ABTS

17.4 Fenoli

L’ossidazione del classico substrato Lac ABTS da parte della laccasi di Tetracystis aeria è diffusa nelle alghe cloroficee. Per esempio, le specie della Moewusinia, tra cui Chlamydomonas moewusii e T. aeria, espellono “vere” Lac putative. I substrati fenolici sono ossidati da questi enzimi in modo ottimale a pH da neutro ad alcalino. La laccasi di Tetracystis trasforma efficientemente altri composti come il bisfenolo A, 17α-etinilestradiolo, nonilfenolo e triclosan in presenza di ABTS come mediatore redox, mentre antracene, veratrylalcohol e adlerolo rimangono invariati. Possibili funzioni naturali degli enzimi, come la sintesi di polimeri complessi o processi di disintossicazione, possono aiutare la sopravvivenza delle alghe in ambienti avversi. Nelle acque superficiali contaminate, le alghe verdi produttrici di Lac potrebbero contribuire alla ripartizione ambientale degli inquinanti fenolici.

Il Lac putativo (CotA) del Bacillus pumilus MK001 clonato ed espresso in E. coli è stato trovato per essere termostabile esibendo un’emivita di 60 minuti a 80°C e mostra potenziali affinità di legame con l’acido ferulico, l’acido caffeico e la vanillina.

I fenoli sono noti inibitori della cellulasi e dei microrganismi fermentativi nei processi di bioraffinazione. L’aggiunta di Lac rimuove i composti fenolici e successivamente riduce la fase di ritardo del microrganismo fermentativo. Tuttavia, l’applicazione di Lac diminuisce il rilascio di glucosio durante l’idrolisi enzimatica. La proporzione di lignina e la composizione dei fenoli sono attori chiave nell’inibizione della cellulasi quando l’idrolisi enzimatica è combinata con la detossificazione della Lac.

Un’interessante applicazione nella biotecnologia ambientale è l’immobilizzazione della Lac per eliminare i contaminanti fenolici attraverso l’ossidazione. Le nanoparticelle di silice fumata hanno un potenziale interessante come materiale di supporto per l’immobilizzazione di Lac attraverso l’immobilizzazione assistita dal sorption nella prospettiva di applicazioni come l’eliminazione di microinquinanti in fasi acquose. L’immobilizzazione di Lac da un genere Leviathan, Coriolopsis polygonal, Cerrena unicolor, P. ostreatus, e T. versicolor su nanoparticelle di silice fumata, separatamente o in combinazione, produce un aumento dell’attività in un intervallo di pH tra 3 e 7. I diversi Lac differiscono nei loro pH optima e nell’affinità del substrato. Lo sfruttamento delle loro differenze ha permesso la formulazione di un nanobiocatalizzatore su misura in grado di ossidare una gamma di substrati più ampia rispetto agli enzimi dissolti o immobilizzati separatamente. Il nanobiocatalizzatore ha il potenziale per l’ossidazione biochimica nell’eliminazione di più inquinanti target. E’ stato confermato che i nanobiocatalizzatori nonvocational ottenuti dall’immobilizzazione Lac su nanoparticelle di silice possedevano un ampio spettro di substrato per quanto riguarda la degradazione di inquinanti recalcitranti, come gli EDC fenolici (bisfenolo A) .Questo sottolinea il potenziale dei compositi nanoparticelle di silice fumata/laccasi per il trattamento biologico avanzato delle acque reflue.

I lac sono in grado di catalizzare l’ossidazione a un elettrone dei composti fenolici in intermedi radicali che possono successivamente accoppiarsi tra loro tramite legami covalenti. Si ritiene che queste reazioni giochino un ruolo importante nel processo di umificazione e nella trasformazione dei contaminanti contenenti funzionalità fenoliche nell’ambiente. Un modello di reazione è stato sviluppato integrando gli equilibri di legame metallo-HA e le equazioni cinetiche, prevedendo il tasso di trasformazione del triclosan in presenza di HA e ioni metallici divalenti tra cui Ca2+, Mg2+, Cd2+, Co2+, Mn2+, Ba2+, e Zn2+.

Gli eteri di difenile polibromurati idrossilati (OH-PBDE) sono stati spesso trovati nella biosfera marina come contaminanti organici emergenti. La produzione di OH-PBDE è probabilmente il risultato dell’accoppiamento di radicali bromofenossi, generati dall’ossidazione Lac-catalizzata di 2,4-DBP o 2,4,6-TBP. La trasformazione dei bromofenoli da parte di Lac è dipendente dal pH ed è anche influenzata dall’attività enzimatica. In considerazione dell’abbondanza di 2,4-DBP e 2,4,6-TBP e della distribuzione filogenetica di Lac nell’ambiente, la conversione catalizzata da Lac dei bromofenoli può essere potenzialmente una via importante per la biosintesi naturale degli OH-PBDE.

Phanerochaete chrysosporium appartiene a un gruppo di funghi che degradano la lignina e che secernono vari enzimi ossidoriduttivi, tra cui la lignina perossidasi (LiP) e la manganese perossidasi (MnP). Tuttavia, la produzione di Lacs in questo fungo non è stata completamente dimostrata e rimane controversa. La coespressione del gene LacIIIb da T. versicolor e del gene vpl2 da Pleurotus eryngii, e anche i geni endogeni mnp1 e lipH8 hanno migliorato la coespressione di perossidasi e laccasi fino a cinque volte rispetto alle specie wild-type. I ceppi trasformanti hanno un ampio spettro nella biotrasformazione fenolica/non-fenolica e un’alta percentuale nella decolorazione dei coloranti sintetici rispetto al ceppo parentale e sono una facile ed efficiente coespressione di Lacs e perossidasi nelle specie basidiomicete adatte.

Di recente, Lac è stato applicato alla nanobiotecnologia, che è un campo di ricerca crescente, e catalizza reazioni di trasferimento di elettroni senza cofattori aggiuntivi.

Le nanoparticelle di carbonio sono candidati promettenti per l’immobilizzazione dell’enzima. Rispetto al Lac libero, gli enzimi immobilizzati hanno tassi di reazione significativamente ridotti. La limitazione diffusionale indotta dall’aggregazione delle nanoparticelle di carbonio non può essere ignorata perché può portare a un aumento dei tempi di reazione, una bassa efficienza e alti costi economici. Inoltre, questo problema è aggravato quando sono presenti basse concentrazioni di contaminanti ambientali.

Il bisfenolo A (BPA) è una sostanza chimica che altera il sistema endocrino ed è onnipresente nell’ambiente a causa del suo ampio uso industriale. Il Lac extracellulare del fungo più coltivato al mondo (cioè il fungo white-rot, P. ostreatus) ha degradato efficacemente il BPA. L’esposizione al BPA non ha effetti nocivi su questo fungo commestibile.

La rimozione del BPA da parte del Lac in un reattore continuo a membrana enzimatica valutata in acque reflue sintetiche e reali trattate biologicamente in una configurazione del reattore basata su un reattore a vasca agitata accoppiato a una membrana ceramica, ha mostrato una rimozione quasi completa del BPA. La polimerizzazione e la degradazione sono probabili meccanismi di trasformazione del BPA da parte di Lac.

Gli organismi del phylum Basidiomycota hanno un enorme potenziale di biorisanamento grazie alle loro fenolossidasi nella degradazione dei fenoli. Lac e tirosinasi si trovano principalmente in T. versicolor e Agaricus bisporus, rispettivamente. Sono emersi nuovi promettenti produttori wild-type di enzimi e sono stati costruiti anche numerosi ceppi ricombinanti, basati principalmente su lieviti o ceppi di Aspergillus come ospiti. I costrutti permettono applicazioni per la degradazione di fenoli, polifenoli, cresoli, alchilfenoli, naftoli, bisfenoli e (bis)fenoli alogenati. I metodi biologici e fisico-chimici potrebbero essere combinati per rendere i processi adatti all’uso industriale.

Le perossidasi vegetali hanno una forte utilità potenziale per la decontaminazione delle acque reflue inquinate da fenoli. L’uso su larga scala di questi enzimi per il disinquinamento del fenolo richiede materiale economico, abbondante e facilmente accessibile contenente perossidasi. La polpa di patate, un prodotto di scarto dell’industria dell’amido, contiene grandi quantità di perossidasi attive, e gli enzimi della polpa di patate mantengono la loro attività a pH 4-8 e sono stabili in un’ampia gamma di temperature. L’efficienza di rimozione del fenolo dalla polpa di patate è superiore al 95%.

Immobilizzato Lac su perle di silice nanoporosa degrada più del 90% del 2,4-dinitrofenolo in breve tempo (12 ore). Il processo di immobilizzazione migliora l’attività e la sostenibilità di Lac per la degradazione dell’inquinante. Le temperature superiori a 50°C riducono l’attività dell’enzima a circa il 60%. Tuttavia, il pH e la concentrazione del mediatore non possono influenzare l’attività dell’enzima. La cinetica di degradazione è in accordo con un’equazione di Michaelis-Menten.

Gli essudati acquosi di loietto (Lolium perenne) possono degradare il BPA sia in assenza che in presenza di materia organica naturale (NOM). Negli essudati con l’aggiunta di NOM, il processo di degradazione è più lungo che senza NOM. Le attività di perossidasi e Lac negli essudati hanno suggerito un coinvolgimento significativo di questi enzimi nella degradazione del BPA.

I composti organofluorinati sono diventati importanti mattoni per una vasta gamma di materiali avanzati, polimeri, prodotti agrochimici e farmaceutici. Il concetto per l’introduzione del gruppo trifluorometilico in fenoli non protetti utilizzando un biocatalizzatore (Lac), tBuOOH, e il reagente di Langlois o il solfinato di zinco di Baran è stato raggiunto. Il metodo si basa sulla ricombinazione di due specie radicali, cioè il catione radicale fenolo generato direttamente dal Lac e il radicale CF3. La trifluorometilazione catalizzata da Lac procede in condizioni miti e degrada i fenoli trifluorometil-sostituiti che non erano disponibili con i metodi classici.

Lac produce l’ascomicete d’acqua dolce Phoma sp. ceppo UHH 5-1-03 ha un potenziale per la rimozione pratica di microinquinanti. Bisfenolo A (BPA), carbamazepina (CBZ), 17α-etinilestradiolo (EE2), diclofenac (DF), sulfametossazolo (SMX), nonilfenolo tecnico (t-NP), e triclosan (TCS) sono substrati con l’ordine: EE2≫BPA>TCS>t-NP>DF>SMX>CBZ. I metaboliti ottenuti indicano reazioni di idrossilazione, ciclizzazione e decarbossilazione, così come l’accoppiamento ossidativo tipico delle reazioni Lac. Le osservazioni suggeriscono fortemente che il Lac extracellulare di Phoma sp. contribuisce ampiamente alla biotrasformazione fungina.

Una crescente attenzione è stata data alla nanobiocatalisi. Lac immobilizzato in modo reversibile su microsfere magnetiche con rivestimento in Cu (ΙΙ) e Mn (ΙΙ) è riuscito a rimuovere il BPA dall’acqua. Rispetto al Lac libero, la stabilità termica e di stoccaggio del Lac immobilizzato è significativamente migliorata. Più dell’85% del BPA è stato rimosso in condizioni ottimali.

Tuttavia, l’uso di enzimi in soluzione per il trattamento dell’acqua ha limitazioni di non riutilizzabilità, breve durata di vita dell’enzima e alto costo di utilizzo singolo. Chen et al. hanno sviluppato un nuovo tipo di biocatalizzatore immobilizzando il Lac fungino sulla superficie delle cellule di lievito utilizzando tecniche di biologia sintetica. Il biocatalizzatore è indicato come surface display Lac (SDL) e può essere riutilizzato con alta stabilità poiché ha mantenuto il 74% dell’attività iniziale dopo otto reazioni ripetute in batch. L’efficacia di SDL e la prova del concetto nel trattamento di contaminanti di interesse emergente sono stati dimostrati con bisfenolo A e sulfametossazolo.