Analisi genomica integrativa della firma APOBEC-mutazionale, espressione e delezione germinale dei geni APOBEC3 e immunogenicità in più tipi di cancro

Distinti modelli dei geni APOBEC3, associati alla firma APOBEC-mutazionale in più tipi di cancro

Seguendo la precedente analisi della firma APOBEC-mutazionale, abbiamo misurato le mutazioni utilizzando il numero di deaminasi C che erano all’interno del motivo trinucleotidico TCW cambiare a T o G mutazioni per ogni campione attraverso 10 tipi di cancro (vedi metodi). Abbiamo condotto analisi univariate per valutare le associazioni della firma APOBEC-mutazionale con i livelli di espressione genica complessiva di APOBEC3A e APOBEC3B. Abbiamo osservato che il livello di espressione di APOBEC3A era positivamente associato alla firma APOBEC-mutazionale in un totale di sei tipi di cancro – vescica, seno, cervice, adenocarcinoma polmonare, testa e collo e tiroide. Nessuna associazione significativa è stata osservata nei restanti tipi di cancro, anche se sono state osservate le stesse direzioni di associazione (file aggiuntivo 1: Tabella S1). È interessante notare che abbiamo osservato che il livello di espressione di APOBEC3B è stato associato positivamente con la firma APOBEC-mutazionale in tutti i tipi di cancro, ad eccezione del carcinoma squamoso del polmone (file aggiuntivo 1: Tabella S1). Rispetto alle associazioni da APOBEC3A, APOBEC3B è stato specificamente associato con APOBEC-mutazionale firma nello stomaco, pancreas e tumori del rene, con un P = 5,2 × 10- 11, P = 2,0 × 10- 3, e P = 1,1 × 10- 4, rispettivamente (file aggiuntivo 1: Tabella S1). Questi risultati erano in linea con gli studi precedenti. Inoltre, abbiamo anche valutato le associazioni della firma APOBEC-mutazionale con l’espressione genica di altri geni APOBEC3: APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3F, APOBEC3G e APOBEC3H. I nostri risultati hanno mostrato che le espressioni di questi geni sono state associate alla firma APOBEC-mutazionale varia in diversi tipi di cancro (file aggiuntivo 1: tabella S2). Per esempio, l’espressione APOBEC3C è stata associata a un aumento della firma APOBEC-mutazionale nei tumori della cervice e della testa e del collo, mentre la sua espressione è stata associata a una diminuzione della firma APOBEC-mutazionale nel cancro allo stomaco. Il nostro risultato ha anche mostrato che l’espressione APOBEC3D, APOBEC3F, e APOBEC3G erano associati con un aumento della firma APOBEC-mutazionale, mentre il risultato dell’associazione di APOBEC3G era in linea con la precedente scoperta. È interessante notare che abbiamo osservato che l’espressione APOBEC3H è stata associata ad un aumento della firma APOBEC-mutazionale nel cancro cervicale, ma non osservata nel cancro al seno.

Modelli distinti delle isoforme di APOBEC3A e APOBEC3B, associati alla firma APOBEC-mutazionale in più tipi di cancro

Abbiamo ulteriormente valutato le associazioni tra la firma APOBEC-mutazionale e i livelli di espressione di ciascuna delle isoforme trascritte da APOBEC3A e APOBEC3B. Un totale di sei isoforme sono stati analizzati, tra cui uc003awn e uc011aob trascritto da APOBEC3A, uc003awo, uc003awp e uc003awq trascritto da APOBEC3B, e un’altra isoforma, uc011aoc, derivato da un evento di fusione coinvolti in una regione che copre l’ultimo introne di APOBEC3A all’ultimo esone di APOBEC3B (Fig. 1a, b). Abbiamo confermato che le isoforme uc003awn e uc003awo sono state trascritte principalmente da APOBEC3A e APOBEC3B, rispettivamente (file aggiuntivo 1: Figura S1). Come previsto, la direzione di associazione di entrambi i livelli di espressione uc003awn e uc003awo e firma APOBEC-mutazionale erano coerenti con le osservazioni dei livelli di espressione genica complessiva in tutti i tipi di cancro (Fig. 1c, d; Additional file 1: Tabella S3). Sorprendentemente, il livello di espressione di uc011aoc (APOBEC3A/B) è stato positivamente associato con la firma APOBEC-mutazionale solo nel cancro al seno (P = 5.0 × 10- 10) (Fig. 1e; Additional file 1: Tabella S3). Tuttavia, non sono state osservate associazioni per le isoforme rimanenti in qualsiasi tipo di cancro, ad eccezione di una debole associazione osservata per uc011aob (APOBEC3A) con il cancro alla testa e al collo (P = 0,02; Additional file 1: Tabella S3).

Usando analisi di regressione multipla che ha incluso tutte le isoforme di entrambi APOBEC3A e APOBEC3B, abbiamo trovato che i livelli di espressione di uc003awn (APOBEC3A) e uc003awo (APOBEC3B) erano indipendentemente e comunemente associati con la firma APOBEC-mutazionale valutata in più tipi di cancro: vescica (un’associazione marginale per uc003awn), seno, cervice, adenocarcinoma polmonare e testa e collo (tabella 1). Allo stesso modo, un’associazione aggiuntiva per uc011awn (APOBEC3A) è stata osservata nella tiroide, mentre le associazioni per uc003awo (APOBEC3B) sono state osservate nei tumori di stomaco, pancreas e rene. Coerentemente con l’analisi univariata, un’associazione sorprendente per uc011aoc (APOBEC3A/B) con firma APOBEC-mutazionale è stato osservato nel cancro al seno (P = 5.3 × 10- 11), e un’associazione aggiuntiva è stata osservata anche in adenocarcinoma polmonare (P = 0.01) (Tabella 1). Questi risultati suggeriscono che uc011aoc svolge un ruolo tessuto-specifico nel influenzare APOBEC-mutazionale firma principalmente nel cancro al seno, mentre uc003awn e uc003awo svolgono un ruolo ubiquitario ma distinto in tutto lo spettro del cancro umano. In particolare, la nostra analisi aggiuntiva ha mostrato la correlazione di espressione positiva tra l’isoforma uc011aoc e APOBEC3A attraverso uno dei principali tipi di cancro, soprattutto nel cancro al seno (Additional file 1: tabella S4).

Inoltre, abbiamo eseguito un’analisi di associazione stratificata per sottotipi clinici nel cancro al seno. Abbiamo osservato che le associazioni delle isoforme di uc003awn (APOBEC3A) e uc011aoc (APOBEC3A/B) con la firma APOBEC-mutazionale variavano nei diversi sottotipi clinici, con l’associazione più significativa osservata nel sottotipo LumA (file aggiuntivo 1: tabella S5).

La delezione germinale di APOBEC3A/B influisce sui livelli di espressione delle isoforme dei geni APOBEC3A e APOBEC3B

Per studiare come la delezione germinale di APOBEC3A/B influenzi l’espressione delle isoforme di APOBEC3A e APOBEC3B, abbiamo innanzitutto identificato 30 campioni per i quali si prevedeva una delezione omozigote, 239 campioni per i quali si prevedeva una delezione eterozigote e 2287 campioni per i quali si prevedeva l’assenza di delezione (Additional file 1: Tabella S6, vedi Metodi). Successivamente, abbiamo valutato le associazioni tra la delezione APOBEC3A/B germinale e i livelli di espressione di ogni isoforma utilizzando l’analisi univariata (vedi Metodi). Come previsto, abbiamo osservato che la delezione germinale APOBEC3A/B è stata significativamente associata con una diminuzione dei livelli di espressione dell’isoforma uc003awo (APOBEC3B) in tutti i tipi di cancro a P < 0,05, tranne che per il cancro del pancreas con un P = 0,14. Associazioni significative con livelli di espressione ridotti di uc003awn (APOBEC3A) sono state osservate anche in tre tipi di cancro – vescica, seno e tiroide (Fig. 2; Tabella 2). Al contrario, i nostri risultati hanno mostrato che la delezione germinale di APOBEC3A/B era significativamente associata ad un aumento del livello di espressione di uc011aoc (APOBEC3A/B) in tutti i tipi di cancro, tranne che nei tumori dello stomaco, del pancreas e del rene. Per questi, non c’era significatività statistica ma aveva le stesse direzioni di associazione (Fig. 2; Tabella 2). In particolare, il cancro della testa e del collo ha mostrato l’associazione più significativa con P = 3,8 × 10- 65, e i tumori del seno e della vescica hanno mostrato l’associazione significativa con P = 3,0 × 10- 8, e P = 2,9 × 10- 7, rispettivamente. Inoltre, abbiamo eseguito la stessa analisi, stratificata per popolazione, e una tendenza simile è stata osservata in questi tipi di cancro (dati non mostrati). I nostri risultati suggeriscono che, in quasi tutti i tipi di cancro indagati, la delezione germinale APOBEC3A/B è stata significativamente associata con una diminuzione dei livelli di espressione di uc003awn e uc003awo, ma c’è stato un aumento del livello di espressione di uc011aoc.

La delezione germinale di APOBEC3A/B influenza l’APOBEC-firma mutazionale, carichi di neoantigeni e composizioni relative di cellule immunitarie, in particolare nel cancro al seno

Uno studio precedente ha dimostrato che la delezione germinale di APOBEC3A/B è associata ad un aumento della firma mutazionale APOBEC nel cancro al seno, mentre un modello simile, ma senza significatività statistica, è stato osservato in molti altri tipi di cancro, come la vescica. Utilizzando l’analisi univariata per valutare gli effetti complessivi della delezione germinale APOBEC3A/B sulla firma APOBEC-mutazionale, abbiamo trovato che la delezione era significativamente associata ad un aumento della firma APOBEC-mutazionale solo nel cancro al seno (P = 5.6 × 10- 3; Tabella 3; Fig. 3a). Tuttavia, una tendenza opposta è stata osservata nella maggior parte degli altri tipi di cancro, anche se la maggior parte delle associazioni non erano statisticamente significative (Tabella 3). In particolare, nel cancro della vescica, abbiamo osservato che la delezione germinale APOBEC3A/B è stata significativamente associata con una diminuzione della firma APOBEC-mutazionale (P = 1.7 × 10- 3; Tabella 3). Per chiarire ulteriormente se l’influenza della delezione APOBEC3A/B germinale sulla firma APOBEC-mutazionale è dovuta al suo effetto sull’espressione genica, abbiamo ulteriormente valutato le associazioni tra la firma APOBEC-mutazionale e la delezione con una regolazione per l’espressione delle isoforme (vedi metodi). Allo stesso modo, i nostri risultati hanno rivelato che la delezione germinale APOBEC3A/B era significativamente associata con un aumento della firma APOBEC-mutazionale solo nel cancro al seno (P = 2,8 × 10- 6; Tabella 3; Fig. 3b). Un effetto più elevato (Beta = – 0,620) della delezione con un’espressione isoforma aggiustata è stato osservato rispetto all’osservazione iniziale dell’effetto generale (Beta = – 0,281; Tabella 3). Per valutare se la delezione germinale può contribuire alla proporzione di firma APOBEC-mutazionale, abbiamo anche analizzato una proporzione di firma APOBEC-mutazionale rispetto alle mutazioni totali per ogni campione (vedi Metodi). Coerentemente con l’osservazione iniziale della firma APOBEC-mutazionale, abbiamo osservato che la delezione germinale era significativamente associata con una maggiore proporzione di firma APOBEC-mutazionale solo nel cancro al seno (Beta = – 0.287, P = 4.8 × 10- 3 e Beta = – 0.5, P = 1.4 × 10- 4 per l’effetto complessivo e gli effetti con espressione genica regolata; vedi Tabella 3). Questi risultati indicano che la delezione APOBEC3A/B germinale, che porta ad un aumento della firma APOBEC-mutazionale, è probabilmente dovuto è la funzione distinta di uc011aoc trascritto dalla delezione, oltre al suo effetto sulle espressioni aumentate di uc011aoc. È stato segnalato che l’aplotipo I di APOBEC3H (APOBEC3H-I) può contribuire principalmente alla firma APOBEC-mutazionale per i campioni che portano le delezioni germinali APOBEC3A/B nel cancro al seno. Abbiamo ulteriormente analizzato l’aplotipo APOBEC3H-I per un totale di 76 campioni che si prevedeva portassero delezioni APOBEC3A/B germinali (vedi metodi). I nostri risultati hanno mostrato che la firma APOBEC-mutazionale non era significativamente correlata con l’aplotipo APOBEC3H-I, indipendentemente dai campioni previsti per portare delezioni APOBEC3A/B germinali omozigoti o eterozigoti (Dati non mostrati). Tuttavia, i nostri risultati sono in linea con la precedente scoperta che la proteina APOBEC3A/B, generata dalla delezione, ha un livello di espressione superiore alla proteina APOBEC3A basata sull’indagine da saggi funzionali in vitro.

Per esplorare ulteriormente la funzione distinta e potenziali percorsi che l’espressione dell’isoforma uc011aoc (trascritta dalla delezione APOBEC3A/B) può essere coinvolta, abbiamo analizzato i geni che sono stati co-espressi con l’isoforma uc011aoc nei campioni previsti per portare delezioni APOBEC3A/B germinali (vedi metodi). Un’analisi di arricchimento in percorsi di segnalazione canonici utilizzando IPA ha rivelato che questi geni co-espressi erano significativamente arricchiti in percorsi canonici distinti varia attraverso i tipi di cancro. In particolare, abbiamo osservato che i percorsi più arricchiti erano HIPPO segnalazione per la vescica, PTEN segnalazione per il seno, iNOS e Interferon segnalazione per l’adenocarcinoma polmonare, Acyl-CoA idrolisi per lo stomaco, e DNA Double-Strand Break Repair e Fatty Acid α-ossidazione per il pancreas, EIF2 segnalazione per la tiroide e GPCR-Mediated integrazione per rene (P < 0,01 per tutti; Additional file 1: Tabella S7). Inoltre, un arricchimento funzionale in morte cellulare e sopravvivenza è stato comunemente osservato in più tipi di cancro tra cui vescica, seno, cervice, adenocarcinoma polmonare e carcinoma polmonare (P < 0,05 per tutti).

Abbiamo ulteriormente valutato l’associazione tra delezione APOBEC3A/B germline e carichi di neoantigene. Coerentemente con l’osservazione della firma APOBEC-mutazionale, i nostri risultati hanno mostrato che la delezione APOBEC3A/B germline è stata significativamente associata con carichi neoantigene aumentati solo nel cancro al seno (P = 6,5 × 10- 3; Fig. 3c), mentre una tendenza opposta è stata osservata in molti altri tipi di cancro (file aggiuntivo 1: tabella S8). Allo stesso modo, abbiamo trovato che la delezione germinale era marginalmente associata con l’abbondanza relativa della composizione delle cellule T (CD8+) in TILs, ma solo nel cancro al seno (P = 0,08; Fig. 3d). L’associazione significativa è stata rilevata quando abbiamo pettinato i campioni con delezioni sia omozigote che eterozigote e li abbiamo confrontati con i campioni con delezioni non portatori (un test Wilcoxon signed-rank, P < 0,05). Tuttavia, nessuna associazione è stata osservata per altre cellule immunitarie. I nostri risultati hanno dimostrato che la delezione germinale APOBEC3A/B gioca un ruolo tessuto-specifico nell’influenzare la firma mutazionale APOBEC e l’immunogenicità nel cancro al seno, probabilmente rafforzando i risultati in precedenti studi di associazione su tutto il genoma dei meccanismi potenziali per la loro associazione con un aumentato rischio di cancro al seno.

La firma mutazionale APOBEC contribuisce significativamente ai neoantigeni

Per indagare in che misura la firma mutazionale APOBEC contribuisce ai neoantigeni, abbiamo analizzato i carichi di neoantigeni previsti per ogni campione raccolto da uno studio precedente (vedi metodi). Usando l’analisi univariata, abbiamo valutato le associazioni tra la firma APOBEC-mutazionale e i carichi di neoantigeni per ogni tipo di cancro. Come previsto, APOBEC-mutazionale firma era positivamente associato con carichi neoantigene in tutti i tipi di cancro (P < 1.0 × 10- 4 per tutti i confronti), mentre le associazioni più significative sono state osservate in seno e vescica tipi con P = 5.1 × 10- 125, e P = 1.5 × 10- 90, rispettivamente (Additional file 1: Tabella S9). Allo stesso modo, una tendenza generale di associazione positiva è stata osservata tra i carichi di neoantigene previsti e la proporzione di firma APOBEC-mutazionale, con l’eccezione del cancro allo stomaco (Fig. 4; Additional file 1: Tabella S10). In particolare, le associazioni significative sono state osservate in più tipi di cancro, tra cui vescica, seno, cervice, adenocarcinoma polmonare, testa e collo e tiroide. In particolare, il cancro al seno e alla vescica ha mostrato le migliori associazioni con P = 8,9 × 10- 29, e P = 2,8 × 10- 27, rispettivamente (Additional file 1: Tabella S10). I nostri risultati suggeriscono che APOBEC-mutazionale firma giocare un ruolo significativo nel contribuire alla biogenesi di neoantigeni nel cancro umano.

Associazioni tra abbondanza relativa di composizioni di cellule immunitarie nelle TIL con carico di neoantigene e firma mutazionale APOBEC

Per studiare la relazione tra carico di neoantigene e TIL, abbiamo usato i dati di espressione genica nei tessuti tumorali per misurare l’abbondanza delle composizioni cellulari relative di ogni tipo di cellula immunitaria, comprese le cellule B naïve, le cellule B di memoria, le cellule T CD8 e le cellule T CD4 di memoria-attivate nelle TIL (vedi Metodi). Usando l’analisi univariata, abbiamo valutato l’associazione tra il carico di neoantigene e l’abbondanza relativa delle composizioni di cellule immunitarie per ogni tipo di cancro. Abbiamo osservato che c’era una tendenza di associazione positiva tra i carichi di neoantigene e sia le cellule T CD8+ che i tipi CD4+ attivati dalla memoria in tutti i tipi di cancro eccetto tiroide e rene (test Binomiale P = 0,11 e P = 0,02 per le cellule T CD8+ e CD4+ attivate dalla memoria, rispettivamente). Un modello opposto è stato osservato per entrambi i tipi di cellule B naïve e di memoria in tutti i tipi di cancro, con l’eccezione dell’adenocarcinoma polmonare (test binomiale P = 0,02 e P = 2,2 × 10- 16 per i tipi di cellule B naïve e di memoria, rispettivamente). In particolare, i nostri risultati hanno mostrato che i carichi di neoantigene avevano un’associazione con le abbondanze relative sia delle cellule T CD8+ e CD4+ attivate dalla memoria, sia dei tipi di cellule B naïve e di memoria nel cancro della vescica. C’era un’associazione per entrambi i tipi di cellule B ingenue e di memoria nel cancro al seno, e per i tipi di cellule T CD4 attivate dalla memoria nell’adenocarcinoma del polmone, nella testa e nel collo e nei tumori del pancreas (file aggiuntivo 1: tabella S11). Poiché la firma APOBEC-mutazionale ha contribuito significativamente ai neoantigeni, abbiamo inoltre valutato l’associazione tra le abbondanze relative delle composizioni delle cellule immunitarie in TILs e la firma APOBEC-mutazionale. Coerentemente con l’osservazione dell’analisi di associazione del carico di naeoantigeni, un modello simile è stato trovato anche per la firma APOBEC-mutazionale (file aggiuntivo 1: tabella S12). I nostri risultati suggeriscono che la firma APOBEC-mutazionale ha un’influenza sulle capacità immunogeniche del cancro, come l’attrazione di alcune cellule immunitarie in TILs, possibilmente mediata dall’aumentato carico di neoantigene.