Adventitious Root
Methods for Rooting Microshoots
Se i microshoots non formano radici durante la fase di moltiplicazione, devono ricevere trattamenti speciali per iniziare e far crescere un sistema di radici avventizie. I micro-rami possono essere fatti radicare in vitro e poi acclimatati all’ambiente circostante, o possono essere fatti radicare ex vitro, combinando così radicazione e acclimatazione.
La facilità e il tasso di successo della radicazione determinano quale metodo viene usato su una particolare cultivar. Il metodo più conveniente è quello di far radicare i micro-rami ex vitro. La radicazione ex vitro risparmia un ulteriore trasferimento in vitro al terreno di radicazione e accelera l’acclimatazione rendendo la micropropagazione più efficiente. La radicazione in vitro è usata se mancano strutture di radicazione ex vitro e di acclimatazione, se i tassi di successo sono bassi con la radicazione ex vitro, e a discrezione del direttore del laboratorio.
Radicazione in vitro. Gli ingredienti del terreno e le condizioni di incubazione sono facili da cambiare quando si usano le condizioni in vitro per promuovere l’inizio e lo sviluppo precoce delle radici. Le formulazioni dei sali nutritivi possono rimanere le stesse, essere cambiate o ridotte, spesso a macrosali a metà forza, e l’umidità relativa ridotta dall’uso di coperchi ventilati (Figura 5). Le condizioni di incubazione della cultura di luce e temperatura possono essere cambiate per la radicazione. Molti microshoots sono incubati nell’oscurità per un periodo per l’inizio delle radici e poi trasferiti in condizioni di luce.
Figura 5. Il nastro chirurgico a micropori fornisce la ventilazione a questo vaso di germogli in fase di radicazione; questo aiuta a ridurre l’umidità relativa e prepara le nuove piante per l’ambiente della serra.
Il terreno nutritivo di radicazione su cui sono posti i micro germogli appena tagliati contiene generalmente l’auxina. Tipicamente, concentrazioni micromolari di IBA e/o NAA sono aggiunte al terreno prima dell’autoclavaggio. La concentrazione di auxina dipende dalla specie e dalla cultivar. Queste informazioni sono tipicamente disponibili online usando un motore di ricerca accademico, come Google Scholar http://scholar.google.com/. Di solito il nome della pianta, le parole ‘vitro’ e ‘radice’ (o radice avventizia) nella stringa di ricerca daranno informazioni specifiche. Se la letteratura manca per una particolare pianta, usa i parenti stretti nella ricerca per determinare come hanno risposto.
Perché è riconosciuto che le stesse concentrazioni di auxina che stimolano l’inizio delle radici avventizie possono inibire lo sviluppo delle radici, alcuni usano un approccio a due mezzi. Quando i micro-rami di Cotinus coggygria sono stati su un terreno contenente 10 µM IBA per 5 giorni prima del trasferimento su un terreno privo di auxina, il 100% ha radicato; mentre solo il 40% ha radicato con una cultura continua su un terreno con 10 µM IBA (Metivier et al., 2007). Padilla e Burgos (2010) hanno coltivato microshoots di olivo su terreni contenenti fino a 4 µM IBA per 2 settimane seguite dal trasferimento su terreno di base senza auxina che ha portato al 65-93% di radicazione, a seconda della cultivar.
In alcuni casi, le soluzioni di IBA sono state applicate ai microshoots come un bagno di base per un minuto o più. Tsvetkov et al. (2007) hanno ottenuto la loro migliore radicazione di micro-rami di Sorbus domestica quando sono stati immersi in una soluzione di 14,8 µM IBA per 80 s prima di essere messi sul terreno di base.
L’oscurità durante o prima della radicazione può aumentare il successo della radicazione e la sincronia della radicazione tra i micro-rami. L’eziolamento, lo sviluppo di germogli senza luce, aumenterà la competenza cellulare per la radicazione avventizia (Murray et al., 1994). Quando i micro-rami di noce sono stati eziolati, la radicazione è stata migliore con un’emergenza più rapida delle radici rispetto ai germogli verdi (Leslie et al., 2010); tuttavia, i germogli eziolati erano fragili e richiedevano una manipolazione più attenta.
Coltivare i micro-rami verdi sul terreno di radicazione al buio per un periodo relativamente breve può migliorare notevolmente la radicazione. Un periodo di oscurità per 4-7 giorni su un mezzo Murashige e Skoog contenente 1 µM di floroglucinolo e 1,4 µM di IBA, seguito da un’incubazione in condizioni di luce, ha portato a una migliore radicazione dei microrami di mela ‘Delicious’ rispetto alla coltura alla sola luce o al buio per periodi più lunghi (Zimmerman, 1984). Quando si sono coltivati i micro-raccolti del portainnesto di mela ‘MM106’ su un terreno con 4 µM IBA nell’oscurità per 0-10 giorni, è stato scoperto attraverso l’indagine istologica che l’induzione delle radici è avvenuta durante i primi 3 giorni o meno nell’oscurità e che i primordi delle radici coniche erano visibili dal 7° giorno (Naija et al., 2008). La tempistica del trattamento nell’oscurità è critica e può aver bisogno di essere determinata per ogni coltura o genotipo; tuttavia, può migliorare notevolmente il successo della radicazione.
Alcune specie radicano meglio se le cime dei micro-rami sono illuminate e la porzione basale nel mezzo è nell’oscurità, simile al modo in cui le macrofotografie sono radicate in un mezzo di serra sotto nebbia. L’oscuramento del mezzo può essere ottenuto dipingendo l’esterno dei recipienti di coltura di nero fino a poco sopra il livello del mezzo e coprendo il mezzo con granuli sterili di policarbonato o altre sostanze che escludono la luce o oscurando il mezzo stesso con l’aggiunta di carbone attivo. A volte un mezzo di serra, come la vermiculite, che esclude anche la luce, viene usato per la radicazione in vitro dopo essere stato bagnato con il mezzo nutritivo.
E’ stato dimostrato che oscurando solo le basi dei micro-rami si è aumentata la radicazione di mandorle, pesche e olive (Rugini, 1988) e mele (Mencuccini e Rugini, 1993) rispetto ai controlli incubati al buio o sotto la luce. Tuttavia, in uno studio separato, Mencuccini e Rugini (1993) hanno riferito che l’oscuramento basale aveva poco effetto sulla radicazione dei micro-rami di mandorla, albicocca, castagna, jojoba e oliva ed era inibitorio per il noce. Pertanto, se il successo di radicazione è inferiore a quello auspicabile, l’imbrunimento della base può essere utile.
Radicazione ex vitro. Se le percentuali di radicazione sono simili, la radicazione ex vitro può essere più efficiente e conveniente della radicazione in vitro (Leva, 2011). I costi sono più alti quando si fa la radicazione in vitro a causa degli ingredienti, del tempo di preparazione, dell’autoclavaggio dei media, del lavoro per i trasferimenti e lo spostamento delle colture e dello spazio di incubazione. Il trasferimento alla serra è simile tra la radicazione in vitro e quella ex vitro, e il tempo di trapianto può essere simile o più lento quando ci sono radici sui micro-rami (Figure 4 e 6). L’efficienza si guadagna con la radicazione ex vitro. È stato riportato che la qualità delle radici delle micropiante di noce è superiore quando le radici si formano ex vitro sotto nebbia rispetto a quelle in vitro in un terreno gelificato (Leslie et al., 2010).
Figura 6. (a) e (b) Piantine di ciliegio micropropagate in vitro, pronte per essere trapiantate in un terreno di torba di sfagno in serra prima di essere messe sotto alta umidità relativa per l’acclimatazione. (c) Le piantine di ciliegio piantate come primo passo dell’acclimatazione in serra. (d) Piantine di noce piantate in un appartamento prima di essere messe sotto alta umidità relativa in serra.
La radicazione ex vitro può essere un miglioramento della radicazione in vitro. Anche se i microrami in vitro di Gardenia jasminoides hanno radicato in 10 giorni, rispetto ai 14 dei microrami ex vitro, tutti i microrami radicati ex vit sono sopravvissuti all’acclimatazione rispetto all’80% di sopravvivenza dei microrami radicati in vitro (Hatzilazarou et al., 2006). La sopravvivenza più scarsa dei micro-rami radicati in vitro rispetto ai micro-rami radicati ex vit è stata riportata anche per il noce (Leslie et al., 2010).
Può essere necessario trattare i micro-rami con auxina prima di piantarli nel terreno di radicazione per la radicazione ex vit. I micromovimenti di pistacchio trattati con il 2% di IBA in talco hanno radicato ex vitro al 79% rispetto al 48% di radicazione dei controlli (Benmahioul et al., 2012).
Un migliore radicamento ex vit può essere ottenuto anche con l’auxina applicata come un liquido per immersione applicato alla porzione basale dei micromovimenti. Un impulso di 15 minuti in 250 µM IBA ha fatto radicare il 90% dei micro-rami della specie arborea Melia azedarach rispetto a nessuna radicazione sui micro-rami di controllo (Husain e Anis, 2009). Un’immersione di 2 ore in una soluzione acquosa di 588 µM IBA ha fatto radicare il 90% delle microshoots di Malus zumi rispetto al 20% di radicazione dei controlli (Xu et al., 2008).
Forse a causa di un ritorno alla giovinezza, aumentare il tempo di moltiplicazione in vitro può aumentare la radicazione delle microshoots. Leva e Petruccelli (2012) hanno testato la radicazione fino a sette subcolture e hanno scoperto che la radicazione era migliore dopo la settima subcoltura.
Le strutture, la specie, il metodo di spedizione, la domanda dei clienti e le preferenze manageriali sono tutti fattori che dettano il modo in cui i micro-rami sono radicati. Le specie che radicano molto facilmente o che radicano durante la fase di proliferazione dei germogli possono essere acclimatate rapidamente all’ambiente ex vitro. Sono le specie difficili che ricevono un’attenzione speciale, per quanto riguarda l’illuminazione, il trattamento con auxina, la radicazione in vitro o ex vitro, e altri fattori. I cloni che sono difficili da radicare richiedono prezzi più alti dai clienti perché la radicazione è un impedimento alla produzione efficiente. La radicazione può essere migliorata se viene affrontata come un processo a più fasi di acquisizione della competenza, di iniziazione delle radici e di successiva crescita delle radici. Tutte queste fasi devono essere considerate e affrontate, specialmente con i cloni più difficili da radicare.