ADAR

C Enzyme-Substrate Recognition

Si sa poco su come gli ADAR interagiscano con i loro substrati specifici e come i domini di legame all’RNA e il dominio catalitico lavorino insieme durante la reazione di editing. In contrasto con il macchinario di editing dell’RNA C-to-U che impiega un motivo di sequenza primaria vicino al sito di editing come determinante critico per il riconoscimento del substrato (Niswender, 1998), gli enzimi ADAR mancano di qualsiasi apparente specificità di sequenza intrinseca. Infatti, quando vengono presentate molecole di RNA completamente a doppio filamento, ADAR1 e ADAR2 deaminano quasi promiscuamente fino al 50-60% di tutte le adenosine nella sequenza (Nishikura, 2010). Tuttavia, la presenza di loop, mismatch e rigonfiamenti all’interno della struttura di un substrato RNA aumenta la selettività del sito e, come visto per alcuni target fisiologici ADAR, l’intricata piega dell’RNA di tale substrato sembra limitare l’accesso per il legame sull’RNA e la catalisi produttiva spesso ad una singola adenosina (Nishikura, 2010). Pertanto, la maggior parte della specificità del target dell’editing A-to-I potrebbe risiedere all’interno della piega tridimensionale del substrato. Tuttavia, recenti studi strutturali basati sulla NMR dei domini leganti l’RNA della proteina ADAR in complesso con substrati minimi di RNA indicano che i singoli domini leganti il dsRNA possono anche essere coinvolti in contatti sequenza-specifici che potrebbero contribuire alla selettività per certi target di RNA rispetto ad altri (Stefl et al, 2006, 2011).

Un’altra proprietà degli ADAR che può avere implicazioni per il riconoscimento e l’interazione del substrato è la consapevolezza che per la deaminazione produttiva e ad alta attività, le proteine ADAR formano un dimero sul substrato (Jaikaran et al., 2002; Cho et al., 2003; Gallo et al., 2003; Poulsen et al., 2006). Potenzialmente, possono formarsi omo- ed eterodimeri tra le proteine ADAR (Chilibeck et al., 2006) e quindi rappresentano un altro livello di regolazione che influenza il riconoscimento specifico del substrato e l’attività di editing dell’RNA. Poiché ad oggi non esiste un target di editing noto per ADAR3 e questa proteina non mostra alcuna attività enzimatica nei saggi standard di deaminasi (Melcher et al., 1996a; Chen et al., 2000), il suo ruolo è stato suggerito essere di natura regolatoria attraverso l’eterodimerizzazione con gli altri ADAR.

Relativo alla formazione di dimeri ADAR per l’attività di editing generale è l’osservazione che alcuni eventi di editing di RNA che si verificano all’interno dello stesso substrato mostrano un accoppiamento positivo o negativo. Per esempio, le adenosine direttamente vicine l’una all’altra o quelle che si trovano sullo stesso lato della struttura duplex dell’RNA (circa 11 nt di distanza all’interno dell’RNA A-form) mostrano spesso un accoppiamento nell’editing da parte degli ADAR, probabilmente a causa della loro vicinanza al sito catalitico dell’enzima nello spazio (Koeris et al., 2005; Enstero et al., 2009).

Nonostante queste intuizioni, attualmente non è ancora possibile predire un sito di editing di RNA basato sulla sequenza primaria di RNA. Questo è dovuto principalmente alla natura complessa delle strutture terziarie dell’RNA e al loro comportamento dinamico. Anche considerando che i domini di legame del dsRNA possono essere in grado di discriminare certi motivi di sequenza primaria rispetto ad altri, piccole alterazioni nella sequenza primaria circostante o nella struttura secondaria e terziaria possono modulare o addirittura annullare i contatti sequenza-specifici. Di conseguenza, i tentativi di mettere a punto algoritmi di ricerca che combinano diverse caratteristiche molecolari (tra cui la probabilità di accoppiamento delle basi, l’ambiente di sequenza, la conservazione della sequenza) che sono note per influenzare la probabilità o l’attività di editing al fine di prevedere potenziali siti di editing hanno portato a lunghe liste di posizioni candidate negli mRNA, ma pochi nuovi siti di modifica selettivi e di alto livello sono stati convalidati come obiettivi in buona fede in vivo (Clutterbuck et al., 2005; Levanon et al., 2005; Gommans et al., 2008; Sie e Maas, 2009). La dicotomia tra il rilevamento di migliaia di probabili siti di editing basati su caratteristiche molecolari in pre-mRNA e la scarsità di siti di ricodifica di alto livello suggerisce che o gli algoritmi di previsione soffrono di un alto tasso di falsi positivi e la maggior parte di queste posizioni candidate non sono modificate da ADARs, o il rilevamento sperimentale di editing RNA è il problema e per molti siti di editing reale i tessuti sbagliati sono testati (cell-type specific editing) o sono testati al momento sbagliato (editing regolato). In alternativa, i livelli di editing in vivo della maggior parte dei siti sono così piccoli che gli attuali metodi di rilevamento non sono abbastanza sensibili per dimostrare o confutare l’editing.