Adenilciclasi

• 1 Funzione
• 2 Introduzione
  • 2.1 Adenosina monofosfato ciclico
  • 2.2 Pirofosfato
• 3 Adenilciclasi dei mammiferi
  • 3.1 Tipo II
    • 3.1.1 Struttura
    • 3.1.2 Disturbi da sovraespressione
• 4 Rv1264 Adenilciclasi
  • 4.1 Struttura
    • 4.1.1 Dominio catalitico C-terminale
      • 4.1.1.1.1 α1-switch
    • 4.1.2 Dominio regolatore N-terminale
      • 4.1.2.1 αN10-switch
  • 4.2 Regolazione del pH
  • 4.3 Ruolo biologico
• 5 Strutture 3D dell’adenilciclasi

Funzione

L’adenilciclasi (ADCY, numero EC 4.6.1.1), nota anche come adenilato ciclasi, è un enzima che catalizza la ciclizzazione di in . Questo avviene in un singolo passo concertato, dove l’ossigeno sul gruppo idrossile 3′ dell’ATP attacca nucleofillicamente l’alfa-fosfato formando un legame fosfodiestere e scindendo un gruppo pirofosfato. Nella maggior parte dei siti attivi c’è un residuo acido vicino al 3’OH che funziona nella sua deprotonazione, e residui basici vicino al β-fosforo per abbassare l’energia del gruppo per la scissione. Il reagente nella reazione catalizzata dall’adenilciclasi è l’ATP; l’ATP è il trifosfato nucleotidico più abbondante nella maggior parte delle cellule con concentrazioni tipiche che vanno da 1 a 10mM. Questa alta concentrazione intracellulare permette alle concentrazioni di cAMP di aumentare rapidamente in risposta a un segnale specifico, che è importante in molte vie di trasduzione del segnale e metaboliche. Il prodotto principale di questa reazione è il cAMP, con un prodotto secondario di PPi. Le regioni citoplasmatiche di ADCY consistono nel suo N-terminale, C1a, C1b, C2a e C2b. Il C1a e il C2a costituiscono il dominio catalitico. Questa pagina si concentra sull’adenilciclasi microbica Rv1264, ma anche le adenilciclasi dei mammiferi sono trattate in modo meno dettagliato.

La proteina associata all’adenilciclasi (CAP) regola il citoscheletro di actina e l’adesione cellulare in tutti gli eucarioti.

Per l’adenilato ciclasi sensibile alla calmodulina vedi Anthrax edema factor.

Introduzione

Ci sono dieci isozimi di adenil ciclasi nei mammiferi, adenil ciclasi tipo I-X, (ADCY I-X), e molti altri in altri organismi. Tutti i mammiferi, e la maggior parte delle altre adenilciclasi appartengono alla classe III; la maggior parte sono proteine integrali di membrana, e tutte producono cAMP, la cui capacità può essere attivata o inattivata in risposta a determinate condizioni o ligandi. Tutte le adenilciclasi legate alla membrana dei mammiferi sono attivate dalle subunità alfa delle proteine G, ma rispondono in modo diverso a ligandi come ioni magnesio, ioni calcio e subunità beta gamma delle proteine G. Uno degli isozimi dei mammiferi e alcune forme procariotiche di adenilciclasi rispondono alle condizioni ambientali, principalmente al pH.

Adenosina monofosfato ciclico

Nei mammiferi, il cAMP agisce come un messaggero secondario, una delle sue funzioni è quella di controllare l’attività della protein chinasi A (PKA). A sua volta, PKA ha ruoli molto diversi nelle cellule, mentre la maggior parte di essi sono associati al metabolismo, PKA svolge anche ruoli importanti nella trascrizione, il ciclo cellulare e l’apoptosi. Il destino finale del cAMP è la sua trasformazione in AMP tramite la scissione del legame fosfodiestere da parte della fosfodiesterasi 3′, 5′-monofosfato adenosina ciclica.

Pirofosfato

La scissione del sottoprodotto di questa reazione, PPi, da parte della pirofosfatasi produce due molecole di fosfato inorganico (Pi). L’ATP sintasi può reincorporare questo fosfato inorganico in adenina difosfato (ADP) per produrre ATP usando l’energia della forza motrice protonica.

Adenilciclasi dei mammiferi

Ci sono dieci isozimi di adenilciclasi nei mammiferi, adenilciclasi di tipo I-X, (ADCY I-X); Nei mammiferi l’adenilciclasi gioca un ruolo importante nelle vie di trasduzione del segnale in cui il cAMP è un messaggero secondario.

ADCY I-IX condividono tutti una struttura generale; sono composti da due regioni trans-membrana (M1, M2) che sono composte da sei eliche che attraversano la membrana e funzionano per mantenere l’enzima ancorato nella membrana, e due regioni citoplasmatiche (C1, C2) che possono essere ulteriormente suddivise (C1a, C1b, C2a, C2b) e sono responsabili di tutta l’attività catalitica, e la regolazione da parte delle proteine G e forskolina. In soluzione, i domini C1a e C2a possono formare eterodimeri tra loro, sia nello stesso enzima che in enzimi diversi, oppure possono formare omodimeri con le loro unità identiche su enzimi diversi. Il dominio C1b è molto grande (≈15 kDa) con molti siti di regolazione, e ha una struttura variabile tra gli isozimi; mentre il dominio C2b è quasi inesistente in molti isozimi, e non è ancora stato associato a una funzione particolare.

Tipo II

Struttura

Un monomero di dominio C2 di ha un interno, idrofobico, antiparallelo circondato da diversi, anfipatici , tranne che per un’area che aveva bisogno di formare un omodimero con un altro dominio C2. Due monomeri di domini C2 dell’adenilciclasi di tipo II si legano insieme in soluzione per formare un , che è necessario per la conversione catalitica di ATP in cAMP e PPi. Quando sono legati, creano un profondo crepaccio che attraversa il centro del loro sito di legame; questo crepaccio è adatto a legare due molecole alle sue estremità. Forti legami idrogeno si creano tra gli atomi di ossigeno della forskolina e la spina dorsale peptidica circostante, e il resto delle interazioni sono altamente idrofobiche, poiché il sito di legame della forskolina contiene dieci residui alifatici e aromatici. Questo legame della forskolina crea un legame idrofobico tra i monomeri, ognuno dei quali ha due diverse superfici idrofobiche che si legano alla forskolina; ed è questa interazione che rende stabile l’omodimero. La forskolina interagisce anche con e posiziona correttamente Asn 1025, che è essenziale per l’attività catalitica, e può anche interagire direttamente con l’ATP. Questo complesso omodimero-forskolina può essere ulteriormente attivato in risposta a un segnale attraverso il legame alla subunità βγ di una proteina G. Questa subunità βγ si lega a che fanno parte di un’α-elica sullo strato più esterno del complesso.

Il di questo omodimero si trova all’interno del crepaccio, ed è caratterizzato da due serie altamente conservate di residui polari (Arg 997 (Verde), Asn 1025 (Rosso), Ser1028(Rosa), Arg 1029(Arancione), Asp 1031(Giallo), e Ser 1032(Viola)). Uno di questi insiemi si trova su ogni subunità monomerica, sull’omodimero si dispongono in modo antiparallelo, dove puntano l’uno verso l’altro.

Disturbi da sovraespressione

Nel cervello dei mammiferi, l’esecuzione delle funzioni basate sulla memoria è svolta dalla corteccia prefrontale (PFC). I canali iperpolarizzati attivati da nucleotidi ciclici (HCN) sui neuroni si chiudono per permettere ai segnali elettrochimici di fluire lungo l’assone e in una sinapsi; quando i canali HCN sono aperti, il segnale elettropotenziale non può essere trasmesso attraverso la cellula. L’esposizione di questi canali al cAMP li fa aprire, fermando la trasmissione dei segnali, e quindi compromette i pensieri cognitivi superiori. Nei pazienti con schizofrenia, una molecola regolatrice di cAMP, Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) è mutata e non può regolare i livelli di cAMP; così, livelli elevati di cAMP possono causare la schizofrenia. La chiusura dei canali HCN si pensa abbia un ruolo in altri disturbi, come l’ADHD e il disturbo bipolare. Quindi, è ragionevole che la regolazione della produzione di cAMP mirando all’adenilciclasi di tipo II, dato che si trova nel cervello, possa agire come trattamento per questi disturbi.

Rv1264 Adenilciclasi

Anche se l’adenilciclasi si trova in tutti gli organismi a livello universale, gli organismi lontanamente correlati hanno diverse modifiche dell’enzima, ognuno è specializzato per un particolare compito in un particolare ambiente. Come detto prima, gli esseri umani hanno 10 isozimi noti di adenilciclasi; mentre l’Escherichia coli ha solo un isozima e il Mycobacterium tuberculosis ne ha 15. Una adenilciclasi particolarmente interessante posseduta dal M. tuberculosis, Rv1264, ha un N-terminale che, in un certo senso, agisce come un sensore di pH, poiché regola l’attività dell’enzima in base al pH della soluzione circostante. Questa adenilciclasi, come la maggior parte delle altre, appartiene alla classe III, le adenilciclasi di questa classe hanno domini multipli, almeno uno per la catalisi, e un altro per la regolazione.

Struttura

L’adenilciclasi è una proteina lunga 363 residui composta da un catalizzatore e un regolatore che contiene un flessibile che collega i due. La struttura attiva è un omodimero che assomiglia all’omodimero di tipo II dei mammiferi, dove un’α-elica di un monomero (catena A) è posta attraverso la spirale centrale di un altro (catena B). Questa dimerizzazione pone il dominio regolatore della catena A in prossimità del dominio catalitico della catena B, e viceversa. Due elementi di commutazione sono presenti nella proteina, uno nel dominio C-terminale (α1-switch) e un altro nella regione del linker (αN10-switch), questi permettono grandi cambiamenti conformazionali nell’enzima in risposta a cambiamenti ambientali relativamente piccoli.

Dominio catalitico C-Terminale

L’attività catalitica in Rv1264’s è svolta dai residui: Asp 222 (Rosso), Lys 261 (Blu), Asp 265 (Arancione), Arg 298 (Rosa), Asp 312 (Giallo), Asn 319 (Viola), Arg 323 (Verde). Tutti questi residui creano un ambiente altamente polare che è complementare per carica e polarità all’intermedio della reazione. I residui che guidano i fosfati dell’ATP, arginina 298 e 323, legano un nel sito attivo. Questo ione solfato si trova nella posizione che sarà occupata dal β-fosfato dell’ATP durante la catalisi. Nel processo di catalisi il β-fosfato viene scisso dall’α-fosfato; questa reazione può essere resa più favorevole abbassando l’energia attraverso associazioni di carica complementare tra il β-fosfato e le arginine 298 e 323. Un altro residuo, , lega una molecola attraverso interazioni elettrostatiche. La funzione specifica di questa associazione è sconosciuta, ma a causa della sua vicinanza al sito attivo può avere un ruolo nella catalisi.

Il sequenziamento degli aminoacidi ha dimostrato che la sequenza tra il dominio catalitico dell’adenilciclasi Rv1264 e il dominio catalitico dell’adenilciclasi dei mammiferi non sono ben conservati, con solo circa il 25% di corrispondenza con l’adenilciclasi di tipo II dei mammiferi discussa sopra. I due diversi isozimi, tuttavia, si assomigliano ancora in quanto la sovrapposizione di uno sull’altro ha una sostanziale sovrapposizione, con una deviazione quadratica media (rmsd) di meno di 1,76Å tra il 79% di tutti . Una notevole differenza tra Rv1264 e i domini catalitici dell’adenilciclasi di tipo II è la loro dimensione relativa; Rv1264 non ha un braccio di dimerizzazione e molti dei suoi anelli sono stati accorciati. Questo ha come risultato che il dominio catalitico dell’adenilciclasi Rv1264 si associa come un dimero con un’area di interfaccia più piccola rispetto al tipo II dei mammiferi, con aree di interfaccia di 1900Å2 e 3800Å2, rispettivamente. I siti attivi delle adenilciclasi Rv1264 e dei mammiferi di tipo II sono ancora più conservati; i siti attivi hanno un rmsd di solo 0,69Å, e nel sito attivo hanno un rmsd di 1,17Å.

Tutte le informazioni strutturali di cui sopra per il dominio catalitico C-terminale sono vere solo quando l’enzima è nel suo stato attivo. Lo stato inattivo dell’enzima possiede un sito attivo smontato, quindi nessuna attività catalitica. Rispetto ai domini N-terminali fissi, ciascuno dei domini monomerici C-terminali può trasporsi fino a 6Å e ruotare di 55o. Questo massiccio cambiamento nella struttura terziaria dei domini C-terminali smonta il sito attivo, spostando i residui catalitici fino a 25Å dalla loro posizione cataliticamente attiva. Non solo il sito attivo è interrotto nel dominio C-terminale, ma l’area di interfaccia tra i due monomeri diminuisce in dimensione da 1900Å2 a 930Å2.

α1-switch

Si trova all’interno del dominio catalitico C-terminale ed esiste come una compatta α-elica quando l’enzima è nel suo stato attivo. All’inattivazione, la conformazione α-elica dell’interruttore α1 diventa instabile, e si trasforma in una bobina casuale. Poiché questo interruttore si trova in prossimità del sito attivo, un cambiamento importante nella struttura disturba notevolmente il sito attivo, e rende l’enzima inattivo.

Questa struttura è conservata nelle adenilciclasi dei mammiferi, dove agisce come contributore per il sito di legame dei βγ-fosfati del substrato ATP. Funziona anche nella regolazione delle adenilciclasi dei mammiferi, insieme ad un’altra α-elica, forma il sito di legame per le subunità delle proteine Gsα e Giα che regolano l’attività delle adenilciclasi.

Dominio N-Terminale Regolatore

Il dominio N-terminale funziona nella regolazione; ha un meccanismo unico che determina se l’enzima sarà attivo o meno in base al pH della soluzione circostante. Ogni monomero nel dimero cataliticamente attivo ne ha dieci, quando sono dimerizzati formano una struttura a disco. Una singola molecola di si lega in una tasca idrofoba. La funzione di questo polietilenglicole sembra essere strutturale; tuttavia, il suo posizionamento specifico e il movimento tra le forme attive e inattive dell’enzima suggerisce che può anche funzionare nel rilevare i cambiamenti di idrofobicità nell’ambiente.

αN10-switch

Si trova all’interno della regione linker e il suo cambiamento conformazionale ha un effetto più drastico sull’intero enzima rispetto all’α1-switch. Quando l’enzima è attivo, l’αN10-switch consiste in una bobina casuale con una breve α-elica; questa conformazione permette solo una debole interazione tra il dominio regolatore N-terminale e il dominio catalitico C-terminale, permettendo all’enzima di esibire attività catalitica. Questa elica può estendersi fino a 24Å, che separa i domini catalitici monomerici C-terminali del dimero. Questa separazione dei domini abbassa la loro area di interfaccia e traspone i residui; come discusso in precedenza, questi cambiamenti portano a un’inattivazione dell’enzima, e quindi, una delle principali caratteristiche dello stato inattivo dell’enzima è un αN10-switch esteso. Quando l’αN10-switch si estende, si muove verso l’esterno, e il pentaetilenglicole si sposta in una cavità appena formata dall’elica αN10. Questo supporta ulteriormente l’idea che il ligando del pentaetilenglicole funzioni non solo per la struttura, ma anche per la regolazione.

Regolazione del pH

All’inizio della regione del linker c’è un residuo, , che ha una notevole influenza sulla regolazione del pH. A un pH basico il residuo non ha carica e ha interazioni minime con i due residui cataliticamente importanti, che si trovano a 14 Å e 21 Å di distanza dalle loro posizioni cataliticamente attive. L’enzima è inattivo in questo stato, non solo a causa dei residui Lys 261 e Asp 312, ma anche a causa di altri importanti componenti strutturali del sito catalitico che vengono smontati. A un pH acido Rv1264 diventa attivo (pH ottimale ~ 5,8) e ha un aumento di attività fino a 40 volte. A questo pH acido, l’His 192 diventa protonato e caricato positivamente; il che crea importanti cambiamenti strutturali in tutta la proteina, compresa la compattazione di entrambi gli interruttori αN10 e α1, la contrazione dell’α4-elica che a sua volta causa una traslocazione del ligando paraetilenglicole. L’His 192, caricato positivamente, respinge elettrostaticamente i residui Lys 261 e Asp 312 che, insieme ad altri cambiamenti strutturali, li traspone rispettivamente 14 Å e 21 Å nelle loro posizioni cataliticamente attive.

, un residuo che organizza molti residui che sono importanti nell’interazione C-terminale – N-terminale attraverso legami a idrogeno, è anche importante per la regolazione. Quando questo residuo è mutato, la regolazione basata sul pH viene persa e l’enzima è costantemente attivo.

Molti altri residui contribuiscono anche alla regolazione del pH; sono le interazioni elettrostatiche e i legami a idrogeno nell’interfaccia del dominio C-terminale – N-terminale che permettono all’adenil ciclasi Rv1264 di essere sensibile al pH.

Ruolo biologico

M. tuberculosis è un batterio patogeno, e quindi affronta una serie di risposte immunitarie dell’ospite per tentare di liberarsene. Uno dei meccanismi di difesa dell’ospite che M. tuberculosis affronta è l’acidificazione incontrata nei fagolisosomi. La capacità di essere in grado di rilevare questo ambiente acido, e di avere una risposta appropriata ad esso può aiutare notevolmente M. tuberculosis a infettare un ospite. Quando i livelli di cAMP sono aumentati, l’acidificazione di altre strutture è ritardata e i livelli elevati di cAMP attivano le proteine recettrici di cAMP che a loro volta regolano la trascrizione.

Strutture 3D di adenililciclasi

3D Strutture 3D di adenilciclasi