Aporphine alkaloids from Ocotea macrophylla (Lauraceae)
ARTIGO
Aporphine alkaloids from Ocotea macrophylla (Lauraceae)
Ludy Cristina Pabon*; Luis Enrique Cuca
Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Bogotá, KR 30 45 03, Colombia. AA 14490
ABSTRACT
Quattro alcaloidi aporfini dal legno di Ocotea macrophylla (Lauraceae) sono stati isolati e caratterizzati come (S)-3-metossi-nordomesticina (1), (S)-N-etossicarbonil-3-metossi-nordomesticina (2), (S)-N-formil-3-metossi-nordomesticina (3) e (S)-N-metossicarbonil-3-metossi-nordomesticina (4); Gli alcaloidi 2-4 sono riportati per la prima volta. La struttura dei composti isolati è stata determinata sulla base dei loro dati spettrali e dal confronto dei loro dati spettrali con i valori descritti in letteratura. La frazione alcaloide e il composto 1 hanno mostrato attività antifungina contro Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici e anche il composto 1 ha mostrato attività antimicrobica verso Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis pure.
Keywords: Ocotea macrophylla; alcaloidi aporfini; Lauraceae.
INTRODUZIONE
Il genere Ocotea (Lauraceae) comprende più di 350 specie presenti nel continente americano e nell’Africa meridionale.1,2 In Colombia, ci sono 35 specie di Ocotea distribuite in tutto il paese, principalmente nelle foreste andine.3 Nella medicina tradizionale, alcune specie di Ocotea hanno mostrato diverse applicazioni. O. quixos è usata come disinfettante, anestetico locale e antidiarroico.4 O. lancifolia è usata come antiparassitario, e O. caparrapi è usata per trattare morsi di insetti, morsi di serpente, bronchite e tumori cancerosi.5,6
Chimicamente, il genere Ocotea è conosciuto principalmente come fonte di metaboliti tipo furofurano7 e tetraidrofurano lignani,8 bicyclooctane9 e benzofurano neolignani,10 e benzilisochinolina11 e alcaloidi aporfini.5 In studi precedenti, quattro alcaloidi aporfina dal legno di Ocotea macrophylla sono stati isolati e identificati come nantenina, glaucina, isocorydina e deidronantenina.12,13 In questo lavoro, descriviamo l’isolamento e la determinazione strutturale di tre nuovi alcaloidi aporfini 2-4 oltre alla (S)- 3-metossi-nordomesticina 1 e le attività antibatteriche e antifungine dei composti riportati.
RESULT E DISCUSSIONE
L’estratto etanolico del fusto di O. macrophylla è stato sottoposto a un’estrazione acido-base per ottenere una frazione alcaloide, che è stata ulteriormente sottoposta a frazionamento e purificazione con metodi cromatografici che hanno portato all’isolamento di quattro alcaloidi: (S)-3-metossi-nordomesticina (1), (S)-N-etossicarbonil-3-metossi-nordomesticina (2), (S)-N-formil-3-metossi-nordomesticina (3) e (S)-N-metossicarbonil-3-metossi-nordomesticina (4). Le strutture degli alcaloidi 1-4 sono mostrate nella Figura 1 e i dati spettroscopici nella Tabella 1.
Il segnale a δH 6.30 (1H, s) non ha mostrato connettività nell’esperimento HMQC, indicativo della presenza di un gruppo OH fenolico, supportato dall’IR. L’analisi dello spettro HMBC ha permesso la localizzazione dei sostituenti, in base alle correlazioni osservate tra i segnali a δH 5.94 e 5.95 (per il gruppo metilendiossi) con i segnali a δC 145.9 (C-9) e 146.2 (C-10), e questi ultimi due segnali con i protoni a δH 6.70 (H-8) e 7.90 (H-11), rispettivamente, suggerendo la presenza di un gruppo metilenediossi nelle posizioni 9 e 10 e due idrogeni sull’anello aromatico in un orientamento para. La presenza del gruppo idrossile in posizione 1, è stata determinata utilizzando le correlazioni tra i segnali a δH 6.30 e δC 116.5, assegnati a C-11b. La posizione dei gruppi metossilici in posizione C-2 e C-3, sono stati assegnati secondo la correlazione degli idrogeni a δH 3.96 e 3.86 con i carboni a δC 138.4 (C-2) e δC 147.8 (C-3), rispettivamente.
La configurazione assoluta di C-6a è stata assegnata come S, perché ha un effetto Cotton negativo a 280 nm e un effetto Cotton positivo a 240 nm nella curva CD.17 Inoltre, questo è stato confermato dal valore positivo della rotazione ottica 25D = +51,7 (c 0,38, CHCl3).18 Pertanto, l’alcaloide 1 è stato determinato come (S)-3-metossi-nordomesticina, un alcaloide aporfina riportato precedentemente da Nectandra sinuata19 anche appartenente alla famiglia delle Lauraceae. Questo rapporto corregge e completa i dati spettroscopici per questo composto.
L’alcaloide 2 è stato ottenuto come un olio giallo che dà una reazione positiva al reagente di Dragendorff e il suo valore di rotazione ottica era 25D 25D = +33.3 (c 0.60, CHCl3). Lo spettro UV e IR di 2 erano simili a quelli di 1, eccetto per la comparsa, in entrambi gli spettri, di assorbimenti dovuti ad un gruppo carbammato a 282 nm e a 1688 cm-1, rispettivamente.20 Gli spettri 1H e 13C NMR hanno mostrato un profilo simile a quello di 1. Nell’1H NMR sono apparsi due nuovi segnali a δH 4.29 (2H, m) e 1.29 (3H, m), così come lo spostamento del segnale H-5, dovuto alla presenza di un gruppo deproteico in prossimità. L’esperimento COSY ha mostrato la correlazione dei segnali δH 4.29 e 1.29, che indica la presenza di un gruppo etilico che a causa del suo spostamento, ha suggerito di essere attaccato ad un eteroatomo. Gli spettri 13C NMR e DEPT hanno mostrato la comparsa di tre nuovi segnali a δC 158.8 (C), 61.0 (CH2), e 14.8 (CH3), segnali tipici di un gruppo etossicarbonilico attaccato a un atomo di azoto. La configurazione assoluta di C-6a è stata determinata come S, perché ha mostrato gli stessi effetti Cotton di 1. Pertanto il composto alcaloide 2 è stato identificato come (S)-N-etossicarbonil-3-metossi-nordomesticina. Il suo spettro ESIMS ha dato un picco di ioni pseudomolecolari a m/z 414 + corrispondente alla formula molecolare di C22H22NO7, e le frammentazioni erano dovute alla perdita di CH3OH e CH3CH2OH a m/z 382 + e m/z 368 +, rispettivamente. Lo spettro ESI in modalità ione negativo ha mostrato picchi a m/z 412 – e m/z 383 ., essendo l’ultimo la perdita di un gruppo etilico. Questo tipo di alcaloidi con sostituenti N-etossicarbonile sono stati isolati da Lindera angustifolia (Lauraceae).21
Alcaloide 3, è stato ottenuto come un olio giallo, con un valore di rotazione ottica di 25D 25D = +7,5 (c 0,53 CHCl3). Lo spettro IR era simile a quello degli alcaloidi 1 e 2. Inoltre, è stata osservata la presenza di assorbimenti a 2830, 2700, 1739 cm-1, caratteristici del gruppo formile. In modalità negativa HRESIMS è stato osservato lo ione pseudomolecolare – a m/z 369.1133, corrispondente alla formula molecolare di C20H20NO6. La modalità di ione negativo degli spettri ESI-MS ha mostrato la perdita di un gruppo formile a m/z 339. Il profilo NMR era simile a quello degli alcaloidi 1 e 2. Nella 1H NMR sono apparsi diversi segnali appartenenti a una miscela di due isomeri in rapporto 3:1. Il confronto dell’isomero maggiore con l’alcaloide 1 in NMR, ha mostrato lo stesso schema di sostituzione dell’anello aromatico, oltre alla comparsa di due nuovi segnali a δH 8.25 (1H, s) nel 1H e a δC 161.9 nel 13C del gruppo formile a 3. Questa funzionalità sull’azoto ha portato alla formazione di isomeri rotazionali, che sono stati descritti in precedenza per alcaloidi con un gruppo N-formile e N-acetil.22 La configurazione assoluta è stata determinata come S, nello stesso modo che per 1 e 2. Pertanto, questo alcaloide 3 è stato identificato come (S)-N-formile-3-metossi-nordomesticina.
L’alcaloide 4 è stato ottenuto come un solido bianco con un punto di fusione di 222-223 ºC (MeOH), e con una rotazione ottica di 25D 25D = +47.0 (c 0.55 CHCl3). L’analisi dei dati NMR di 4 ha rivelato che ha lo stesso scheletro di base di 2, ma ha un estere metilico secondo i segnali a δH 3.76 (3H, s) e δC 52.6 per 4 al posto dei segnali per il gruppo etilico in 2. HRESIMS ha mostrato uno ione pseudomolecolare – a m/z 398.1233 corrispondente alla formula molecolare C22H22NO7. Pertanto, l’alcaloide 4 è stato identificato come (S)-N-metossicarbonil-3-metossi-nordomesticina.
L’attività antifungina è stata valutata attraverso il metodo della diffusione del disco contro Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,23 un fungo fitopatogeno che colpisce i raccolti di pomodoro, causando enormi perdite per gli agricoltori. La frazione alcaloide era attiva contro F. oxysporum a 250 μg/μL. L’attività inibitoria contro la crescita dei funghi era moderata a 5 μg/μL per (S)-3-metossi-nordomesticina 1, mentre gli altri alcaloidi erano inefficaci, suggerendo che la presenza di sostituenti che ritirano elettroni sull’atomo di azoto diminuisce l’attività antifungina.
Anche se pochi rapporti di valutazione dell’attività antifungina delle aporfine, è stato trovato che queste sono attive contro specie come Candida albicans,24,25 ma inattive contro patogeni fungini come Cladosporium herbarium.26 Questi risultati sono un nuovo rapporto di valutazione dell’attività antifungina di questi alcaloidi, dove si sottolinea che il tipo di sostituenti sull’azoto delle aporfine ha un effetto sull’attività antifungina che presentano.
L’attività antibatterica è stata valutata con metodo di diffusione radiale riportato da Lerhrer27 contro due ceppi Gram (+) standard: Staphylococcus aureus 6538 e Enterococcus faecalis 29212 e tre Gram (-): Escherichia coli 25922 e Salmonella tiphymurium, ceppi MS7953 e 14028s. L’alcaloide 1 (2,5 μg) ha mostrato attività antimicrobica contro entrambi i batteri Gram positivi valutati con valori di 30 AU come mostrato nella tabella 2.
È stato riportato per la miscela racemica del composto 3-metossi-nordomesticina, la sua attività contro E. coli (MIC= 256 μg/mL) e S. aureus (MIC= 512 μg/mL),28 tuttavia in questo caso il composto 1 non è attivo contro E. coli. coli.
Similmente come nell’attività antifungina, i risultati mostrano che la natura del sostituente sull’azoto influenza l’attività antibatterica (Tabella 2).
ESPERIMENTALE
Procedure generali
Il punto di fusione è stato determinato utilizzando Mel-temp Fisher Johns, Laboratory Device. Gli spettri UV sono stati registrati su un Perkin Elmer Lambda 2S e gli spettri CD su uno spettrometro JASCO J-720. Gli spettri IR sono stati ottenuti su Perkin Elmer FT-IR Panagon 500 serie 1000 come film sottile. Le rotazioni ottiche sono state registrate su un polarimetro Schmidt-Haensch. Gli spettri NMR 1H (400 MHz) e 13C (100 MHz), così come gli spettri 2D (COSY, HMQC e HMBC) sono stati eseguiti su uno spettrometro Bruker Avance 400 MHz usando CDCl3 come riferimento interno. HRMS sono stati determinati su un sistema Shimadzu LCMS-IT-TOF spettrometro di massa con ESI in modalità ione positivo e negativo. La cromatografia su colonna (CC) è stata eseguita con gel di silice (70-230 e 230-400 mesh, Merck), e la cromatografia analitica è stata eseguita con gel di silice 60 PF254 (0,25 mm).
Materiale vegetale
I fusti di O. macrophylla sono stati raccolti nel luglio 2006 a Nocaima, Colombia da W. Delgado. L’esemplare botanico è stato identificato da A. Jara, e un esemplare voucher (COL-517191), ed è stato depositato nell’Erbario Nazionale Colombiano dell’Università Nazionale della Colombia, Bogotà, Colombia.
Estrazione e isolamento
Steli essiccati e alimentati (2,0 kg) di Ocotea macrophylla sono stati estratti con EtOH per macerazione a temperatura ambiente e concentrati sotto vuoto per ottenere un estratto (102,6 g). Un campione (48,9 g) di questo estratto è stato solubilizzato in acqua con gli ultrasuoni e acidificato con HCl 5% a pH 2,0. La sospensione acida è stata poi filtrata e basificata con 20% NaOH a pH 8,0, e successivamente estratta con cloroformio. La frazione di cloroformio (3,01 g) è stata sottoposta a cromatografia su colonna con gel di silice ed eluita con un gradiente di etere di petrolio:AcOiPr (4:6 a 0:10) e AcOiPr:MeOH (10:0 a 0:10), ottenendo quattro frazioni (I-IV). La frazione I (347 mg) è stata cromatografata ripetutamente in colonna (CC) su gel di silice ed eluita con n-esano:AcOiPr (9:1-8:2), CHCl3, e Tol:AcOiPr 7:3. Questo ha prodotto gli alcaloidi 1 (7 mg) e 2 (4 mg). La frazione II (250 mg) è stata sottoposta a cromatografia su colonna su gel di silice ed eluita con CHCl3:AcOEt (85:15), poi sottoposta a CC su Sephadex LH-20 (CH3OH) per produrre l’alcaloide 3 (8 mg). La frazione IV (1433 mg) è stata purificata mediante cromatografia su colonna ripetitiva su gel di silice utilizzando CH2Cl2:MeOH 97:3 e CH2Cl2 come sistemi di eluizione. Infine, lavaggi successivi con MeOH hanno prodotto l’alcaloide 4 (98 mg).
Saggio antimicotico
F. oxysporum è stato ottenuto dalla collezione di culture dell’Università di Cundinamarca (Dipartimento di Agronomia, Laboratorio di Fitopatologia). La PDA è stata usata come mezzo per i saggi di attività antifungina. Il terreno di coltura è stato inoculato con 100 μL di una soluzione di 105 spore. I campioni sono stati preparati in soluzioni di diverse concentrazioni, corrispondenti a 50, 25, e 10 μg/μL della frazione alcaloide e 5, 2,5 1,0, 0,5, 0,2, e 0,1 μg/μL degli alcaloidi puri. Dieci microlitri di campioni sono stati applicati sui dischi di carta da filtro e posti sul terreno inoculato. Le piastre sono state sigillate e lasciate in un’incubatrice per 3 giorni a 25 °C. Le zone chiare che appaiono contro un fungo in crescita hanno indicato la quantità minima di frazione o alcaloide necessaria per inibire la crescita del fungo. Sono state fatte tre repliche per ogni trattamento. Il Benomyl (benzimidazolo – 5 μg) è stato usato come controllo positivo, e l’acetone è servito come controllo negativo.23
Saggi antibatterici
L’attività antibatterica è stata valutata con il metodo della diffusione radiale adattato dalla metodologia precedentemente pubblicata da Lehrer.27 I composti sono stati valutati contro due ceppi Gram (+): Staphylococcus aureus ATCC 6538 e Streptococcus fecalis ATCC 29212 e tre ceppi Gram (-): Escherichia coli ATCC 25922 e Salmonella tiphymurium, ATCC 14028s e Salmonella tiphymurium MS7953. Una colonia isolata da ogni ceppo è stata depositata in 3 mL di tripticasi di soia (TSB) per i ceppi Gram (+) e Luria Broth (LB) per i ceppi Gram (-), e sono stati incubati a 37 °C con agitazione, fino a quando i microrganismi erano in fase logaritmica. Il surnatante è stato rimosso e il sedimento ottenuto è stato risospeso in tampone fosfato (PBS), seguito da lavaggi con PBS e centrifugazione. Infine il sedimento è stato risospeso in PBS e la densità ottica determinata a 620 nm per calcolare il numero di CFU (colony forming units) per millilitro. Si disperde un certo volume che contiene 4 x 107 CFU in ogni piatto. Il volume misurato è stato mescolato e omogeneizzato in 15 mL di agarosio fuso a più o meno 45 °C. Questa sospensione batterica è stata servita in piastre di Petri e lasciata solidificare a temperatura ambiente, dopo di che sono stati fatti dei fori di 2 mm di diametro con un punzone sterile.
I campioni di prova sono stati preparati sciogliendo 1 mg del composto puro in 500 μL di DMSO, che sono posti 8 μL del campione in doppio e incubati a 37 °C per 30 min. Dopo questo tempo è stato aggiunto il mezzo nutritivo, che contiene agar agar fuso e TSB, incubato per 18 h a 37 ºC e poi il diametro delle zone di inibizione è stato misurato dall’attività del composto. I controlli positivi utilizzati sono stati diversi antibiotici, Ampicillina (50 mg/mL), Kanamicina (10 mg/mL) e Tetraciclina (4,12 mg/mL) ad una diluizione 1:100 in PBS ed è stato utilizzato come controlli negativi DMSO e PBS, ogni controllo 8 μL essere servito da ogni pozzo. I diametri delle zone di inibizione sono stati misurati in millimetri e i risultati sono stati riportati come unità di attività secondo il rapporto che stabilisce che 1 unità di azione (UA) è uguale a 0,1 mm della zona di inibizione.
MATERIALE SUPPLEMENTARE
Riconoscimenti
Gli autori vogliono ringraziare l’Università Nazionale della Colombia per il suo sostegno finanziario per questo progetto. Inoltre, il laboratorio di risonanza magnetica nucleare e il laboratorio di spettrometria di massa sono riconosciuti per il loro sostegno nella registrazione degli spettri NMR e l’HR-ESI-MS, rispettivamente. Inoltre, gli autori desiderano ringraziare l’Università Javeriana per le rotazioni ottiche, la FIDIC (Foundation Institute of Inmunology of Colombia) per la registrazione degli spettri CD e soprattutto al Prof. J. M. Lozano per i saggi di attività antibatterica.
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Ricevuto il 26/6/09; accettato il 6/11/09; pubblicato sul web il 10/3/10
* email: [email protected]
MATERIALE SUPPLEMENTARE
