AP endonucleasi EXO-3 carenza provoca ritardo nello sviluppo e anormale organogenesi vulvale, Pvl, attraverso l’attivazione del checkpoint avviato dalla glicosilasi del DNA in Caenorhabditis elegans

Il livello di espressione delle endonucleasi AP aumenta dopo lo stadio L4

Dopo la schiusa, C. elegans si sviluppa in adulti attraverso quattro stadi larvali (L1-L4), ciascuno scandito dalla muta della cuticola. Gli stadi adulti sono ancora suddivisi in due stadi: lo stadio di giovane adulto e lo stadio di adulto gravido. Per comprendere il ruolo delle endonucleasi AP dopo l’embriogenesi, abbiamo misurato il cambiamento temporale nel livello di espressione dell’mRNA di exo-3 o apn-1. A 0, 24 e 48 ore, quando la maggior parte dei vermi N2 sono nello stadio di uovo, nello stadio L1 e nello stadio L4, rispettivamente, nessuna differenza nel livello di espressione dell’mRNA è stata trovata sia per exo-3 che per apn-1 (Fig. 1a,b). A 60 ore, quando la maggior parte dei vermi N2 sono nello stadio di giovani adulti, i livelli di espressione di exo-3 e apn-1 erano circa 13 volte e 2,3 volte superiori a quelli a 0 ore, rispettivamente (Fig. 1a,b). Il livello di espressione a 72 ore, quando la maggior parte dei vermi N2 sono nello stadio di adulti gravidi, era lo stesso a 60 ore (Fig. 1a,b). Questi risultati suggeriscono che le endonucleasi AP sono richieste dopo l’embriogenesi, specialmente dopo lo stadio L4.

I mutanti exo-3 mostrano un ritardo nello sviluppo

Per chiarire il contributo delle endonucleasi AP allo sviluppo dei vermi dagli stadi L4 agli adulti, i vermi carenti di una o entrambe le endonucleasi AP (EXO-3 e APN-1) sono stati incubati in condizioni di allevamento normali per 3 giorni dallo stadio di uovo fecondato (Fig. 1c). Gli stadi di sviluppo tra gli stadi L4, giovane adulto e adulto gravido sono stati distinti dallo stato della morfologia vulvale e dalla cova delle uova (Fig. 1d,f). Anche se tutti i vermi N2 si sono sviluppati in adulti gravidi, solo il 14% dei mutanti exo-3 erano nello stadio di adulto gravido, 85% erano nello stadio di giovane adulto e 1% era nello stadio larvale (Fig. 1g), suggerendo che EXO-3 carenza provoca la cessazione dello sviluppo o ritardo nello sviluppo. Al contrario, tutti i mutanti apn-1 sono diventati adulti gravidi, e i mutanti apn-1;exo-3 erano quasi agli stessi stadi di sviluppo dei mutanti exo-3 (Fig. 1g). Dodici ore dopo, tutti i mutanti exo-3 e apn-1;exo-3 hanno raggiunto lo stadio di adulti gravidi (dati non mostrati), indicando che la carenza di EXO-3 non causa la cessazione dello sviluppo allo stadio di giovane adulto, ma solo un ritardo nello sviluppo. Per indagare con precisione quanto fosse lungo il ritardo dei mutanti exo-3, abbiamo misurato il tempo di raggiungimento dell’adulto gravido di ogni verme ogni due ore e calcolato la differenza del tempo medio tra N2 (N = 8) e i mutanti exo-3 (N = 16). La differenza era di 6 ore.

Il ritardo di sviluppo nei mutanti exo-3 dipende dalla glicosilasi NTH-1

È ragionevole dedurre che il fenotipo di ritardo di sviluppo dei mutanti exo-3 sia causato dall’accumulo di siti AP o SSB bloccati al 3′ nel DNA perché questi sono substrati per EXO-315. Queste strutture nel DNA possono essere generate dalle DNA glicosilasi. Delle due DNA glicosilasi conservate in C. elegans, UNG-1 genera siti AP attraverso un’attività monofunzionale di DNA glicosilasi sull’uracile nel DNA, e NTH-1 produce 3′-blocked SSB attraverso un’attività bifunzionale di DNA glicosilasi sulle lesioni pirimidiniche ossidative nel DNA. Pertanto, abbiamo esaminato la dipendenza del ritardo nei mutanti exo-3 da UNG-1 e NTH-1. Tre giorni dopo lo sviluppo dalle uova, il 9% dei mutanti ung-1;exo-3 erano nello stadio di adulti gravidi, l’86% erano nello stadio di giovani adulti e il 5% erano nello stadio larvale, e queste proporzioni erano quasi le stesse di quelle mostrate dai mutanti exo-3 (11% nello stadio di adulti gravidi, 85% nello stadio di giovani adulti e 4% nello stadio larvale) (Fig. 2), suggerendo che il ritardo è indipendente da UNG-1. Al contrario, il 94% dei mutanti nth-1;exo-3 erano nello stadio di adulto gravido e il 6% nello stadio di giovane adulto. I mutanti nth-1;ung-1;exo-3 hanno mostrato risultati simili (Fig. 2), suggerendo che il ritardo dipende da NTH-1.

Il ritardo di sviluppo dei mutanti exo-3 è migliorato da MMS e NaHSO3

Per chiarire se AP agenti generatori di siti possono causare ritardo di sviluppo, abbiamo condotto un saggio di sviluppo utilizzando MMS e bisolfito di sodio (NaHSO3) (Fig. 3a). MMS è noto per creare indirettamente siti AP 20,21 e dimostrato di indurre lesioni del DNA nel genoma di C. elegans22. A 3,5 giorni dopo le uova sono state deposte su piastre contenenti 0,94 mM MMS, il 97% di N2 erano nello stadio gravido adulto e il 3% erano nello stadio larvale, mentre il 61% dei mutanti exo-3 erano nello stadio gravido adulto, il 34% erano nello stadio giovane adulto e il 5% erano nello stadio larvale (Fig. 3b), suggerendo che MMS indotti siti AP causare ulteriore ritardo nello sviluppo dei mutanti exo-3 che in N2. D’altra parte, il 93% dei mutanti apn-1 erano nello stadio di adulto gravido, il 6% erano nello stadio di giovane adulto e l’1% erano nello stadio larvale, che è simile ai risultati per N2 (Fig. 3b). NaHSO3 danneggia il DNA principalmente attraverso la deaminazione della citosina a uracile23. Quattro giorni dopo lo sviluppo dallo stadio di uovo, tutti i mutanti exo-3 non trattati con NaHSO3 sviluppato in adulti gravidi, ma il 33% di quelli trattati con 10 mM NaHSO3 erano in fase di adulto gravide, il 12% erano in fase di giovane adulto e il 55% erano in fase larvale (Fig. 3c), indicando che NaHSO3 indotto ritardo di sviluppo nel exo-3 mutanti. Questo ritardo è stato alleviato nel ung-1;exo-3 mutanti, come 79% di quelli trattati con 10 mM NaHSO3 erano in fase gravida adulto, 14% erano in fase di giovane adulto e 7% erano in fase larvale (Fig. 3c), suggerendo che il NaHSO3 indotta ritardo di sviluppo era dovuto a UNG-1 attività. Presi insieme, i siti AP possono causare ritardo dello sviluppo così come 3′-bloccato SSB generato da NTH-1.

Il ritardo di sviluppo dei mutanti exo-3 è indotto da CHK-2

Abbiamo poi ipotizzato che il ritardo di sviluppo iniziato dalla glicosilasi del DNA dei mutanti exo-3 fosse dovuto all’attivazione del checkpoint dei danni al DNA guidato dai prodotti di scissione prodotti dalle glicosilasi del DNA. I geni del checkpoint del danno al DNA, come chk-2 e clk-2, sono stati descritti in C. elegans24. Per testare la nostra ipotesi, il saggio di sviluppo è stato condotto sotto chk-2 (RNAi) o clk-2 (RNAi) condizioni (Fig. 4a). Anche se il 14% del exo-3;controllo (RNAi) vermi erano nella fase gravida adulto e l’84% erano nella fase giovane adulto, e exo-3;clk-2 (RNAi) vermi dimostrato proporzioni simili (18% nella fase gravida adulto e 82% nella fase giovane adulto), 93% del exo-3;chk-2 (RNAi) vermi erano nella fase gravida adulto (Fig. 4b). Così, il knockdown di chk-2 ha salvato il ritardo di sviluppo nei mutanti exo-3, suggerendo che CHK-2 induce il ritardo di sviluppo nei mutanti exo-3.

EXO-3 previene la formazione di Pvl indotta da dut-1 (RNAi)

DUT-1 è una deossiuridina trifosfato nucleotidoidrolasi (dUTPasi), che idrolizza dUTP in dUMP. Pertanto, dut-1 (RNAi) porta ad un aumento del dUTP nel pool di nucleotidi, che viene incorporato nel DNA attraverso la replicazione del DNA al posto del dTTP, causando l’accumulo di uracile nel DNA25,26. È stato riportato che dut-1 (RNAi) induce un’anormale organogenesi vulvale, Pvl, nei vermi N2 wild-type, e che la Pvl indotta da dut-1 (RNAi) dipende da UNG-127. Abbiamo ipotizzato che la carenza di EXO-3 causi un aumento dell’incidenza della Pvl indotta da dut-1 (RNAi) perché EXO-3 è necessario per riparare i siti AP dopo la scissione dell’uracile nel DNA da UNG-1. Per confermare questo, la formazione di Pvl indotta da dut-1 (RNAi) è stata osservata nei mutanti privi di endonucleasi AP (Fig. 5a-c). Degli adulti sopravvissuti 4 giorni dopo lo sviluppo dalle uova, il 52% erano mutanti exo-3 con dut-1 (RNAi) – Pvl indotta e il 13% erano vermi N2 con Pvl (Fig. 5d), suggerendo che EXO-3 carenza provoca un aumento di dut-1 (RNAi) – Pvl indotta. D’altra parte, il 15% dei mutanti apn-1 aveva Pvl, che è simile alla percentuale di vermi N2 con Pvl (Fig. 5d). I mutanti apn-1;exo-3 e i mutanti exo-3 erano simili in proporzione, con il 52% con Pvl (Fig. 5d).

L’aumento del Pvl indotto da dut-1 (RNAi) nei mutanti exo-3 dipende da UNG-1 indipendentemente da NTH-1

Per esaminare se l’aumento del Pvl indotto da dut-1 (RNAi) nei mutanti exo-3 è avvenuto attraverso l’attività di UNG-1, abbiamo studiato la dipendenza del fenotipo da UNG-1. La percentuale di mutanti ung-1;exo-3 con Pvl era del 2%, che era la stessa di quella dei mutanti ung-1 con Pvl (1%) (Fig. 6a), suggerendo che l’aumento di Pvl nei mutanti exo-3 è dovuto solo all’espressione UNG-1.

In seguito, abbiamo esaminato se i prodotti di scissione prodotti da UNG-1 sono necessari per indurre Pvl, cioè, se i siti AP sono trasformati in 3′-blocked SSB attraverso l’attività AP liasi di NTH-1. La percentuale di mutanti exo-3 con Pvl era paragonabile a quella di nth-1;exo-3 mutanti (Fig. 7b), suggerendo che NTH-1 non è necessario per dut-1 (RNAi) – indotta Pvl.

L’aumento di Pvl indotto da dut-1 (RNAi) nei mutanti exo-3 è guidato da CHK-2

Abbiamo ipotizzato che l’aumento dipendente da UNG-1 di Pvl indotto da dut-1 (RNAi) nei mutanti exo-3 possa avvenire tramite l’attivazione del DNA checkpoint guidato dai prodotti di scissione prodotti da UNG-1 oltre al ritardo nello sviluppo. È stato anche riportato che il Pvl indotto da dut-1 (RNAi) è causato dalla chinasi del checkpoint CLK-227. Pertanto, abbiamo esaminato se l’aumento della Pvl indotta da dut-1 (RNAi) nei mutanti exo-3 dipende da CHK-2 e CLK-2. Anche se il 49% dei vermi exo-3;controllo (RNAi) aveva dut-1 (RNAi)-indotto Pvl, solo il 10% dei vermi exo-3;chk-2 (RNAi) lo aveva (Fig. 6b). D’altra parte, la proporzione di exo-3;clk-2 (RNAi) vermi con Pvl era quasi la stessa (44%) come quella del exo-3;controllo (RNAi) vermi. Pertanto, l’abbattimento di chk-2 ha salvato l’aumento di dut-1 (RNAi) – Pvl indotto nei mutanti exo-3, come osservato per il ritardo nello sviluppo. Questi risultati suggeriscono che l’aumento di Pvl indotto da dut-1 (RNAi) nei mutanti exo-3 avviene attraverso l’espressione di CHK-2.

Gli agenti ossidativi che danneggiano il DNA hanno aumentato la proporzione di Pvl nei mutanti exo-3 solo quando combinati con dut-1 (RNAi)

Per studiare altri agenti che danneggiano il DNA che causano un aumento di Pvl nei mutanti exo-3, abbiamo valutato se la formazione di Pvl è aumentata dagli agenti ossidativi che danneggiano il DNA come ndx-1 (RNAi), ndx-2 (RNAi) e methyl viologen (MV). NDX-1 e NDX-2 idrolizzare 8-oxo-dGDP in 8-oxo-dGMP24,28. Di conseguenza, ndx-1 (RNAi) e ndx-2 (RNAi) portano ad un aumento di 8-oxo-dGDP nel pool di nucleotidi. La presenza di 8-oxo-dGDP riduce l’attività 8-oxo-dGTPasi di NDX-4, causando l’accumulo di 8-oxo-dGTP nel pool24. L’8-oxo-dGTP viene incorporato al DNA durante la replicazione del DNA, con conseguente accumulo di 8-oxoG nel DNA24,28. MV genera radicali superossido, che successivamente causano lesioni ossidative nel DNA29. Tuttavia, il trattamento singolo con ndx-1 (RNAi), ndx-2 (RNAi) o MV non ha avuto alcun effetto sull’incidenza di Pvl nei mutanti exo-3. (dati non mostrati). Successivamente, abbiamo esaminato se, quando combinato con il trattamento dut-1 (RNAi), ogni agente ossidativo che danneggia il DNA ha ulteriormente migliorato l’aumento di Pvl nei mutanti exo-3 (Fig. 7a). Ogni trattamento testato migliorato l’aumento di dut-1 (RNAi) – indotta Pvl nei mutanti exo-3 di circa il 10% (Fig. 7b), suggerendo che le lesioni ossidative nel DNA può anche causare un aumento di Pvl.

In esperimenti in vitro, NTH-1 è stato trovato a possedere debole attività DNA glicosilasi verso 8-oxoG nel DNA, oltre alla sua attività molto più alta verso lesioni ossidative pirimidina30. Così, abbiamo il sospetto che il maggiore aumento di dut-1 (RNAi)-indotto Pvl dagli agenti ossidativi aggiuntivi dipende dall’attività di NTH-1. Anche se abbiamo confermato la dipendenza del fenotipo su NTH-1, NTH-1 carenza non ha alterato la percentuale di vermi che espongono Pvl (Fig. 7b).