, je pravděpodobně kromě vlivu na zvýšenou expresi uc011aoc způsobena právě odlišnou funkcí uc011aoc transkribovaného z delece. Bylo zjištěno, že haplotyp APOBEC3H I (APOBEC3H-I) může významně přispívat k APOBEC-mutačnímu podpisu u vzorků nesoucích zárodečné delece APOBEC3A/B u karcinomu prsu . Dále jsme analyzovali haplotyp APOBEC3H-I u celkem 76 vzorků, u nichž se předpokládalo, že nesou zárodečné delece APOBEC3A/B (viz Metody). Naše výsledky ukázaly, že APOBEC-mutační podpis významně nekoreloval s haplotypem APOBEC3H-I bez ohledu na vzorky, u nichž se předpokládalo, že nesou homozygotní nebo heterozygotní zárodečné delece APOBEC3A/B (údaje nejsou uvedeny). Naše zjištění jsou však v souladu s předchozím zjištěním, že protein APOBEC3A/B vzniklý delecí má vyšší úroveň exprese než protein APOBEC3A na základě šetření z funkčních testů in vitro .

Pro další zkoumání odlišné funkce a potenciálních drah, do nichž může být zapojena exprese izoformy uc011aoc (přepisované z delece APOBEC3A/B), jsme analyzovali geny, které byly koexprimovány s izoformou uc011aoc ve vzorcích, u nichž se předpokládá, že nesou zárodečné delece APOBEC3A/B (viz Metody). Analýza obohacení v kanonických signálních drahách pomocí IPA odhalila, že tyto koexprimované geny byly významně obohaceny v různých kanonických drahách lišících se napříč typy rakoviny. Konkrétně jsme pozorovali, že nejvíce obohacenými drahami byly signalizace HIPPO u močového měchýře, signalizace PTEN u prsu, signalizace iNOS a interferonu u adenokarcinomu plic, hydrolýza Acyl-CoA u žaludku a oprava dvojvláknových zlomů DNA a α-oxidace mastných kyselin u slinivky břišní, signalizace EIF2 u štítné žlázy a integrace zprostředkovaná GPCR u ledvin (P < 0,01 pro všechny; Additional file 1: Table S7). Kromě toho bylo funkční obohacení v oblasti buněčné smrti a přežití běžně pozorováno u více typů rakoviny včetně karcinomu močového měchýře, prsu, děložního čípku, adenokarcinomu plic a karcinomu plic (P < 0,05 pro všechny).

Dále jsme hodnotili souvislost mezi zárodečnou delecí APOBEC3A/B a zátěží neoantigenů. V souladu s pozorováním APOBEC-mutačního podpisu naše výsledky ukázaly, že zárodečná delece APOBEC3A/B byla významně spojena se zvýšenou náloží neoantigenů pouze u karcinomu prsu (P = 6,5 × 10- 3; obr. 3c), zatímco u mnoha dalších typů karcinomu byl pozorován opačný trend (doplňkový soubor 1: tabulka S8). Podobně jsme zjistili, že zárodečná delece okrajově souvisí s relativním zastoupením složení T buněk (CD8+) v TIL, ale pouze u karcinomu prsu (P = 0,08; obr. 3d). Významná souvislost byla zjištěna, když jsme očesali vzorky s homozygotní i heterozygotní delecí a porovnali je se vzorky s nenositelnou delecí (Wilcoxonův signed-rank test, P < 0,05). U ostatních imunitních buněk však nebyla pozorována žádná souvislost. Naše zjištění ukázala, že zárodečné delece APOBEC3A/B hrají tkáňově specifickou roli při ovlivňování APOBEC-mutačního podpisu a imunogenicity u karcinomu prsu, což pravděpodobně posiluje zjištění z předchozích genomových asociačních studií potenciálních mechanismů jejich asociace se zvýšeným rizikem karcinomu prsu.

APOBEC-mutační signatura významně přispívá k neoantigenům

Abychom zjistili, do jaké míry APOBEC-mutační signatura přispívá k neoantigenům, analyzovali jsme předpokládanou zátěž neoantigenů pro každý vzorek získaný z předchozí studie (viz Metody). Pomocí univariační analýzy jsme vyhodnotili asociace mezi APOBEC-mutačním podpisem a náložemi neoantigenů pro každý typ rakoviny. Podle očekávání byla APOBEC-mutační signatura pozitivně asociována s neoantigenní zátěží u všech typů rakoviny (P < 1,0 × 10- 4 pro všechna srovnání), přičemž nejvyšší signifikantní asociace byly pozorovány u typů rakoviny prsu a močového měchýře s P = 5,1 × 10- 125, respektive P = 1,5 × 10- 90 (Additional file 1: Table S9). Podobně byl pozorován celkový pozitivní asociační trend mezi předpokládaným zatížením neoantigenem a podílem APOBEC-mutačního podpisu, s výjimkou karcinomu žaludku (obr. 4; Additional file 1: Table S10). Konkrétně byly významné asociace pozorovány u více typů rakoviny, včetně rakoviny močového měchýře, prsu, děložního čípku, adenokarcinomu plic, hlavy a krku a štítné žlázy. Zejména karcinom prsu a močového měchýře vykazovaly nejlepší asociace s P = 8,9 × 10- 29, respektive P = 2,8 × 10- 27 (Additional file 1: Table S10). Naše zjištění naznačují, že mutační signatura APOBEC hraje významnou roli při přispívání k biogenezi neoantigenů u lidských nádorů.

Asociace mezi relativním zastoupením složení imunitních buněk v TIL s neoantigenní zátěží a APOBEC-mutační signaturou

Zkoumání vztahu mezi neoantigenní zátěží a TIL, jsme použili údaje o genové expresi v nádorových tkáních k měření abundance relativních buněčných kompozic jednotlivých typů imunitních buněk, včetně B buněk naivních, B buněk paměťových, T buněk CD8 a T buněk CD4 paměťově aktivovaných v TILs (viz Metody). Pomocí univariační analýzy jsme hodnotili souvislost mezi zatížením neoantigenem a relativním zastoupením složení imunitních buněk pro každý typ nádoru. Zjistili jsme, že u všech typů nádorů s výjimkou štítné žlázy a ledvin existuje pozitivní asociační trend mezi neoantigenní zátěží a typy T buněk CD8+ i CD4+ aktivovaných pamětí (binomický test P = 0,11 a P = 0,02 pro typy T buněk CD8+ a CD4+ aktivovaných pamětí). Opačný vzorec byl pozorován u naivních i paměťových typů B buněk u všech typů rakoviny s výjimkou adenokarcinomu plic (binomický test P = 0,02 a P = 2,2 × 10- 16 pro naivní a paměťové typy B buněk). Naše výsledky zejména ukázaly, že u karcinomu močového měchýře má neoantigenní zátěž souvislost s relativním zastoupením jak T buněk CD8+ a CD4+ aktivovaných pamětí, tak B buněk naivních a paměťových typů. U karcinomu prsu byla zjištěna asociace pro naivní i paměťové typy buněk B a u karcinomu plic, hlavy a krku a pankreatu pro paměťově aktivované typy buněk T (Additional file 1: Table S11). Protože APOBEC-mutační signatura významně přispívala k neoantigenům, hodnotili jsme navíc souvislost mezi relativním zastoupením složení imunitních buněk v TIL a APOBEC-mutační signaturou. V souladu s pozorováním z asociační analýzy nálože neoantigenů byl podobný vzorec zjištěn také u APOBEC-mutačního podpisu (Additional file 1: Table S12). Naše zjištění naznačují, že APOBEC-mutační signatura má vliv na nádorové imunogenní schopnosti, jako je přitahování určitých imunitních buněk v TIL, pravděpodobně zprostředkované zvýšenou neoantigenní zátěží.

.