AmpR aumenta la virulenza di Klebsiella pneumoniae resistente ai carbapenemi regolando la fase iniziale della sintesi delle capsule

Introduzione

Classico K. pneumoniae (cKp) e K. pneumoniae ipervirulento (hvKp) sono due patotipi globali di K. pneumoniae attualmente in circolazione.1,2 In Nord America e in Europa, la maggior parte delle infezioni da K. pneumoniae sono causate da isolati cKp, che sono più comunemente patogeni opportunisti che causano infezioni principalmente nell’ambiente sanitario in ospiti immunocompromessi. La caratteristica più problematica di questo patotipo è la capacità di acquisire un numero crescente di elementi che conferiscono resistenza antimicrobica. K. pneumoniae resistente ai carbapenemi (CRKP) associato a carbapenemasi codificate da plasmidi pone sfide cliniche distinte e produce infezioni invasive con elevata mortalità.3,4

Rapporti da Taiwan hanno descritto una sindrome clinica unica di infezione da K. pneumoniae acquisita in comunità e invasiva nei tessuti in individui sani, che spesso si presenta in più siti o si diffonde successivamente, inclusi ascessi epatici piogenici.5,6 hvKp è stato designato per distinguere questo patotipo da cKp, e l’incidenza delle infezioni dovute a hvKp è stata in costante aumento negli ultimi 3 decenni nei paesi dell’Asia-Pacifico.7-11 hvKp è solitamente sensibile agli antimicrobici, ma è stato trovato resistente, e persino un isolato cKp estensivamente resistente ai farmaci (XDR) che ha acquisito parte di un plasmide di virulenza hvKp ha causato un focolaio nosocomiale mortale.12-Una caratteristica che inizialmente si riteneva essere sensibile e specifica per gli isolati hvKp era un fenotipo ipermucoviscoso, definito da un test di stringa positivo.16 Tuttavia, ha creato una certa confusione poiché non tutti gli isolati hvKp sono stati determinati come ipermucoviscosi, e alcuni isolati cKp possedevano questa caratteristica.17 Recentemente, è stato dimostrato che più biomarcatori, tra cui peg-344, iroB, iucA, rmpA e rmpA2 codificati nel plasmide e la produzione quantitativa di sideroforo, sono in grado di predire accuratamente gli isolati hvKp; questi biomarcatori potrebbero essere utilizzati per sviluppare un test diagnostico da utilizzare nei laboratori clinici per la cura ottimale dei pazienti e per la sorveglianza epidemiologica e la ricerca.18 Tuttavia, in questo studio, abbiamo identificato un nuovo gruppo di isolati CRKP non ipermucoviscosi privi della maggior parte dei geni specifici per hvKp. Uno studio di associazione pan genoma-wide (Pan-GWAS), un’analisi del proteoma e un test di virulenza in un modello animale hanno rivelato che AmpR aumenta la virulenza di questi isolati regolando l’inizio della sintesi delle capsule. Inoltre, abbiamo anche scoperto che l’ampR portato dai ceppi K-locus 47 (KL47) in questo studio non era in grado di aumentare la virulenza di KL1 hypermucoviscous K. pneumoniae.

Materiali e metodi

Isolati clinici e raccolta dati

Gli isolati clinici non ripetitivi di K. pneumoniae sono stati raccolti da campioni rilevati e conservati di routine di 5 ospedali del Dipartimento di Medicina di Laboratorio nelle province di Guangdong e Anhui tra il 2018 e il 2019. Tutti gli isolati sono stati conservati a -80°C prima dell’uso. Sono state ottenute informazioni cliniche sui pazienti. L’identificazione delle specie e il test di suscettibilità antimicrobica sono stati eseguiti con il sistema compatto VITEK-2 (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Francia). I risultati sono stati interpretati secondo le linee guida pubblicate dal Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI; documento M100-S26).19 Le specie identificate di tutti gli isolati sono state confermate con la spettrometria di massa a desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Francia). CRKP è stato definito come resistente a imipenem o meropenem.

Caratterizzazione fenotipica ipermucoviscosa

Per identificare il fenotipo ipermucoviscoso con lo string test, gli isolati sono stati inoculati su piastre di agar contenenti 5% di sangue di pecora e incubati a 37°C per una notte. Il test dello spago è stato considerato positivo quando è stato possibile generare un filo viscoso più lungo di 5 mm toccando una singola colonia con un anello di inoculazione standard e tirando la colonia verso l’alto.2

Whole Genome Sequencing (WGS)

Un volume di coltura di 1 mL (densità ottica a 600 nm di 0,6) è stato utilizzato per l’estrazione del DNA genomico (gDNA) (Sangon, Shanghai, Cina). gDNA è stato sequenziato su un sequenziatore Illumina HiSeq 2500 (Illumina, San Diego, CA, USA) utilizzando paired-end 150-bp legge. L’assemblaggio del genoma è stato eseguito utilizzando de novo SPAdes Genome Assembler (versione 3.12.0).20 Abbiamo eseguito la tipizzazione delle capsule sulle sequenze assemblate con Kaptive (versione 0.5.1).21 I geni di resistenza antimicrobica e i fattori di virulenza sono stati identificati negli isolati attraverso la scansione dei contigs del genoma contro i database ResFinder e VFDB utilizzando ABRicate (versione 0.8.7). Le analisi di genotipizzazione Multilocus sequence typing (MLST) e core genome MLST (cgMLST) sono state eseguite con Ridom SeqSphere+ (versione 5.1.0).22 Il tipo complesso (CT) è stato definito seguendo lo schema cgMLST di K. pneumoniae (www.cgmlst.org/ncs/schema/2187931). La costruzione dell’albero filogenetico basato sulle varianti a singolo nucleotide del genoma centrale (SNVs) è stata eseguita utilizzando la suite Harvest (versione 1.2) con un test 1000-bootstrap.23 Lo strumento online iTOL è stato utilizzato per visualizzare, manipolare e annotare l’albero filogenetico.24 Abbiamo annotato le sequenze del genoma con Prokka (versione 1.13.3).25

Pan Genome-Wide Association Study (Pan-GWAS) Analysis

Abbiamo usato la pipeline pan genoma Roary (versione 3.12.0) per mettere gli assemblaggi annotati in formato GFF3 (prodotti da Prokka) e calcolato il pan genoma.26 Abbiamo usato Scoary (versione 1.6.16) per prendere il file da “https://sanger-pathogens.github.io/Roary/”, creato un file di tratti e calcolato le associazioni tra tutti i geni del genoma accessorio e i tratti. Abbiamo riportato un elenco di geni ordinati per forza di associazione con P-value < 0,01 aggiustato con il metodo di Benjamini-Hochberg per la correzione dei confronti multipli.27

Analisi del Proteoma

Un volume di cultura di 1 mL (densità ottica a 600 nm di 0,6) è stato usato per l’estrazione delle proteine. Il campione è stato sonicato tre volte in ghiaccio usando un processore a ultrasuoni ad alta intensità (Scientz) in un tampone di lisi (8 M urea, 1% cocktail di inibitori di proteasi). I detriti rimanenti sono stati rimossi mediante centrifugazione a 12.000 g a 4°C per 10 minuti. Infine, il surnatante è stato raccolto e la concentrazione proteica è stata determinata con un kit BCA secondo le istruzioni del produttore. Per la digestione, la soluzione proteica è stata ridotta con 5 mM di ditiotreitolo per 30 min a 56°C e alchilata con 11 mM di iodoacetamide per 15 min a temperatura ambiente al buio. Il campione proteico è stato poi diluito aggiungendo 100 mM TEAB con urea ad una concentrazione inferiore a 2M. Infine, la tripsina è stata aggiunta ad un rapporto di 1:50 tra tripsina e massa proteica per la prima digestione durante la notte e un rapporto di 1:100 tra tripsina e massa proteica per una seconda digestione di 4 ore. I peptidi triptici sono stati sciolti in 0,1% di acido formico (solvente A) e caricati direttamente su una colonna analitica a fase inversa fatta in casa (lunghezza 15 cm, 75 μm i.d.). Il gradiente è stato eseguito come segue: un aumento dal 6% al 23% di solvente B (0,1% di acido formico in 98% acetonitrile) su 26 min, un aumento dal 23% al 35% di solvente B in 8 min, un aumento al 80% di solvente B in 3 min e tenendo al 80% di solvente B per gli ultimi 3 min ad una portata costante di 400 nL/min su un EASY-nLC 1000 sistema UPLC. I peptidi sono stati sottoposti a fonte NSI seguita da spettrometria di massa tandem (MS / MS) in Q ExactiveTM Plus (Thermo) accoppiato in linea alla UPLC. La tensione elettrospray applicata era di 2,0 kV. La gamma di scansione m / z era 350 a 1800 per la scansione completa, e peptidi intatti sono stati rilevati nel Orbitrap ad una risoluzione di 70.000. Peptidi sono stati poi selezionati per MS / MS utilizzando l’impostazione NCE di 28, ei frammenti sono stati rilevati nel Orbitrap ad una risoluzione di 17.500. La procedura dipendente dai dati si alternava tra una scansione MS seguita da 20 MS / MS scansioni con 15,0 s esclusione dinamica. Il controllo automatico del guadagno (AGC) è stato impostato su 5E4. La prima massa fissa è stata impostata a 100 m/z. I dati MS/MS risultanti sono stati elaborati utilizzando il motore di ricerca MaxQuant (v.1.5.2.8). Abbiamo usato InterProScan (versione 5.37-76.0) per annotare i domini proteici. Un p-value corretto < 0.05 e un fold change > 1.2 sono stati considerati significativi.

Costruzione del mutante di complemento ampR

K. pneumonia ampR (Materiali supplementari) è stato sintetizzato e affiancato da siti di restrizione 5ʹXbaI e 3ʹHindIII. Questo frammento è stato digerito per restrizione e clonato in pUC57. Il DNA ricombinante è stato recuperato in Escherichia coli DH5α con selezione di ampicillina. Dopo la digestione per restrizione, il frammento ampR è stato legato al vettore di espressione pBAD33 (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore. pBAD33-ampR è stato utilizzato per la trasformazione utilizzando l’elettroporazione come standard per E. coli isolati in laboratorio. I ceppi di complemento ampR sono stati confermati dalla reazione a catena della polimerasi (PCR) (Tabella S1). L’espressione di ampR è stata indotta aggiungendo 100 μg/mL di arabinosio.

Modelli di infezione polmonare nei topi

Un modello di polmonite di K. pneumoniae nei topi è stato utilizzato per testare la virulenza degli isolati. Topi femmina BALB/c di sei-otto settimane di età in condizioni di assenza di patogeni specifici sono stati acquistati da Hunan SJA Laboratory Animal Co. I topi sono stati anestetizzati intraperitonealmente con pentobarbital sodico (75 mg/kg) e inoculati con 1,0 × 107 unità formanti colonie (CFU) di K. pneumoniae mediante instillazione intratracheale non invasiva sotto visione diretta. La sopravvivenza dei topi è stata osservata per 7 giorni dopo l’infezione. Per valutare la carica batterica nel polmone, gli organi dei topi infetti sono stati omogeneizzati e sciolti in 1 mL di soluzione tampone fosfato (PBS); 50 μL sono stati inoculati su piastre di agar brodo liquido (LB), e l’enumerazione CFU è stata eseguita. Per l’analisi istopatologica, i segmenti dei polmoni sono stati fissati con formalina neutra al 10%, inseriti in paraffina e colorati con ematossilina ed eosina per la visualizzazione al microscopio ottico. La carica batterica e l’analisi istopatologica sono state eseguite dopo 24 ore di infezione.

Estrazione e quantificazione del polisaccaride capsulare

I polisaccaridi capsulari sono stati estratti con il detergente Zwittergent 3-14. La quantità di acido uronico è stata poi misurata secondo il metodo descritto in precedenza.28 In parallelo, diluizioni seriali della coltura batterica sono state piastrate per determinare il numero di CFU, e la concentrazione di polisaccaride capsulare è stato espresso in base alla quantità di acido glucuronico (μg) per 109 CFU/mL di campione. Ogni esperimento è stato eseguito in triplicato.

Analisi statistica

L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software GraphPad Prism versione 8 (La Jolla, California).

Risultati

Caratteristiche degli isolati

In questo studio sono stati utilizzati isolati CRKP non ripetitivi (n = 135). Tutti gli isolati erano di tipo di sequenza 11 (ST11) ed esprimevano la carbapenemasi di K. pneumoniae (KPC-2), e 1 isolato portava sia OXA-23 che KPC-2 (Figura S1). Gli isolati sono stati assegnati a 16 CT usando lo schema cgMLST. I CT più comuni erano CT1313 (n = 35), CT1291 (n = 20), CT3176 (n = 14), CT1814 (n = 13), e CT2410 (n = 11), seguito da altri 11 CT identificati in meno di 10 isolati ciascuno (Figura 1). Tutti gli isolati sono stati assegnati a due tipi di KL, KL64 (n = 86) e KL47 (n = 49) (Figura S2). Non sono stati trovati isolati ipermucoviscosi. L’analisi dei geni di virulenza ha mostrato che nessun isolato portatore di tutti i biomarcatori per la differenziazione degli isolati hvKp e cKp era stato riportato in precedenza (Figura 1, Figura S2).18

Figura 1 Analisi filogenetica di 135 isolati in questo studio. I rami dei diversi isolati di tipo CT sono mostrati in colori. Gli isolati corrispondenti di ogni tipo CT sono CT1291 (da P1291-1 a P1291-20), CT1313 (da P1313-1 a P1313-33, da AH1313-1 a AH1313-2), CT1689 (da AH1689-1 a AH1689-8), CT1772 (da AH1772-1 a AH1772-4), CT1814 (da AH1814-1 a AH1814-13), CT1819 (AH1819), CT2405 (da P2405-1 a P2405-9), CT2410 (da P2410-1 a P2410-11), CT2418 (da P2418-1 a P2418-4), CT2444 (P2444), CT2445 (da P2445-1 a P2445-6), CT3175 (da AH3175-1 a AH3175-2), CT3176 (da AH3176-1 a AH3176-14), CT3178 (da AH3178-1 a AH3178-4), CT3179 (da AH3179-1 a AH3179-2), e CT3195 (AH3195). rmpA, rmpA2, magA iroB, peg-344 e iucA sono stati identificati per la differenziazione di K. pneumoniae ipervirulento da K. pneumoniae classico in uno studio precedente.18

Analisi dei dati clinici

Non ci sono state differenze significative tra le CT in termini di demografia, tipi di infezione, principali comorbidità, operazioni invasive, indice di comorbidità Charlson e punteggio di batteriemia Pitt, tranne che per il catetere venoso centrale, e mortalità in ospedale per tutte le cause (P = 0,035 e P = 0,001, test esatto di Fisher). I pazienti infettati con CT3176 avevano tassi di mortalità significativamente più alti (78,6% vs 37,1%, P = 0,012; 78,6% vs 20,0%, P = 0,001; 78,6% vs 7,7%, P = 0,0003; 78,6% vs 31,0%, P = 0,004; test esatto di Fisher) rispetto ai gruppi CT1313, CT1291, CT1814 e gli altri CT, rispettivamente. L’utilizzo di cateteri venosi centrali nella CT1814 era significativamente più alto di quello della CT1313 e CT1291 (84,6% vs 51,4%, P = 0,049; 84,6% vs 35,0%, P = 0,011, test esatto di Fisher) (Tabella 1).

Tabella 1 Demografia, comorbidità, Procedure invasive e mortalità dei pazienti con infezioni da Klebsiella pneumoniae resistenti ai carbapenemi

Analisi Pan-GWAS

Per identificare le basi genetiche di CT3176, abbiamo eseguito un’analisi Pan-GWAS tra i gruppi CT3176 e non-CT3176. Abbiamo identificato 39 geni con funzioni note associate a CT3176 (P < 0,01 aggiustato con il metodo di Benjamini-Hochberg) (Figura 2), compresi i fattori di virulenza, i geni di sintesi delle capsule, i geni di resistenza antimicrobica e i trasportatori di efflusso di più farmaci. Tra questi, ampR ha avuto la maggiore associazione con CT3176. Tuttavia, abbiamo notato che altri CT, come CT3178 e alcuni isolati CT1689 (AH1689-2 e AH1689-6), portavano anche il gene ampR (Figura 1). Tutti gli isolati che portano il gene ampR appartengono a KL47.

Figura 2 Analisi Pan-GWAS tra i gruppi CT3176 e non CT3176. Il pangenoma e le associazioni sono state calcolate con Roary e Scoary. Una mappa della trama è stata generata con ggplot2.

Analisi del proteoma

Tre isolati ampR+ (AH3176-1, AH3178-1 e AH1689-2) e tre ampR- (AH1689-3, AH1689-4 e AH1689-5) sono stati selezionati per l’analisi del proteoma. Un totale di 3093 proteine sono state identificate in entrambi i gruppi sulla base di 36.727 peptidi unici. Infine, abbiamo identificato 24 proteine differenzialmente espresse (DEP). Tra questi, 15 sono stati upregolati e 9 sono stati downregolati negli isolati ampR+ rispetto agli isolati ampR- (Figura 3A-C, Tabella S2). WcaJ ha avuto il più alto fold change ed è stato quindi evidenziato.

Figura 3 Analisi del proteoma e colorazione delle capsule. (A) Volcano plot che mostra il confronto dell’espressione proteica quantitativa tra ampR + (AH1689-2, AH3176-1 e AH3178-1) e ampR- (AH1689-3, AH1689-4, e AH1689-5) Klebsiella pneumoniae isolati. (B, C) Le proteine differenzialmente espresse con un cambiamento di fold superiore a 1.2 sono contrassegnate in colore.

Virulenza nei modelli animali e quantificazione della capsula

Con lo scopo di identificare il ruolo di ampR nella virulenza degli isolati CRKP non ipermucoviscosi, abbiamo selezionato tre isolati (AH3176-1, AH1689-2 e AH1689-3), e testato la virulenza in un modello murino. AH3176-1 e AH1689-2 erano due isolati ampR+, mentre AH1689-3 era l’isolato ampR- (Figura 1). Inoltre, abbiamo anche selezionato due ceppi ipermucoviscosi GM2 e GM6 dalla nostra collezione per testare la virulenza. Sia GM2 che GM6 appartengono a KL1, tra i quali GM6 porta il gene ampR mentre GM2 no. Tuttavia, la sequenza ampR del ceppo KL47 non ipermucoviscoso era diversa da quella del ceppo KL1 ipermucoviscoso, quindi in questo studio sono stati chiamati rispettivamente ampRKL1 e ampRKL47.

Come mostrato nella Figura 4A, AH3176-1 e AH1689-3:ampRKL47 più arabinosio avevano una sopravvivenza dello 0% con un inoculo di 1 × 107 unità formanti colonie (CFU) a 4 d post-infezione, mentre il 20% di sopravvivenza con AH1689-2, 40% di sopravvivenza con AH1689-3:ampRKL47 senza arabinosio, 60% di sopravvivenza con AH1689-3:pBAD33 e ATCC70721, e 80% di sopravvivenza con AH1698-3 è stato osservato a 7 d post-infezione. Il tasso di sopravvivenza è stato significativamente diminuito dopo la complementazione con il gene ampRKL47 in AH1689-3 (n = 10; P = 0.033, log-rank Mantel-Cox test), suggerendo il ruolo importante di ampR nella virulenza. L’infezione dei topi con AH3176-1 ha portato a circa 10-100 volte più alto CFU nei polmoni rispetto ad altri isolati (Figura 4B). La patologia dei polmoni ha mostrato vari gradi di ispessimento della parete alveolare, infiltrazione di linfociti e sanguinamento intravascolare nel gruppo di infezione. Tra questi, i cambiamenti patologici polmonari causati da AH3176-1 erano i più gravi, presentando come esteso consolidamento polmonare ed emorragia intra-alveolare (Figura 4D-F).

Figura 4 Potenziale di virulenza degli isolati non ipermucoviscosi di Klebsiella pneumoniae in un modello di infezione polmonare del mouse. (A) L’effetto di 1 × 107 unità formanti colonie (CFU) di AH3176-1, AH1689-2, AH1689-3 e AH1689-3 ampRKL47 mutante complemento è stato valutato sulla sopravvivenza. (B) A 24 ore dopo l’infezione (hpi), i polmoni dei topi infetti sono stati raccolti, e il carico batterico è stato determinato da enumerazione CFU (n = 10; *P < 0,05, **P < 0,01, one-way ANOVA). I dati sono rappresentativi di 3 esperimenti indipendenti. (C) Produzione di acido urenico di diversi ceppi. È stato eseguito un t-test di Student a due facce non appaiate. Ogni punto di dati è stato ripetuto tre volte (n = 3). I dati sono presentati come media ± s.e.m. *P < 0.05, ns = nessuna significatività. I polmoni dei topi senza infezione (D) o infettati con ATCC700721 (E) e AH3176-1 (F) sono stati raccolti e colorati con ematossilina ed eosina. Tutte le immagini sono a ×40 di ingrandimento. Barre della scala: 250 μM.

Come mostrato nella Figura 5A, il tasso di sopravvivenza dei topi infettati con GM6 era significativamente inferiore a quello di GM2 e ATCC700721. Una diminuzione del tasso di sopravvivenza è stata osservata dopo la complementazione di ampRKL1 in GM2. Inoltre, la carica batterica nei polmoni dei topi infettati con GM6 era significativamente superiore a quella di GM2 e ATCC700721 (Figura 5B); colorazione HE ha mostrato che l’infezione GM6 causato ampio consolidamento dei polmoni e intra emorragia alveolare (Figura 5E-G). Tuttavia, il tasso di sopravvivenza non è stato influenzato se ampRKL47 è stato introdotto in GM2 (Figura 5C).

Figura 5 Potenziale di virulenza degli isolati ipermucoviscosi di Klebsiella pneumoniae in un modello di infezione polmonare del topo. (A) L’effetto di 1 × 106 unità formanti colonie (CFU) di GM2, GM6 e GM2 ampRKL1 mutante complemento è stato valutato (n = 10; *P < 0.05, **P < 0.01, log-rank Mantel-Cox test),). (B) A 24 ore dopo l’infezione (hpi), i polmoni dei topi infetti sono stati raccolti, e il carico batterico è stato determinato da enumerazione CFU (n = 10; **P < 0.01, one-way ANOVA). I dati sono rappresentativi di 3 esperimenti indipendenti. (C) L’effetto di 1 × 106 CFU di GM2 e GM2 ampRKL47 mutante di complemento sulla sopravvivenza è stato valutato. (D) Produzione di acido urenico di diversi ceppi. È stato eseguito un t-test di Student a due facce non appaiate. Ogni punto di dati è stato ripetuto tre volte (n = 3). I dati sono presentati come media ± s.e.m. *P < 0.05, ns = nessun significato. I polmoni dei topi senza infezione (E) o infettati con GM2 (F) e GM6 (G) sono stati raccolti e colorati con ematossilina ed eosina. Tutte le immagini sono a ×40 ingrandimento. Barre della scala: 250 μM.

Siccome la capsula è il principale fattore di virulenza di K. pneumonia e WcaJ che è stato evidenziato secondo il risultato dell’analisi del proteoma regola la fase iniziale della sintesi della capsula, abbiamo studiato le quantità di produzione del polisaccaride capsulare. Il risultato ha mostrato che i ceppi ampR-complementari AH1689-3:ampRKL47 e GM2:ampRKL1 più arabinosio hanno prodotto significativamente più polisaccaride capsulare (acido uronico) di AH1689-3 e GM2, rispettivamente (Figura 4C, Figura 5D).

Discussione

MLST è stata la tecnica più comunemente usata per definire le popolazioni di K. pneumoniae. Con la WGS, veloce ed economica, è possibile confrontare interi genomi per la tipizzazione degli isolati piuttosto che solo alcuni loci, come nella MLST tradizionale. La genotipizzazione con cgMLST utilizza migliaia di alleli in tutto il genoma, con un conseguente livello superiore di discriminazione dell’isolato. In questo studio, abbiamo usato cgMLST per classificare 135 isolati CRKP clinici e abbiamo trovato differenze tra i tipi di CT in base alle informazioni cliniche. A causa del numero limitato di casi, non siamo stati in grado di ottenere un’associazione tra i tipi di CT e l’esito clinico. Tuttavia, le differenze nei tassi di mortalità ci hanno permesso di indagare ulteriormente gli isolati appartenenti al CT3176. L’analisi GWAS ha mostrato che il gene ampR era significativamente associato agli isolati CT3176.

Studi precedenti hanno dimostrato che il regolatore della β-lattamasi AmpC AmpR, un membro della famiglia dei fattori di trascrizione LysR, controlla anche molteplici meccanismi di virulenza in Pseudomonas aeruginosa.29,30 Ad oggi, solo un articolo ha riportato il ruolo di AmpR nella regolazione della virulenza di K. pneumoniae. Un isolato clonale di K. pneumoniae ha mostrato che pochi geni di virulenza conosciuti erano responsabili di infezioni gravi. L’AmpR in questi isolati era coinvolto nell’upregulation della sintesi delle capsule, nella formazione modulata del biofilm e nell’espressione del gene fimbrial di tipo 3, così come nella colonizzazione del tratto gastrointestinale murino.31 Tuttavia, il livello di virulenza di questi isolati rimane poco chiaro a causa della mancanza di dati su modelli di infezione letale. In questo studio, abbiamo usato un modello di polmonite per confermare la maggiore virulenza di questi isolati portatori di ampR. Questo spiegherebbe perché i pazienti infettati da questi isolati avevano un alto tasso di mortalità.

In precedenza, era comune per ST11-type K. pneumoniae essere resistente ai carbapenemi ma non ipervirulento. Tuttavia, nel 2017, è stato segnalato un focolaio di infezioni ospedaliere causate da isolati di K. pneumoniae ipervirulenti resistenti ai carbapenemi ST11. Il fenotipo di ipervirulenza di questi isolati era dovuto all’acquisizione di un plasmide di virulenza pLVPK-like di circa 170 kbp da parte di isolati CRKP classici appartenenti a ST11 e sierotipo K47.15 In contrasto con la relazione di cui sopra, nessun plasmide di virulenza è stato trovato in isolati ST11 CRKP con virulenza aumentata in questo studio, suggerendo che il miglioramento della virulenza non era dovuto al meccanismo classico.32 A differenza del plasmide di virulenza, che contiene più fattori di virulenza, AmpR può aumentare la virulenza indipendentemente. Questo è stato confermato dai test di virulenza del ceppo di complemento ampR.

WcaJ è l’enzima che inizia la sintesi dell’acido colanico e carica il primo zucchero (glucosio-1-P) sul vettore lipidico undecaprenil fosfato. Il ruolo potenziale di WcaJ nella virulenza di K. pneumoniae è stato definito recentemente.33 I risultati dell’analisi del proteoma suggeriscono che AmpR aumenta la virulenza di K. pneumoniae regolando la fase iniziale della sintesi delle capsule. Come regolatore, AmpR ha bisogno di legarsi al promotore del gene per esercitare il suo ruolo regolatore. Ad oggi, sono stati identificati molti tipi di capsula in K. pneumoniae,34 e l’assenza di siti di legame dell’AmpR in alcuni tipi di capsula può spiegare perché la virulenza degli isolati KL1 non può essere migliorata dall’AmpR trovato negli isolati KL47.

Nuove prove hanno suggerito che l’ipermucoviscosità e l’ipervirulenza sono fenotipi diversi che non dovrebbero essere usati come sinonimi. Inoltre, è importante stabilire che un test di stringa negativo non è sufficiente per determinare se un isolato è ipervirulento.35 Una scoperta chiave del nostro lavoro è stata che abbiamo identificato il sottoclone ST11 CRKP non ipermucoviscoso con virulenza aumentata.

La limitazione principale di questo studio è che c’è solo un piccolo numero di casi; quindi, non siamo in grado di studiare la relazione tra gli esiti clinici e l’infezione CRKP ipervirulenta non ipermucoviscosa. Siamo stati anche in grado di costruire il ceppo ampR knockout, e questo può essere spiegato dall’analisi genomica ha mostrato che ampR era putativamente situato sul plasmide (Figura S3). Poiché i ceppi con il fenotipo non ipermucoviscoso sono difficilmente distinguibili nella clinica, la sorveglianza continua e l’indagine di questi nuovi ceppi sono urgentemente necessari.