Isolation, characterization and toxicological potential of Alternaria-mycotoxins (TeA, AOH a AME) u různých druhů Alternaria z různých oblastí Indie

Sběr a izolace druhů Alternaria

Infikované části, jako jsou listy, plody a stonky nemocných rostlin z různých oblastí Indie, byly shromážděny a přivezeny do laboratoře. Vzorky listů byly povrchově sterilizovány 0,5% roztokem chlornanu sodného, několikrát důkladně promyty sterilní destilovanou vodou (SDW) a umístěny na kultivační médium bramborový dextrózový agar (PDA) v Petriho miskách po dobu 3-4 dnů. Destičky PDA obsahující infikované kousky listů byly inkubovány při 28 °C při 12hodinové světelné/tmavé fotoperiodě po dobu 6-10 dnů57. Aby se zabránilo bakteriální kontaminaci, byl do média přidán streptomycin. Konidie byly produkovány jednosporulově, aby se získaly čisté kolonie, které byly umístěny na sterilizovaný filtrační papír.

Test patogenity

Pro stanovení specií forem byla provedena analýza virulence izolátů na odrůdách rajčat citlivých k alternáriím. Na patogenitu bylo testováno celkem 60 izolátů Alternaria. Semena rajčat byla skarifikována v chlornanu sodném, opláchnuta ve vodovodní vodě a poté vysušena na vzduchu. Rostliny byly pěstovány odděleně v květináčích. Fyziologické podmínky, jako je teplota a vlhkost vzduchu pro růst rostlin, byly udržovány na 28 °C až 32 °C a 40 až 60 % relativní vlhkosti vzduchu. Byla udržována optimální koncentrace inokula (2 × 106 spor/ml) a postřikována na listovou plochu. Pokusné rostliny byly udržovány v rosných komorách po dobu 8 h při teplotě 25 °C. Tyto rostliny byly po dobu 2 až 3 dnů pravidelně sledovány z hlediska intenzity infekce a vývoje choroby ve srovnání s kontrolním listem, který nebyl inokulován. Příznaky se začaly projevovat 1 den po postřiku inokulací sporami. Závažnost choroby byla hodnocena od 1. dne po inokulaci do 6 dnů. Data byla statisticky vyhodnocena pomocí analýzy rozptylu (ANOVA) a Duncanova testu (P ≤ 0,05).

Extrakce DNA a identifikace patogenu

Patogen byl nejprve identifikován na základě morfologických charakteristik včetně velikosti a tvaru, a struktury konidií a dále potvrzen amplifikací ITS pomocí univerzálních primerů ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) a ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATGATGC-3′) amplifikujících oblasti ITS a 5. ITS.8S genů kódujících druhy hub. Extrakce DNA byla provedena podle metody navržené Doylem a Doylem58. Lyofilizovaná mycelární podložka o hmotnosti 0,5 g byla rozemleta v hmoždíři a tloučku pomocí 10 ml extrakčního pufru CTAB a poté inkubována při 65 °C ve vodní lázni po dobu 30 minut. Vzorek byl poté smíchán se stejným objemem vychlazeného chloroformu/izoamylalkoholu a jemně promíchán s následnou centrifugací při 10 000 otáčkách za minutu po dobu 10 min při 4 °C. Takto získaný supernatant byl smíchán se stejným objemem isopropanolu a ponechán 2 h při 4 °C. Vzorek byl opět odstředěn při 10000 otáčkách za minutu po dobu 10 min při teplotě 4 °C. Peleta byla poté propláchnuta 70% ethanolem a sušena na vzduchu po dobu 4 h, aby se odstranily stopy alkoholu. Amplifikace ITS rDNA byla provedena v 25 μl reakční směsi obsahující 2,5 μl 10X reakčního pufru, 5 μl každého deoxyribonukleotidtrifosfátu (dNTP) a po 1,0 μl ITS a 5,8 S oblasti univerzálního dopředného primeru (ITS1) a reverzního primeru (ITS4), 0,3 μl Taq DNA-polymerázy, 10-100 ng DNA a 2,5 μl MgCl2. Optimalizovaný tepelný profil PCR byl počáteční denaturace při 95 °C po dobu 3 min, denaturace při 95 °C po dobu 30 s, žíhání při 70 °C po dobu 30 s a konečná extenze při 72 °C po dobu 1 min s dalšími 40 cykly. Amplifikace byly potvrzeny na 1% agarózových gelech v 0,5X TBE pufru, vedeny paralelně se standardním markerem molekulové hmotnosti DNA a vizualizovány pod UV-transiluminátorem.

ITS sekvenční analýza

Získané oblasti ITS rDNA vybraných izolátů byly dále zkráceny a přečištěny pomocí purifikační soupravy QIAquick PCR (QIAGEN, Německo) podle pokynů výrobce. Přečištěné produkty byly nakonec zaslány společnosti SciGenome Cochin, Kerala, Indie, k sekvenování. Sekvence byly porovnány se sekvencemi v GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) pomocí NCBI BLAST. Analýza BLAST byla provedena s plnými délkami sekvencí ITS jako dotazy, aby se odhalily vztahy k publikovaným sekvencím. Nejvyšší homologie a celkové skóre byly zaznamenány pro další analýzu. Sekvence získané v této studii byly odeslány do GenBank. Sekvence ITS kmenů Alternaria z jiných formae speciale byly staženy z databáze NCBI GenBank a byly použity ve fylogenetických analýzách jako referenční sekvence. Všechny sekvence DNA byly zarovnány pomocí programu Clustal W, který je součástí editoru pro zarovnávání sekvencí BioEdit59, 60. Výsledný soubor vícenásobného zarovnání byl použit pro fylogenetické analýzy, které byly provedeny pomocí programu MEGA 5.0 s metodou Neighbor-Joining umožňující 500 bootstrapových replikací61.

Extrakce toxinů z druhů rodu Alternaria

Extrakce toxických metabolitů byla provedena podle metody Andersena a spol.62 s některými úpravami. Extrakce těchto fytotoxinů byly prováděny na médiu Potato Dextrose Broth (PDB) za použití 20denních kultur. Ze středu každé kolonie Alternaria byly vyříznuty tři agarové zátky (3 mm) a naočkovány do 200 ml média PDB. Kolonie patogenu byly vyříznuty pomocí korkového vrtáku (5 mm) a poté byly kolonie naočkovány do média PDB. Dvacet dní staré kultury byly filtrovány přes filtrační papír pomocí vakuového filtru. Do filtrátů kultur se přidal stejný objem methanolu, řádně se promíchal a ponechal se 24 h při 4 °C. Poté se filtrát vysrážel a methanol se odpařil do sucha v rotačním vakuovém koncentrátoru (IKA® RV 10) při 43 °C. K extrahovanému filtrátu byl přidán stejný objem ethylacetátu a řádně promíchán v dělící nálevce. Vznikly dvě fáze, jedna byla organická a druhá vodná. Vodná vrstva byla oddělena a extrahována ethylacetátem. Extrakt ethylacetátu byl zahuštěn při 44 °C ve vakuové odparce a rozpuštěn v methanolu.

Purifikace a separace fytotoxinu Alternaria pomocí sloupcové chromatografie

Purifikace a separace sloučenin byla provedena podle metodiky Deviho a spol.63 s drobnými úpravami. Kolonová chromatografie (CC) byla provedena ve skleněné koloně (700 mm × 30 mm) a jako stacionární fáze byl zvolen silikagel (velikost ok 100-120 Merk). Mobilní fáze se skládala z čistého rozpouštědla nebo různých rozpouštědel v závislosti na požadavku podmínek. Kolona byla naplněna surovým komplexem extrahovaným z izolátů druhu Alternaria. Pro separaci toxických metabolitů se mobilní fáze skládala z chloroformu: methanolu (80:20 a 95:05), pro separaci sloučeniny byl použit poměr benzen: aceton: kyselina octová (60:35:05) a byla použita gradientová eluce. Různé frakce eluované z CC byly separovány tenkovrstvou chromatografií (TLC) a potvrzeny HPLC analýzou.

Tenkovrstvá chromatografie (TLC) analýza fytotoxinů

Tenkovrstvá chromatografie (TLC) byla použita k identifikaci různých fytotoxinů produkovaných velkými i malými sporami identifikovaných druhů Alternaria. TLC byla provedena metodou podle Andersena a kol.64 . Při této metodě bylo 4,5 g silikagelu G254 (13 % CaSO4 ½ H2O jako pojivo) přidáno s 25 ml dvakrát destilované vody a mícháno skleněnou tyčinkou, dokud se nevytvořila suspenze silikagelu. Poté byla suspenze opatrně nanesena na skleněnou desku a umístěna na bezpečné místo k vyschnutí na vzduchu. Pro separaci různých fytotoxinů byly použity různé mobilní fáze v poměru chloroform: methanol (80:20; v/v), benzen: aceton: kyselina octová (60:35:5; v/v), chloroform: methanol (95:5; v/v), ethylacetát: benzen (95:5; v/v). Tyto směsi rozpouštědel byly poté umístěny do exsikátorů a ponechány po dobu 30 min, aby se prostředí uvnitř nasytilo. Před provedením TLC byly skleněné desky potažené silikagelem nabity vložením do pece při 60 °C na 10 min. Po nabití bylo na různé místo ve vzdálenosti 2 cm od základny naneseno 5 µl vzorků. Po nanesení vzorků byly TLC desky několik minut sušeny v exsikátoru. Vzniklé skvrny byly vyvolány působením 0,2% ethanolického chloridu železitého a/nebo vizualizovány pod UV světlem při vlnové délce 365 nm. TLC desky byly poté přes noc vysušeny na vzduchu a poté byly vypočteny hodnoty Rf. Skvrny různých metabolitů, jejichž hodnoty Rf byly shledány podobnými s hodnotami Rf standardů, byly vyškrábány, rozpuštěny v methanolu třídy HPLC a použity pro HPLC analýzu.

HPLC-UV analýza

Příprava standardů

TeA (kat. č.: T1952), AOH (kat. č.: A4675) a AME (kat. č.: A4678) byly zakoupeny od společnosti Biogenuix (LKT laboratories, Inc.), New Delhi, Indie) a pro přípravu standardu byly použity v krystalizované formě. Zásobní roztok (1000 µg ml-1) a samostatný pracovní roztok (10 µg ml-1) toxinů byly připraveny v methanolu třídy HPLC a uchovávány při -20 °C pro další použití. Tyto toxiny byly použity jako standardy pro kalibraci HPLC a pro další doplňkové experimenty naředěním připravených pracovních roztoků.

Podmínky analýzy HPLC-UV

Pro analýzu HPLC byly vzorky chromatograficky separovány pomocí deaktivované báze (250 mm dlouhé × 4.6 mm, velikost částic 5,0 µm) kolony C18 Waters Spherisorb, ODS2 (číslo výrobku: PSS831915, USA), která byla připojena k ochranné koloně, systému řady Waters (Waters, Waters Corporation, Milford, USA) vybavenému UV-VIS detektorem (2998 PDA) a řídicí jednotkou systému Waters 600E. Detektor 2998 PDA byl nastaven na vlnovou délku 254 nm. Vzorky byly vstřikovány pomocí 10 μl smyčky autosampleru Waters 717plus (Waters Corporation, Milford, USA). Kolona a ochranná kolona byly termostaticky řízeny na 28 °C. Průtoková rychlost byla 0,70 ml/min a mobilní fáze se skládala ze 75 % methanolu třídy HPLC (rozpouštědlo A), 25 % vodného roztoku (rozpouštědlo B) 0,1 M fosfátového pufru přidaného 900 ml DW na 1 litr a pH 5,8 udržovaného kyselinou fosforečnou. Přístroj pracoval v lineárním izokratickém režimu a detekce byla sledována v rozsahu 200-400 nm. Spolehlivost HPLC-metody pro analýzu AME, TeA a AOH byla ověřena pomocí meze detekce (LOD) a meze stanovitelnosti (LOQ).

LC-MS/MS analýza

Pro další potvrzení toxinů Alternaria (AME, AOH a TeA) byla provedena chromatograficko – tandemová hmotnostně spektrometrická (LC-MS/MS) metoda s mírnými úpravami podle Tölgyesiho a spol.65 . Metoda zahrnuje extrakci tuhá látka – kapalina methanolem a následnou derivatizaci pro TeA, AOH a AME. Poté byly vzorky přečištěny extrakcí na pevné fázi na kazetách na bázi polymerů a nakonec byly toxiny separovány pomocí LC-MS/MS. Pro LC-MS/MS analýzu byly vzorky připraveny postupně.

Reagencie, rozpouštědla a příprava standardu

Sušené analytické kalibranty AME, AOH a TeA byly zakoupeny od společnosti Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, Indie). Standardy byly rekonstituovány s 1,0 ml methanolu pro získání zásobních roztoků o koncentraci 0,1 mg ml-1 . Všechny zásobní roztoky byly uchovávány při teplotě 4 °C. 2,4-dinitrofenylhydrazin (DNPH) a undekanal byly zakoupeny od firmy Sigma-Aldrich. Derivatizační činidlo (0,58 % DNPH v roztoku HCl) bylo připraveno podle popisu Siegela a spol.7. Stop činidlo bylo 5 % (v/v) undekanalu v methanolu. Derivatizované standardní roztoky TeA, AOH a AME (1,91 μg/ml, 2,54 μg/ml a 2,71 μg/ml methanolu) byly připraveny smícháním 1 ml methanolového roztoku TeA, AOH a AME o koncentraci 10 μg/ml s 1 ml roztoku DNPH. Směs byla ponechána přes noc a zpracována, jak je uvedeno v oddílech o extrakci vzorku a čištění SPE. Konečný objem byl upraven na 10 ml methanolem. Tyto roztoky byly použity k optimalizaci podmínek LC-MS/MS analýzy. Celkem bylo ve vodě připraveno 50 mM pufru mravenčanu amonného a jeho pH bylo upraveno na 3,0 pomocí kyseliny mravenčí. Methanol a acetonitril byly LC-MS kvality získané od firmy Sigma-Aldrich. Ethylacetát, n-hexan, dichlormethan, kyselina mravenčí a mravenčan amonný byly jakosti HPLC a byly zakoupeny od společnosti Merck (Darmstadt, Německo). Kolona Kinetex C-18 UPLC LG 500 (3 × 100 mm, 2,6 μm), kazety Strata SPE (6 ml, 200 mg) a injekční filtry z regenerované celulózy (RC) (15 mm, 0,45 μm) byly získány od společnosti Phenomenex (Utrecht, Nizozemsko). Kolony Supelco Ascentis Express C-18, kyano (ES-CN) a fenyl-hexyl HPLC (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) byly zakoupeny od firmy Sigma- Aldrich. Standardní vzorky toxinů použité pro vývoj metody byly zakoupeny od společnosti Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, Indie). Vzorky byly uchovávány při -20 °C, dokud nebyly podrobeny analýze.

Extrakce vzorků

Vzorky pro extrakci surových metabolitů byly přečištěny metodou sloupcové chromatografie a frakce byly eluovány a rozpuštěny v methanolu. Z každé frakce bylo 50 ml vzorku smícháno do 50 ml polypropylenových (PP) odstředivek, které byly následně uzavřeny. Vzorky byly míchány vortexem po dobu 5 s a horizontálně třepány na třepačce CAT S50 při rychlosti 600 min-1 po dobu 45 min při pokojové teplotě. Poté byly zkumavky odstředěny při 5 000 otáčkách za minutu po dobu 10 min při 20 °C a horní vrstva byla odebrána do nové 50 ml PP odstředivky. Ke vzorku bylo přidáno 100 μl derivatizačního činidla (0,596 % DNPH ve 2 mol/l HCl) a 5 s se míchalo vortexem. Vzorek se nechal derivatizovat 1 h při pokojové teplotě. Poté bylo přidáno 500 μl stop činidla 5 % (v/v) undekanalu v methanolu a 5 s se míchalo vortexem. Vzorek se nechal 30 min stát a poté se v PP zkumavce naředil na 35 ml 50 mM mravenčan amonným pufrem (pH 4, upraveným kyselinou mravenčí). Vzorek se odstředil při 5000 otáčkách za minutu po dobu 10 min při 20 °C a podrobil se čištění extrakcí na pevné fázi.

Čištění extrakcí na pevné fázi (SPE)

Kartridže Strata-XL (200 mg, 6 ml, 100 μm) byly kondicionovány 6 ml methanolu, následně 6 ml vody a 6 ml 50 mM mravenčanového pufru. Na patrony byly připojeny 75 ml zásobníky a do zásobníků byly vloženy vzorky. Poté byly vzorky propouštěny po kapkách. Poté se SPE kolony promyly 6 ml methanolu a vody (15/85, v/v) a následně 6 ml n-hexanu. Před elucí vzorků do skleněných zkumavek s 5 ml methanolu byly patrony sušeny 5 min ve vakuu. Vzorky byly odpařeny do sucha při 45 °C pod mírným proudem dusíku a byly znovu rozpuštěny ve 250 μl methanolu vířivým mícháním po dobu 20 sekund. V posledním kroku byly vzorky přefiltrovány přes filtry z regenerované celulózy do HPLC lahviček.

Instrumentace a vybavení

Vývoj metody byl proveden pomocí přístroje Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2.7 μm) UPLC LG 500 nm (Accucore RP-MS 100 × 3,0 MM, 2,6UM, ACQ-TQD-QBB1152, detektor Waters acuity PDA, Waters Corporation, Milford, MA, USA) ve spojení s trojnásobným kvadrupólovým MS detektorem MassLynx (Waters, Milford, MA, USA). Sběr a vyhodnocení dat bylo provedeno pomocí programu MassLynx verze 4.0. Konečná metoda byla rovněž převedena do systému Thermo ACQ-TQD Quantum Ultra LC-MS/MS (Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA), který zahrnoval binární čerpadlo Waters acquity QSM (SN- L10QSM943A), autosampler Waters acquity fin (SN-M10SDI443M), termostat kolon a trojitý kvadrupólový MS detektor TQD Quantum Ultra. Cílová teplota kolony byla 30 °C a cílová teplota vzorku 10 °C. Sběr a vyhodnocení dat bylo provedeno pomocí softwaru Xcalibur 2.0.7. SP1. Oba systémy byly vybaveny rozhraním pro elektrosprej (ESI), ve kterém byla při akvizici použita pouze negativní ionizace. Jako sušící a kolizní plyn byl použit dusík. Parametry iontového zdroje jsou shrnuty v doplňkové tabulce S2. Dále byla zkoumána přenositelnost metody pomocí LC-MS/MS systému, který se skládal z Agilent 1100 HPLC spojeného s AB Sciex 4000 triple quadrupole MS (Framingham, MA, USA).

Podmínky přístroje

Toxiny Alternaria jsou separovány na koloně Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) UPLC vybavené 2,1 mm předkolonou C-18 s použitím lineární gradientové eluce. Čtyři rozpouštědla (rozpouštědla A, B, C a D) byla smíchána binární pumpou. Rozpouštědlo A obsahovalo acetonitril (ACN) + vodu (5:95), rozpouštědlo B obsahovalo ACN: 5 % isopropylalkohol (IPA), rozpouštědlo C obsahovalo 100 % methanol a rozpouštědlo D obsahovalo čistý octan amonný. Průtoková rychlost byla 0,5 ml/min. Mobilní fáze rozpouštědel v počátečním čase byla 0,0 % A, 30 % B, 30 % C a 40 % D. V konečném čase (5 min) byla rozpouštědla 0,0 % A, 30 % B, 30 % C a 40 % D. Pro odstranění nahromaděných lipofilních matricových roztoků byl nutný dostatečný promývací krok v gradientovém programu. Celková doba analýzy byla 5 min. Termostat kolony udržoval teplotu na 30 °C, injekční objem byl 1,0 μl. Autosampler pracoval při teplotě 20 °C.

Systém UPLC LG 500 nm byl spojen s MS/MS detektorem (Micromass Quattro Ultima PT) prostřednictvím elektrosprejového rozhraní (ESI), které pracuje v negativním režimu. Optimalizovaná nastavení ESI byla následující: teplota zdroje 120 °C, teplota desolvatace 350 °C, průtok sušícího plynu 650 l/h, průtok kuželového plynu 30 l/h a kapilární napětí 3,50 kV. Jako sušící a kolizní plyn se používá dusík (2,67 × 10-6 bar). Při detekci byl v MS použit režim vícenásobného monitorování reakce (MRM) a pro každý cílový toxin byly snímány dva iontové přechody. Režim MRM byl použit v detektoru MS/MS a pro každou cílovou sloučeninu byly zaznamenány dva iontové přechody (kvantifikátor a kvalifikátor). Vybrané iontové přechody s optimalizovanými napětími (kuželová nebo trubicová čočka), kolizními energiemi (CE) a dobami zdržení jsou shrnuty v tabulce (Doplňková tabulka S2).

Ohodnocení toxikologického potenciálu různých mykotoxinů Alternaria (TeA, AOH a AME)

Měření rozsahu buněčné smrti vyvolané různými mykotoxiny bylo stanoveno metodou inokulace oddělených listů. Za tímto účelem byly z rostlin pěstovaných ve skleníku odděleny čerstvé vzorky listů, které byly řádně 3-4 minuty omývány v tekoucí vodovodní vodě, sterilizovány v 1,0% (0,01 g/ml) chlornanu sodném po dobu asi 1 minuty a poté povrchově otřeny 70% etanolem a nakonec asepticky důkladně opláchnuty sterilní destilovanou vodou. Nakonec byly listy položeny na navlhčený filtrační papír a na spodní ploše propíchnuty sterilní jehlou. Toxiny byly rozpuštěny ve sterilní deionizované vodě v koncentraci 100 μg/ml. Kapky (100 µl) každého ze tří toxinů byly vstříknuty do poraněných listů tenkou jehlou (Dispovan, 1 ml). Kontrolní vzorek byl upraven vstříknutím sterilní destilované vody. Ošetřené vzorky listů byly udržovány ve vlhké komoře (teplota 27 ± 0,5 °C a relativní vlhkost 60 %) v podmínkách skleníku (cyklus 14 h světla a 10 h tmy při 27 °C). Bylo prováděno pravidelné pozorování (každých 24 h po dobu 6 dnů) s cílem zjistit jakékoli změny týkající se toxikologických účinků, které se projevily u injektovaných vzorků ve srovnání s kontrolními vzorky. Experimentální sestava byla udržována ve třech opakováních a procentuální plocha listů ovlivněná toxickou buněčnou smrtí byla měřena přístrojem (Systronic leaf area meter 211) a vypočtena podle níže uvedeného vzorce.

Stanovení buněčné smrti pomocí testu absorpce Evansovy modři

Ztráta životaschopnosti buněk (buněčná smrt) byla hodnocena pomocí metody barvení Evansovou modří (Baker a Mock, 1994). Listy rajčat byly ošetřeny stejnou koncentrací (250 μg/ml) všech tří toxinů. Ošetřené listy byly obarveny 0,25% (v/v) vodným roztokem Evansovy modři po dobu 15 minut. Po promytí destilovanou vodou po dobu 30 min byly listy vyříznuty a namočeny do 500 µl N, N-dimethylformamidu po dobu 1 h při pokojové teplotě. Optická hustota uvolněné Evansovy modři byla měřena spektrofotometricky při 600 nm.

Statistická analýza

Statistická analýza byla provedena pomocí programu IBM SPSS Statistics ver. 20 softwaru prostřednictvím analýzy rozptylu (one-way ANOVA) s následným Duncanovým testem vícenásobného rozsahu na hladině významnosti P ≤ 0,05. Údaje byly vyjádřeny jako průměr ± směrodatná odchylka (SD) nejméně tří opakování každého metabolitu. Statistická analýza dat byla provedena u vybraných 48 izolátů druhů rodu Alternaria, které měly patogenní charakter.

.