Anticorpi antisperma: Anticorpi anti-sperma e infertilità: una questione irrisolvibile?

Ancora una volta si discute la rilevazione e il significato clinico degli anticorpi anti-sperma (ASA) (Helmerhorst et al., 1999). Sebbene si concluda cautamente che “c’è ragione di accettare l’immunità antisperma mediata da anticorpi come causa di subfertilità”, gli autori elencano tre ragioni per cui i clinici non sono inclini a testare l’ASA nelle coppie subfertili: (i) mancanza di un test standardizzato e universalmente accettato per l’ASA; (ii) mancanza di consenso sulle conseguenze cliniche dell’ASA; e (iii) assenza di prove per una spiegazione meccanicistica su come l’ASA comprometta il concepimento. Queste tre affermazioni meritano ciascuna un commento.

La discussione di Helmerhorst et al. (1999) si basa strettamente su concetti immunologici moderni, che portano a raccomandare l’immunoblotting e la cromatografia di affinità come promettenti in questo campo. Per coloro che sono stati nel campo per molti anni, queste raccomandazioni possono provocare una sensazione di deja vu. Questa era la strategia comune ~ 20 anni fa, e molti studi sono stati fatti da allora con saggi immunosorbenti legati agli enzimi (ELISA), usando spermatozoi o frazioni di antigene, e con immunoblotting (Lehmann et al., 1985; Mettler et al., 1985). Tuttavia, i risultati sono stati generalmente deludenti; la chiarezza che si sperava non è stata raggiunta. Non ci sono buone spiegazioni per la mancanza di successo, ma un aspetto del problema può essere che il pensiero immunologico convenzionale non è sufficiente per ottenere progressi nell’immunologia riproduttiva. Anche la fisiologia della riproduzione deve essere presa in considerazione. Uno sguardo ai possibili effetti in-vivo degli ASA può illustrare questo.

Spiegazioni meccanicistiche per la compromissione del concepimento da parte degli ASA?

L’affermazione di Helmerhorst et al. di “un’assenza di prove per una spiegazione meccanicistica su come gli ASA compromettono il concepimento” è piuttosto sorprendente, soprattutto in un documento olandese, anche un documento di Groningen. Fu a Groningen che l’eccezionale gruppo, guidato da Jan Kremer, dimostrò che la migrazione degli spermatozoi con ASA della classe delle immunoglobuline (Ig) A sulla loro superficie attraverso il muco cervicale era fortemente compromessa, apparentemente perché la parte Fc della molecola IgA (ma non della molecola IgG) si lega effettivamente alle micelle del muco cervicale (Jager et al., 1980). Nel test di contatto sperma-mucchio cervicale, la percentuale di spermatozoi coperti da anticorpi IgA era proporzionale alla percentuale di spermatozoi che rivelavano il cosiddetto fenomeno dello ‘scuotimento’, cioè pesanti movimenti della coda senza progressione in avanti nel muco cervicale. Un’ulteriore prova dell’importanza delle IgA è stata trovata quando il trattamento di spermatozoi ricoperti di IgA con una proteasi IgA1 ha dimostrato di migliorare la migrazione degli spermatozoi attraverso il muco cervicale (Bronson et al., 1987).

Questo significa che gli anticorpi IgA contro qualsiasi antigene espresso sulla membrana spermatica compromettono la penetrazione e che, in questa situazione, la classe immunoglobulinica dell’ASA diventa più importante della specificità dell’antigene. Questo è in contrasto con le reazioni immunologiche convenzionali e può essere la ragione per cui il fenomeno dell’agitazione è spesso trascurato nelle discussioni immunologiche. Tuttavia, è ovviamente un meccanismo molto efficace; in esperimenti sulla migrazione di spermatozoi ricoperti di IgA nel muco cervicale in tubi capillari, gli spermatozoi di pazienti con forti risposte immunitarie spesso raggiungevano solo pochi mm nel muco. Il legame del pezzo Fc delle IgA al muco cervicale dovrebbe essere visto in una prospettiva evolutiva. Con il muco cervicale come unica barriera tra l’ambiente e il tratto genitale femminile e la cavità peritoneale, ci devono essere meccanismi di difesa nel muco per impedire ai microrganismi di entrare nel tratto genitale. Gli anticorpi IgA contro i microrganismi svolgono questa funzione intrappolando i microrganismi. Nei rari casi in cui una donna ha prodotto anticorpi IgA contro gli spermatozoi o, più comunemente, quando gli spermatozoi che entrano nel muco sono già ricoperti di IgA, il risultato sarà lo stesso: intrappolamento degli spermatozoi o compromissione della migrazione.

Un meccanismo immunologico più convenzionale con cui l’ASA potrebbe ridurre la fertilità sarebbe attraverso il legame al recettore con cui gli spermatozoi si attaccano all’ovulo, bloccando così l’interazione sperma-ovulo. In questa situazione, la specificità dell’antigene dell’ASA sarà cruciale, e poiché c’è più di un autoantigene nella membrana spermatica, non tutti gli ASA potrebbero avere questo effetto. Negli ultimi due decenni, questo fenomeno è stato ampiamente studiato in relazione alla fecondazione in vitro (FIV) utilizzando spermatozoi di uomini con ASA. In quasi tutti gli studi è stata osservata una riduzione significativa della percentuale di ovuli fecondati. Uno dei primi studi indicava anche che l’effetto bloccante era causato principalmente da anticorpi IgA (Clarke et al., 1985), ma questo non è stato notato in studi successivi, e gli esperimenti di assorbimento hanno dimostrato che un effetto inibitorio può essere causato anche da anticorpi IgG (Bronson et al., 1982). Uno studio recente sul legame degli spermatozoi alla zona pellucida (Francavilla et al., 1997) è particolarmente illustrativo. In ogni esperimento, hanno aggiunto un numero uguale di spermatozoi da una persona fertile e da un paziente con forte reattività nel test immunobead, in modo che i due tipi di spermatozoi, etichettati con fluorocromi diversi, fossero in competizione per il legame alla zona pellucida. Rispetto agli spermatozoi degli uomini fertili, gli spermatozoi dei pazienti con campioni di sperma normale (a parte la presenza di ASA) sono stati inibiti nel ~50% dei casi, potenziati in alcuni casi e non influenzati nei casi rimanenti, in accordo con il concetto che la specificità degli anticorpi deve giocare un ruolo. Tuttavia, nonostante le forti risposte immunitarie dei pazienti con alti titoli di ASA circolanti e, nella maggior parte dei casi con entrambe le IgG e IgA, su quasi tutti gli spermatozoi, l’inibizione non è mai stata completa, ma alcuni degli spermatozoi coperti da anticorpi erano legati alla zona pellucida. Questo è in accordo con l’esperienza di molti altri studi di FIV che, anche se la percentuale di ovuli fecondati può essere ridotta dalla presenza di ASA, alcuni ovuli di solito sono stati fecondati.

La conclusione di questa discussione sui possibili effetti dell’ASA sulla riduzione della fertilità è che l’alterazione della migrazione degli spermatozoi attraverso il muco cervicale da parte degli anticorpi IgA è un meccanismo molto efficace, mentre il blocco dell’interazione sperma-ovulo (causato sia dagli ASA IgG che IgA) sembra essere meno efficace, probabilmente impedendo raramente ma forse ritardando il concepimento. Le esperienze cliniche supportano queste conclusioni. Nelle cliniche di infertilità, gli uomini con ASA raramente hanno una risposta isolata di IgG ma di solito presentano una miscela di anticorpi IgG e IgA. D’altra parte, in studi sulla fertilità di uomini vasectomizzati e successivamente vasovasostomizzati, le risposte immunitarie limitate alla classe IgG non erano rare ma questi uomini sembravano avere una fertilità normale mentre il tasso di fertilità era inversamente correlato alla risposta IgA (Meinertz et al., 1990). Pertanto sembra che “l’assenza di prove per una spiegazione meccanicistica” non dovrebbe impedire al medico di testare i pazienti (almeno gli uomini) con problemi di fertilità per l’ASA.

Mancanza di un test standardizzato e universalmente accettato per l’ASA?

Anche se non si possono fare argomenti contro questa affermazione di Helmerhorst et al. (1999), la questione è se è un requisito giusto e necessario per un test da utilizzare? Se è così, l’ampio spettro di test di laboratorio potrebbe essere drasticamente ridotto. La domanda essenziale sembra essere se certi test per l’ASA producono risultati clinicamente rilevanti.

Per molti anni, i test di agglutinazione dello sperma (sia l’agglutinazione macroscopica con gelatina che l’agglutinazione microscopica con vassoio) erano i test comuni (Rose et al., 1976). Più recentemente, questi test sono stati screditati e spesso descritti come inaffidabili, in particolare in relazione alla descrizione di nuove tecniche. È vero, nessuna di esse è ideale, entrambe richiedono campioni di sperma fresco di qualità ottimale. Nel test di agglutinazione con gelatina, vengono utilizzati grandi volumi di sperma, e nel test di agglutinazione con vassoio, sono necessarie esperienza e cautela nella lettura dei risultati per distinguere i veri agglutinati dai raggruppamenti non specifici. Tuttavia, questi test hanno dato risultati clinicamente rilevanti nei maschi. Diversi studi hanno dimostrato che titoli elevati nel siero o anticorpi liberi nel plasma seminale si verificano molto raramente, tranne in pazienti con un problema di fertilità (in ~10% degli uomini di coppie con fertilità inspiegabile) (ad esempio Bronson et al., 1985), e tra gli uomini normospermici in uno studio di follow-up (Rümke et al., 1974), titoli sierici crescenti nella gelatina agglutinante erano correlati a una fertilità decrescente (ad esempio, solo il 12,5% di 64 uomini con titoli da 128-512 e nessuno di 11 con titoli ≥1024 aveva indotto il concepimento durante il periodo di osservazione di 2-16 anni). Poiché gli ASA rilevati nel siero sono principalmente della classe IgG, può sembrare strano che i titoli nel siero siano legati alla subfertilità se l’effetto anti-fertilità degli ASA è causato principalmente dagli anticorpi IgA nel seme. La spiegazione è che gli anticorpi IgA si presentano molto raramente senza gli anticorpi IgG, e alte concentrazioni di IgA si trovano principalmente in pazienti che hanno anche alte concentrazioni di IgG.

Un’osservazione altrettanto importante in questi studi era che basse concentrazioni di anticorpi (titoli di 4-16) erano ugualmente comuni tra i controlli fertili e i pazienti infertili, indicando che valori così bassi apparentemente non influenzano la fertilità in modo significativo.

Più recentemente, il test immunologico indiretto è diventato il più popolare (Bronson et al., 1982). Gli spermatozoi freschi, raccolti con la tecnica dello swim-up, vengono incubati con siero o plasma seminale, poi accuratamente lavati, e vengono aggiunti immunobeads ricoperti di anti-IgG o anti-IgA (o anti-IgM). Al microscopio si vedono le immunosfere aderire agli spermatozoi mobili se il campione contiene ASA della classe di immunoglobuline appropriata. L’uso di un’anti-immunoglobulina garantisce la specificità della reazione; è un test molto sensibile, determina la classe immunoglobulinica dell’ASA e richiede solo piccole quantità di spermatozoi, rendendolo così, apparentemente, il test ideale. Tuttavia, c’è un problema. Per mantenerlo praticabile, di solito si esegue con una sola diluizione di siero, di solito una diluizione bassa (più comunemente 1:4). In questi casi, il test immunologico indiretto funziona come un test di screening molto sensibile, in modo che anche i bassi livelli di anticorpi non significativi per la fertilità (che è probabilmente la maggior parte delle reazioni positive) possono indurre forti reattività, almeno per le IgG (per esempio vedi Bronson et al., 1985). Questo può spiegare perché diversi ricercatori hanno messo in dubbio il valore del test per l’ASA e l’importanza dell’ASA come causa di infertilità. Se il test venisse eseguito con diluizioni più elevate di siero (ad esempio 1:50 e 1:250), potrebbe fornire un migliore orientamento clinico.

Il modo più razionale per testare l’ASA nei maschi è ovviamente quello di determinare le immunoglubuline (IgG e IgA) sulla superficie degli spermatozoi dei pazienti per mezzo della reazione di agglutinazione mista diretta (MAR) o dei test immunobead. Entrambi i test sono veloci, facili e sensibili, ma richiedono spermatozoi mobili per garantire che gli eritrociti o le immunobead aderiscano alla membrana spermatica. Sono eccellenti test di screening; se la reazione è negativa o debolmente positiva (≤50% degli spermatozoi mobili che trasportano immunoglobuline) il paziente difficilmente può avere un problema di infertilità causato dall’ASA e non sono necessari ulteriori test immunologici. D’altra parte, se tutti, o la maggioranza, degli spermatozoi hanno immunoglobuline sulla loro membrana, le conseguenze per la fertilità sono più difficili da valutare, prima di tutto perché questi test sensibili non possono distinguere tra spermatozoi con solo minime quantità di immunoglobuline, e spermatozoi che sono completamente saturi di anticorpi su tutte le molecole antigeniche disponibili. Sia per la compromissione indotta dalle IgA della migrazione degli spermatozoi attraverso il muco cervicale, sia per un possibile blocco dell’interazione spermatozoo-ovulo, si deve supporre che il numero di molecole anticorpali abbia un ruolo. In questa situazione, la determinazione di ASA nel siero e nel plasma seminale può essere utile. Con titoli elevati nel siero o un eccesso di ASA libero nel plasma seminale, sembrerebbe probabile che anche la quantità di ASA sugli spermatozoi sia elevata.

Che queste considerazioni teoriche siano in accordo con la realtà clinica è stato illustrato nel modo più chiaro nel nostro studio di follow-up su uomini vasovasostomizzati, menzionato sopra (Meinertz et al., 1990).

Nel periodo di osservazione (22-111 mesi, mediana 44 mesi), 10 dei 15 uomini (66,7%) con una MAR diretta negativa (≤10% degli spermatozoi mobili con eritrociti aderenti) avevano indotto il concepimento, ma anche 42 dei 79 uomini (53,2%) con una MAR positiva (test esatto a due code di Fisher: P = 0,4995). Quindi, una semplice MAR positiva (>10% per IgG o IgA) non dava informazioni sullo stato di fertilità. La maggior parte degli uomini con ASA aveva sia IgG che IgA sui loro spermatozoi, ma alcuni avevano solo IgG. Le reazioni IgA pure non sono state registrate. Guardando gli uomini con risposte immunitarie limitate alla classe IgG, il tasso di concepimento per il gruppo totale era dell’85,7% (18/21), e per quelli con IgG su tutti gli spermatozoi era altrettanto alto (11/13 = 84,6%). Quindi, non si è potuto registrare alcun effetto anti-fertilità per le IgG; infatti il tasso di concepimento era notevolmente alto, addirittura superiore a quello dei pazienti senza ASA (anche se la differenza non era statisticamente significativa). D’altra parte, gli uomini con reattività sia IgG che IgA hanno rivelato una fertilità decrescente con l’aumentare della reattività IgA. Per il gruppo totale il tasso di concepimento è stato del 42,9% (24/56) e per quelli con IgA su tutti gli spermatozoi del 21,7% (cinque su 23). Rispetto ai gruppi con solo reattività IgG, le differenze erano altamente significative. Nel tentativo di identificare gli uomini con risposte immunitarie particolarmente forti, è emerso che nessuno dei 10 uomini con reattività IgA al 100% nel MAR e agglutinine spermatiche circolanti in titoli di 256 o superiori aveva indotto la gravidanza e solo uno dei 13 uomini con 100% IgA MAR e agglutinine spermatiche libere nel plasma seminale ci era riuscito.

Anche se attualmente non esiste un singolo test che possa valutare in modo chiaro lo stato di fertilità del singolo paziente per quanto riguarda la subfertilità o l’infertilità immunitaria, sembra giustificato concludere che, con la giusta combinazione di test (per esempio test MAR o immunobead combinati con agglutinine spermatiche nel siero o nel plasma seminale), si può arrivare piuttosto vicino a questo obiettivo. Una recente indagine sulla diagnosi e la gestione dell’ASA, eseguita da centri di medicina riproduttiva in tutto il Regno Unito (Krapez et al., 1998), ha dimostrato che la grande maggioranza dei centri segue effettivamente questa strategia. Così, 44 centri su 48 hanno testato l’ASA sugli spermatozoi tramite MAR diretta (28 laboratori) o test immunobead (19 laboratori). In alcuni casi, è stato testato anche il plasma seminale e 17 laboratori hanno esaminato il siero dei partner maschili con vari test, principalmente il test di agglutinazione del vassoio. Ciò significa che quasi tutti i centri hanno identificato in modo semplice gli uomini che potrebbero avere una causa immunologica per la loro subfertilità. Anche se questo è il meglio che si può fare attualmente, non è ottimale. Quello che serve è una tecnica che possa identificare in modo più preciso gli uomini che hanno un problema immunologico. Attualmente, la citometria a flusso sembra una tecnica promettente che potrebbe essere in grado di determinare l’esatta quantità di IgG e IgA sui singoli spermatozoi (Räsanen et al., 1992; Ke et al., 1995).

Mancanza di consenso sulle conseguenze cliniche dell’ASA?

A prima vista questa affermazione di Helmerhorst et al. può sembrare corretta, ma la questione è se le indagini con molte tecniche e criteri diversi possono essere confrontate? Anni fa si credeva generalmente che l’ASA potesse causare infertilità, ma oggi il quadro sembra molto meno chiaro. Ci possono essere diverse ragioni per questo cambiamento di opinione.

In primo luogo, abbiamo imparato che anche con i livelli più alti di ASA (soprattutto IgA) il concepimento difficilmente può essere escluso. Pertanto, la domanda è piuttosto fino a che punto l’ASA può causare subfertilità. Gli studi sull’infertilità maschile, discussi in questa revisione, si sono basati principalmente su varie tecniche convenzionali (alcuni potrebbero dire antiquate). Tuttavia, anche se consenso può essere una parola troppo forte da usare, i risultati di tali studi sono generalmente in buon accordo, indicando che bassi livelli di ASA fanno poco male, valori un po’ più alti (in particolare IgA) causano subfertilità aumentando fino a qualcosa vicino all’infertilità per livelli molto alti di ASA; una conclusione che ovviamente presenta un serio ostacolo per i tentativi di produrre un vaccino anti-fertilità, basato su antigeni dello sperma!

In secondo luogo, quando si introducono nuovi test per l’ASA, bisogna confrontarli con i test convenzionali, e se non determinano lo stesso tipo di ASA, bisogna tenerlo presente. Quando 15 anni fa fu eseguito uno studio multicentrico dell’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) sugli anticorpi agli antigeni riproduttivi, si scoprì che diverse tecniche, tra cui la maggior parte degli ELISA, le tecniche di immunoblotting, l’emoagglutinazione passiva e i test di citotossicità, non rilevavano gli ASA registrati nelle tecniche convenzionali. Inoltre, i risultati di solito avevano poca rilevanza clinica, non mostrando alcuna differenza significativa tra gruppi fertili e infertili (Hjort et al., 1985). Sfortunatamente, questo è spesso dimenticato nelle discussioni sull’ASA.

In terzo luogo, l’aspetto quantitativo e la classe immunoglubulinica degli anticorpi dovrebbero essere inclusi nel test. Così, tutti i pazienti con reattività nel test diretto MAR o immunobead non devono essere considerati come un unico gruppo, ma quelli con reattività debole (probabilmente fertili) devono essere distinti da quelli con anticorpi su quasi tutti gli spermatozoi (probabilmente subfertili), e allo stesso modo quelli con solo IgG (probabilmente fertili) non devono essere confusi con quelli con forte reattività sia per IgG che IgA (probabilmente subfertili o infertili).

La recente indagine dei centri di medicina riproduttiva nel Regno Unito (Krapez et al., 1998) ha indicato che, di solito, non viene fatta una distinzione tra IgG e IgA ASA. Questo è probabilmente dovuto al fatto che la maggior parte degli uomini infertili con ASA avranno una miscela delle due classi di immunoglobuline sui loro spermatozoi. Tuttavia, i tentativi di trattamento dei pazienti concordano bene con le conclusioni raggiunte dalle indagini di laboratorio e dagli “esperimenti clinici” (studi su uomini vasovasostomizzati). Così, l’inseminazione intrauterina viene utilizzata nella maggior parte dei centri per superare la compromissione indotta dalle IgA della penetrazione degli spermatozoi attraverso il muco cervicale. La FIV o l’iniezione intracitoplasmatica di sperma (ICSI) è stata utilizzata per i pazienti con una forte immunità agli spermatozoi (>50% di reattività nel test MAR o immunobead), ma generalmente con indicazioni liberali rispetto alle conclusioni raggiunte sopra. Questo ovviamente riflette il fatto che gli ASA spesso non sono l’unica causa di infertilità in questi pazienti, ma un basso numero di spermatozoi, scarsa motilità o problemi nel partner femminile possono anche giocare un ruolo. Pertanto, gli effetti anti-fertilità degli ASA sono difficili da analizzare in gruppi di pazienti infertili.

Gli uomini vasectomizzati e successivamente vasovasostomizzati sembrano offrire un gruppo molto migliore; infatti un gruppo molto simile agli animali da esperimento. Entrambi i partner hanno di solito dimostrato in precedenza la loro fertilità in modo da poter escludere fattori genetici di infertilità. Si può selezionare un gruppo di uomini che sono stati vasectomizzati per un periodo limitato e che hanno avuto successo nella vasovasostomia con un numero accettabile di spermatozoi che mostrano una buona motilità nel campione di sperma. Così, se entrambi i partner sono stati sani dopo l’ultimo concepimento, i fattori di infertilità diversi dalla possibile ASA sono molto meno probabili che in un gruppo di pazienti infertili. Il grande vantaggio del gruppo di vasovasostomia è infatti che il loro stato di fertilità non è noto fin dall’inizio, e un gruppo di controllo è, quindi, automaticamente incluso; cioè alcuni non hanno ASA, alcuni hanno solo IgG e alcuni hanno sia IgG che IgA. Questo sembra un gruppo ideale per studiare gli effetti dell’ASA e per valutare nuove tecniche, ed è sorprendente che sia stato così poco utilizzato. La domanda cruciale a questo proposito è, naturalmente, se gli uomini vasectomizzati producono anticorpi a tutti gli stessi antigeni contro cui possono reagire gli uomini infertili. Sono necessari ulteriori studi, ma finora non abbiamo prove che questo non sia il caso.

Questo porta alla conclusione che l’immunologia dello sperma può fornire informazioni utili per i clinici. Potrebbe non essere così essenziale ora, quando il fattore immunologico insieme a molti altri fattori di infertilità può essere superato dalle tecniche di riproduzione assistita. Tuttavia, è ancora un buon principio raggiungere una diagnosi più esatta possibile prima di istituire un trattamento.