Anticorpi specifici hanno bisogno di una validazione specifica

Uno degli strumenti più utilizzati nella ricerca biomedica è l’anticorpo monoclonale. Queste proteine hanno il potenziale per cercare e legarsi a qualsiasi bersaglio desiderato, e possono essere utilizzate per l’imaging cellulare, lo smistamento delle cellule, i saggi immunologici e molte altre applicazioni.

Ma questi cavalli di battaglia da laboratorio non sempre funzionano bene. A seconda della natura del suo bersaglio, un anticorpo potrebbe essere incoerente in alcuni test – legandosi al bersaglio sbagliato per dare risultati falsamente positivi, per esempio. Data la prevalenza dell’uso di anticorpi per la ricerca, questo è potenzialmente un problema da miliardi di dollari.

Un obiettivo importante è quello di sviluppare strategie di validazione degli anticorpi in modo che i ricercatori possano avere fiducia che un anticorpo sia adatto alle loro particolari esigenze – e che i loro risultati siano riproducibili.

Thermo Fisher Scientific ha sviluppato una piattaforma di validazione degli anticorpi in due parti per testare non solo la specificità dei suoi anticorpi InvitrogenTM (che si legano al giusto target), ma anche la loro idoneità per diverse applicazioni. Tuttavia, lo stesso test non è appropriato per tutti gli anticorpi: Thermo Fisher utilizza un test appropriato per ogni target proteico, a seconda della sua funzione biologica. Alcuni anticorpi saranno meglio testati usando CRISPR-Cas9 per eliminare il gene che codifica la proteina bersaglio, e controllando che l’anticorpo non si leghi più a nulla. Altri anticorpi potrebbero essere testati usando l’immunoprecipitazione seguita dalla spettrometria di massa per controllare che siano legati ai bersagli giusti.

Thermo Fisher sta sviluppando e perfezionando test di validazione degli anticorpi basati sulla funzione biologica dell’antigene bersaglio. Ecco due casi di studio di proteine specifiche e i loro test di specificità.

Knock-outs per il cancro

Il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) è una proteina ben studiata: la disregolazione nel percorso dell’EGFR è implicata in vari tumori. Per testare se gli anticorpi sono specifici per EGFR o per uno qualsiasi dei suoi obiettivi a valle, i ricercatori possono eliminare proteine critiche nel percorso di EGFR e vedere come cambia il segnale di legame degli anticorpi.

Negli ultimi anni, il sistema CRISPR-Cas9 è diventato noto come il modo più affidabile e potente per eliminare un gene. Questo lo rende ideale per testare la specificità degli anticorpi all’interno di una cascata di segnalazione. I ricercatori della Thermo Fisher hanno preso una linea standard di carcinoma umano (A-431) e hanno usato un western blot per ottenere una linea di base per il segnale di legame. Hanno poi usato CRISPR-Cas9 per eliminare il gene bersaglio e creare knockout EGFR. Un western blot di proteine estratte da queste cellule knockout ha mostrato che non c’era più alcun segnale per una proteina bersaglio (Figura 1).

Altri test hanno confermato il risultato. La cascata di segnalazione a valle di EGFR comprende proteine come RAS, RAF, MEK e ERK. L’attivazione di EGFR da parte del fattore di crescita epidermico (EGF) porta alla fosforilazione di queste proteine a valle, che possono essere rilevate utilizzando altri anticorpi che riconoscono questi stati fosforilati. Tuttavia, l’aggiunta di EGF alle cellule EGFR-knockout non dovrebbe provocare alcuna fosforilazione a valle. L’aggiunta degli stessi anticorpi che riconoscono gli obiettivi fosforilati non ha prodotto alcun segnale. Così, i ricercatori della Thermo Fisher sono sicuri che l’anticorpo anti-EGFR è specifico per il bersaglio.

Una serie di modifiche

Nel nucleo delle cellule, il DNA è strettamente impacchettato – avvolto intorno alle proteine istone per formare la cromatina. Studiare gli istoni è difficile, perché possono essere influenzati da una serie di cambiamenti chimici, noti come modifiche post-traslazionali (PTM). Per esempio, i residui di un istone possono guadagnare uno o più gruppi metilici, acetilici o fosforilici, ognuno dei quali ha un effetto sulla funzione cellulare.

Alcune tecniche, come l’immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), il western blotting, l’immunofluorescenza e l’immunoistochimica, usano anticorpi contro specifici PTM dell’istone per capire lo stato dell’istone e il suo legame. Tuttavia, diverse modifiche dell’istone hanno modelli simili di legame al DNA; un anticorpo che non è stato rigorosamente testato contro tutti gli istoni PTM potrebbe legarsi al tipo sbagliato e fornire un risultato falso-positivo.

Thermo Fisher ha testato i suoi anticorpi specifici per gli istoni PTM usando una serie di peptidi con una varietà di PTM. Se un anticorpo è veramente specifico per un PTM, si legherà solo a quei punti che portano quel PTM. I ricercatori della Thermo Fisher hanno misurato i segnali usando un fattore di specificità: l’intensità media di tutti gli spot che contengono un particolare PTM divisa per l’intensità media di tutti gli spot senza PTM (Figura 2). Gli anticorpi hanno mostrato un fattore di specificità da 4 a 190 volte superiore per il loro stato PTM target rispetto agli stati non target, dando fiducia che sono altamente selettivi.

Thermo Fisher ha altri sette test di specificità oltre al knock out genetico e agli array di peptidi. Questi includono l’uso di RNAi per abbattere l’espressione genica, un anticorpo differenziato per verificare indipendentemente il targeting, e l’espressione variabile naturale per confermare la specificità. Solo attraverso test così accurati e rigorosi i ricercatori possono essere sicuri che i loro cavalli di battaglia in laboratorio siano adatti allo scopo – e che il loro lavoro resisterà all’esame più attento.

Trova le note applicative su questi anticorpi Invitrogen e maggiori informazioni sull’approccio di test in due parti di Thermo Fisher Scientific qui.