Apocynin, un trattamento orale a basso contenuto molecolare per le malattie neurodegenerative

Si può prevedere che i componenti degli estratti vegetali chimicamente complessi possano interferire con il test di lettura a più livelli e possano anche esercitare effetti non specifici come l’uccisione del PMN o lo scavenging degli ossidrili. Questo implica che la purificazione guidata dall’attività deve essere ben focalizzata e attentamente controllata per gli effetti aspecifici per evitare risultati falsi positivi. Nonostante questi ostacoli, siamo stati in grado di dimostrare un’attività altamente specifica dell’apocinina nel test. L’apocinina è stata trovata per essere attivata metabolicamente in una reazione catalizzata da MPO con H2O2 formando un dimero simmetrico, la diapocinina (Figura 2). L’osservazione che l’intermedio di reazione potrebbe essere intrappolato con GSH ci ha portato a ipotizzare che apocynin metabolicamente attivato potrebbe bloccare la formazione di ponti tiolici tra i componenti legati alla membrana e citosolico che assemblare funzionale Nox2. In seguito si è scoperto, tuttavia, che la diapocinina inibisce direttamente la produzione di superossido di Nox2 e che questa attività è indipendente da MPO. Una scoperta importante con apocynin è stata che inibisce il burst ossidativo dei PMN, senza impedire l’uccisione intracellulare dei batteri. Questo implica che il trattamento con apocynin può prevenire danni collaterali ai tessuti infiltrati da PMN attivati senza impedire la loro funzione battericida.

Figura 2

Inibizione di microglia Nox2 da apocynin attivato metabolicamente. L’attivazione mediata dal recettore delle cellule della microglia induce la produzione di specie reattive dell’ossigeno e il rilascio di mieloperossidasi (MPO). La reazione catalizzata dalla MPO dell’apocinina con H2O2 porta alla produzione di un intermedio reattivo che si stabilizza legandosi a gruppi tiolici liberi, per esempio, GSH, o per dimerizzazione. L’apocinina dimerica (diapocinina) inibisce l’attività di Nox2.

3. Efficacia dell’apocynin nei modelli animali AIMID

La malattia bersaglio iniziale in cui abbiamo testato l’effetto clinico dell’apocynin era il modello di ratto WAG/Rij (RT-) di artrite indotta da collagene (CIA), che è un modello preclinico accettato della malattia infiammatoria autoimmune (AIMID) artrite reumatoide (RA). In questo modello, i PMN hanno un chiaro ruolo patogeno, che riflette la situazione nei pazienti RA. Nello studio sui ratti abbiamo scelto di somministrare apocynin ad una gamma di dosi da 0,3 a 200 μg/mL di acqua potabile, che è stato fornito ad libitum. Si è osservato che già alla dose più bassa di 0,3 μg/mL, corrispondente a una dose orale giornaliera di 6 μg, l’artrite era quasi completamente soppressa. Nessun effetto dell’apocinina sui livelli sierici di autoanticorpi anti-collagene o di IL-6, un’importante citochina patogena nella CIA e nella RA, è stato osservato, suggerendo un’alta selettività per la componente infiammatoria della malattia. Indipendentemente da noi, Hougee et al. hanno dimostrato in un modello di CIA nel topo che l’apocinina somministrata per via orale ripristina la produzione bloccata di proteoglicano della cartilagine nell’articolazione artritica. Un intrigante effetto collaterale del trattamento, che illustra il potente effetto antinfiammatorio dell’apocinina, è stata la drammatica soppressione delle lesioni cutanee necrotizzanti nei siti in cui è stata iniettata la formulazione antigene/CFA immunizzante.

Dalla sua identificazione iniziale come potente agente anti-infiammatorio nel 1990, l’apocinina è diventata un inibitore stabilito del burst ossidativo nei neutrofili, come dimostrato in una vasta gamma di modelli in vivo per disturbi infiammatori immuno-mediati che colpiscono gli organi periferici e centrali. Di particolare importanza per questa recensione sono i promettenti effetti clinici osservati in modelli di malattie neurodegenerative, tra cui SLA, Alzheimer e morbo di Parkinson. In questi modelli l’attività antiossidante dell’apocinina non è mirata al neutrofilo ma al “macrofago del cervello”, cioè la microglia.

4. Microglia

Il cervello contiene vari tipi di cellule con la capacità di esercitare funzioni immunitarie tra cui astrociti, cellule della microglia e macrofagi situati nelle meningi e negli spazi perivascolari di arterie e capillari cerebrali. Per i loro compiti immunitari queste cellule sono dotate di recettori conservati per i modelli molecolari associati ai patogeni o ai danni, che trasmettono segnali di attivazione alle cellule per indurre meccanismi effettori infiammatori.

La microglia è una cellula immunitaria innata ubiquitariamente distribuita nel sistema nervoso centrale dove è impegnata in una stretta interazione con neuroni, oligodendrociti e astrociti. Tuttavia, solo la microglia rilascia MPO dopo la stimolazione, essendo un requisito per l’attivazione metabolica dell’apocinina.

La microglia nel SNC sano ha un fenotipo a riposo ramificato. Contrariamente ai concetti precedenti, le microglia nel cervello sano non sono a riposo, ma sono cellule altamente dinamiche che svolgono una sorveglianza omeostatica dell’ambiente extracellulare attraverso l’estensione e la ritrazione delle loro protrusioni e la fagocitosi dei detriti di tessuto, che potrebbero altrimenti causare l’infiammazione. Le microglia attivate si trovano nel tessuto malato del SNC, come all’interno delle lesioni della materia grigia corticale demielinizzata nel cervello della SM, circondando le placche amiloidi nel cervello di Alzheimer e nella substantia nigra degenerante nella malattia di Parkinson. Anche se i diversi profili di espressione della microglia sembrano riflettere un ampio e continuo spettro di stati di attivazione, due stati di attivazione alle due estremità dello spettro possono essere riconosciuti corrispondenti allo stato M1 e M2 designato per i macrofagi. La microglia M1 “classicamente attivata”, per esempio, indotta da LPS o IFNγ, ha funzioni proinfiammatorie che sono esercitate dalla secrezione di citochine proinfiammatorie come TNF-α, IL-1β e IL-12 e sostanze tossiche come le specie reattive dell’ossigeno e dell’azoto. Le microglia M2 “attivate alternativamente”, come quelle indotte in un ambiente contenente alti livelli di IL-4 o IL-13, hanno attività antinfiammatorie e rigenerative dei tessuti, che sono mediate da citochine come IL-4, IL-10 o TGF-β e fattori di riparazione come il fattore di crescita insulino-simile, l’arginasi-1 o la chitinasi-like-1. Non solo il milieu di citochine, ma anche lo stato redox del microambiente, che è direttamente correlato all’attività della NADPH ossidasi, determina la differenziazione funzionale della microglia verso un fenotipo M1 o M2. Apocynin come potenziale trattamento della malattia neurodegenerativa

Le cellule della microglia M1 sono la principale risorsa di Nox2 nel cervello. L’espressione da parte della microglia M1 di Nox2 attivata che produce ROS è una componente essenziale della neurotossicità mediata dalla microglia. La nozione ampiamente accettata che i ROS derivati dalla microglia sono importanti mediatori di lesioni cerebrali neurodegenerative solleva la questione se il profilo farmacologico favorevole e la bassa tossicità dell’apocinina possano essere utilizzati per il trattamento neuroprotettivo. Le cellule della microglia non solo esprimono Nox2 ma secernono anche MPO dopo l’attivazione e potrebbero quindi potenzialmente esercitare l’attivazione metabolica dell’apocynin. Diversi autori hanno riportato l’effetto benefico dell’apocynin su (modelli di) disturbi neurologici acuti, come l’ischemia, l’emorragia intracerebrale e l’ictus (rivisto in ). Quali sono le prospettive per l’apocinina nei disturbi neurodegenerativi cronici?

Studi in vitro utilizzando microglia in coltura hanno implicato Nox2-derivato ROS nella proliferazione e polarizzazione funzionale della microglia. Una scoperta cruciale è stata che l’inibizione di Nox2 promuove l’attivazione alternativa e antinfiammatoria della microglia durante la neuroinfiammazione. Questo implica che la soppressione di Nox2 con apocynin potrebbe ripristinare un sano equilibrio tra un pro-infiammatorio M1 e un anti-infiammatorio / rigenerativo fenotipo M2 di microglia. Altri hanno dimostrato che l’apocynin abbassa la produzione di IL-1β, TNF-α e ossido nitrico da parte della microglia, interrompendo così un ciclo auto-perpetuante di attività dannose. Mentre l’esatto meccanismo neurotossico della microglia attivata nella malattia neurodegenerativa è ancora incerto, è anche di notevole interesse che il rilascio del glutammato eccitotossina richiede l’attività Nox2 e che questo può essere inibito da apocynin . Presi insieme, questi dati suggeriscono un ruolo potenzialmente benefico di apocynin nelle malattie neurodegenerative. Infatti, effetti promettenti di apocynin sono stati osservati in modelli murini di alcune importanti malattie neurodegenerative.

Sclerosi laterale amiotrofica (SLA, malattia di Lou Gehrig). La sclerosi laterale amiotrofica è una comune malattia neurodegenerativa a esordio adulto che colpisce i motoneuroni. La malattia porta ad una rapida progressione della disabilità motoria e alla morte, di solito entro 5 anni. Mentre nella maggior parte dei pazienti la causa della malattia è sconosciuta, in un sottoinsieme di casi la malattia ha una causa genetica, cioè mutazioni nel gene della superossido dismutasi-1 (SOD1). La mutazione aumenta lo stress ossidativo attraverso la produzione disregolata di anione superossido a causa della ridotta dismutazione in H2O2. Gli astrociti mutanti che esprimono la SOD1 sono legati alla patologia della SLA a causa della loro ridotta capacità di assorbire il glutammato e/o dal loro rilascio di fattori neurotossici. Il silenziamento selettivo della SOD1 mutante o la sostituzione della microglia mutante con quella wild-type nel modello di topo SOD1 mutante indicano fortemente un ruolo patogeno centrale della microglia. Harraz et al. hanno usato apocynin orale per controllare la progressione della neurodegenerazione in un modello di topo mutante SOD1 e osservato effetti promettenti; è stato osservato che la somministrazione di apocynin nell’acqua potabile significativamente prolungato la sopravvivenza e ritardato l’insorgenza di difetti motori. Questo studio dimostra che l’apocinina somministrata per via orale può accumulare una concentrazione sufficientemente alta all’interno del parenchima del SNC per mitigare i livelli neurotossici della produzione di ROS. Tuttavia, questi dati promettenti non hanno potuto essere riprodotti in un altro studio utilizzando lo stesso ceppo di topo mutante.

Malattia di Alzheimer (AD). La malattia di Alzheimer è un disordine neurologico progressivo associato all’invecchiamento che porta alla demenza irreversibile. I segni distintivi neuropatologici dell’AD sono placche senili di aggregati amiloidi-β mal ripiegati e fibrillari e grovigli intraneuronali di proteina tau nella corteccia cerebrale. Le cellule della microglia attivate sono state trovate raggruppate intorno alle placche senili producendo agenti neurotossici come ROS, NO, e TNF-α. L’attivazione della microglia Nox2 da parte dell’amiloide-β oligomerica e/o fibrillare e l’espressione di Nox2 attivata nel cervello di Alzheimer sono stati riportati.

Lull et al. hanno testato l’apocynin a una dose orale giornaliera di 10 mg/kg attraverso l’acqua potabile in un modello murino transgenico hAPP di AD. Hanno osservato nei topi trattati con apocynin una significativa riduzione delle dimensioni delle placche nella corteccia e nell’ippocampo e una riduzione del numero di microglia nella corteccia, ma non nell’ippocampo. Tuttavia, una caratteristica comportamentale di AD osservata in questo modello di topo, cioè le prestazioni nel test di nuoto del Morris water maze, che testa la memoria spaziale organizzata nell’ippocampo, non è stata marcatamente migliorata dal trattamento. L’effetto clinico limitato di apocynin nel modello potrebbe essere dovuto all’assenza di una chiara neuroinfiammazione, mentre questa è più prominente nei pazienti AD, e per il fatto che la formazione di placche non prevede necessariamente il declino cognitivo.

Malattia di Parkinson (PD). Il segno distintivo patologico della PD è una progressiva degenerazione dei neuroni che producono dopamina nella substantia nigra (SN), una struttura pigmentata situata nella parte inferiore del mesencefalo. Attraverso il rilascio di dopamina, la SN ha un ruolo centrale nel coordinamento di varie funzioni neurologiche, tra cui la ricompensa, la dipendenza e il movimento. Quest’ultima funzione è particolarmente disturbata nel PD. Per compensare la perdita di dopamina, viene somministrato un precursore metabolicamente stabile della dopamina (L-DOPA), che in un numero consistente di pazienti causa i tipici movimenti involontari noti come sindrome ipercinetica. Mentre nella stragrande maggioranza dei pazienti con PD (sporadica) la causa della malattia non è nota, in una piccola frazione è stata trovata una causa genetica, ovvero mutazioni in diversi geni, tra cui l’alfa-sinucleina, la parkina, la chinasi 2 con ripetizione ricca di leucina, la putativa chinasi 1 indotta da PTEN e l’ATP13A2 . L’osservazione che i consumatori di eroina contaminata con MPTP hanno sviluppato sintomi di PD ha permesso la generazione di un modello animale di PD clinicamente rilevante. Dopo la conversione di MPTP in MPP+ da parte della monoammina ossidasi B negli astrociti, MPP+ si concentra nelle cellule dopaminergiche tramite l’assorbimento attraverso il trasportatore specifico della dopamina, dove blocca il complesso I della catena respiratoria mitocondriale. Il conseguente stress redox causa tra l’altro una disregolazione del Ca2+ cellulare che porta alla morte cellulare. Proprio come nella SLA e nel MA, la neurodegenerazione nel PD si trova associata all’attivazione della microglia Nox2, che si pensa contribuisca significativamente al processo patogeno.

Utilizzando un sistema in vitro, Gao et al. hanno dimostrato che i ROS generati dalla microglia Nox2 aumentano la sensibilità dei neuroni dopaminergici a MPP+. Un effetto benefico di apocynin sugli effetti neurotossici mediati dalla microglia è stato dimostrato in un modello murino di PD.

6. L’effetto di Apocynin in un modello di malattia di Parkinson dei primati non umani

L’iniezione ripetitiva di una bassa dose di MPTP nelle uistitì comuni, un primate neotropicale dal corpo piccolo, provoca una malattia neurologica che a livello di presentazione clinica e neuropatologica si avvicina molto alla PD. Abbiamo usato questo modello MPTP in 5 gemelli marmoset per verificare se apocynin orale è anche efficace in una specie superiore. Per la somministrazione orale, l’apocynin è stato sciolto in gomma arabica; un fratello di ogni gemello è stato dato apocynin contenente gomma e l’altro è stato dato solo la gomma. Il trattamento con apocynin (100 mg/kg, TID) è iniziato una settimana prima dell’induzione di PD con MPTP (1 mg/kg, tramite iniezione sottocutanea per 8 giorni). L’apocynin ha limitato la tipica perdita di peso corporeo associata alla sindrome parkinsoniana. Anche la funzione motoria nelle scimmie trattate con apocynin è stata migliorata, indicando un’efficacia anti-Parkinson dell’apocynin. Inoltre, il numero di neuroni dopaminergici sopravvissuti è stato aumentato dall’apocinina, indicando un’efficacia neuroprotettiva. È interessante notare che l’apocinina ha una struttura molecolare simile a quella dell’acido omovanillico (HVA), un metabolita della dopamina. Una spiegazione dell’efficacia protettiva dell’apocynin nel PD potrebbe anche essere legata alla compensazione del ridotto livello del naturale disponibile o-metossicatecolo HVA.

7. Prospettiva per il trattamento dei pazienti umani

L’apocynin è un prodrug potenzialmente attraente per via della sua bassa tossicità generale e del fatto che la sua azione antiossidante specifica è suscitata dopo l’attivazione metabolica dalle cellule fagocitiche che rilasciano MPO. I dati sulla sicurezza dell’apocinina sono scarsi, ma quelli disponibili mostrano una bassa tossicità e un’alta stabilità (in parte rivisti in ). La DL50 dopo un dosaggio orale nei topi è stata stimata a 9 g/kg. Nei ratti circa l’80% dell’apocynin iniettato per via intraperitoneale a 120 mg/kg è stato recuperato in forma invariata in un campione di urina raccolto 20 ore dopo. Una dose endovenosa di 420 mg/kg di apocynin nei topi ha causato segni minimi di tossicità.

A nostra conoscenza, l’apocynin non è stata testata in pazienti umani con malattie neurodegenerative. Tuttavia, Peters et al. hanno valutato il potenziale terapeutico dell’apocinina inalata sull’iperreattività bronchiale indotta dall’ozono alla metacolina in pazienti asmatici come modello di malattia polmonare infiammatoria. Gli autori hanno potuto escludere lo scavenging dell’ozono da parte dell’apocinina e hanno concluso che l’effetto era quello di mitigare la produzione di ROS da parte dei PMN e degli eosinofili che avevano infiltrato il polmone al momento dell’esposizione all’ozono.

Gli studi sui topi discussi in questa revisione mostrano che basse dosi di apocinina somministrata per via orale raggiungono il parenchima del SNC in una concentrazione sufficiente per inibire il burst ossidativo della microglia e inibire la neurodegenerazione. Tenendo conto della bassissima tossicità sistemica e della modalità d’azione altamente specifica dell’apocinina, sarebbe una prospettiva interessante per testare il valore terapeutico nella malattia neurodegenerativa umana.

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che non c’è conflitto di interessi per quanto riguarda la pubblicazione di questo articolo.

Riconoscimenti

Gli autori desiderano ringraziare il signor Henk van Westbroek (BPRC) per la preparazione del lavoro artistico.