Associazione dei genotipi HPV con le verruche anogenitali esterne: uno studio trasversale
Disegno dello studio e partecipanti
È stato condotto uno studio trasversale che utilizza un campione non probabilistico. I pazienti che frequentano le cliniche dermatologiche dell’area del distretto sanitario di Farwania sono stati reclutati nello studio consecutivamente da novembre 2016 a maggio 2017. Ai pazienti immunocompetenti con precedente diagnosi clinica di verruche anogenitali esterne programmate per la crioterapia o il trattamento laser è stato chiesto di firmare il modulo di consenso dopo una spiegazione verbale del dermatologo che sollecitava la loro partecipazione. Al momento del prelievo, i campioni di verruche sono stati raccolti in un mezzo di trasporto universale (HealthLink Inc., Copan Italia S.p.A., Italia), e conservati a – 80 °C. L’approvazione etica è stata ottenuta dal Comitato etico del Health Sciences Center (numero: VDR/EC/2310) e dal Ministero della Salute.
Informazioni demografiche e cliniche sono state prese da ogni paziente, tra cui: età (anni), sesso (maschio, femmina), nazionalità (kuwaitiano, non kuwaitiano), numero di verruche (uno, da due a quattro, e almeno cinque), durata della presenza di verruche (< un mese, da uno a sei mesi, da sette a 12 mesi, e più di 12 mesi), dimensione di ogni verruca (in centimetri) (< uno, uno, tra uno e due, più di due), partner ha verruche (sì, no), e se le verruche sono state oggetto di trattamento precedente (sì, no). Nessuno dei partecipanti ha ricevuto la vaccinazione HPV, perché la vaccinazione HPV non è ancora stata implementata in Kuwait, anche se la sua attuazione è attualmente in discussione presso il Ministero della Salute.
estrazione del DNA e controlli
I campioni di tessuto ricevuti sono stati conservati a – 80 °C. A causa del gran numero di campioni ricevuti, tutte le verruche per paziente sono state tritate insieme e sono state sottoposte a un unico isolamento del DNA. Il tessuto è stato tritato con forbici e pinze sterili su un piatto Petri e circa 25 mg di tessuto è stato pesato. Il tessuto è stato lavato in tampone fosfato (PBS) e trasferito in provette Eppendorf da 1,5 ml. Il DNA genomico è stato estratto dai campioni di tessuto utilizzando un kit QIAmp DNA Mini (Qiagen, USA) secondo le istruzioni del produttore.
I vettori HPV tipo 2, HPV tipo 1 e HPV tipo 16 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) sono stati utilizzati come controlli negli esperimenti PCR.
PCR in tempo reale
Il test PCR in tempo reale è stato eseguito per ricercare il DNA HPV nelle verruche genitali. Cinque microlitri (5-μl) del DNA estratto sono stati combinati con 12,5-μl di 2X Syber Green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) contenente ROX come riferimento passivo, e 10 pmol di primer forward e reverse (10-uM, descritti sotto). Tutti i set di primer sono stati sintetizzati su misura da Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA. La miscela è stata fatta fino a 25-μl di volume con acqua priva di nucleasi (Ambion, Austin, TX, USA). Al fine di ridurre il numero di risultati falsi positivi o negativi, i campioni sono stati analizzati in duplicato su una piastra di reazione a 96 pozzetti ottici (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). I controlli positivi e negativi sono stati inclusi in ogni lotto di amplificazione. Per quantificare l’HPV nei campioni, è stata eseguita una diluizione seriale da 5 a 10 volte del DNA di controllo positivo noto insieme ai campioni. L’amplificazione PCR in tempo reale è stata eseguita con il sistema ABI 7500 real-time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Il test PCR in tempo reale è stato eseguito su tre diverse piastre. La prima piastra è stata utilizzata per determinare l’integrità del DNA bersaglio tramite il test PCR della β-globina, amplificando un frammento target di 268 bp, come descritto precedentemente da Lum e Le Marchand nel 1998. La sequenza nucleotidica dei primer della β-globina è la seguente: Primer PCR forward β-globina: 5′-TGGGTTTCTGATAGGCACTGACT-3′. L’amplificazione PCR è stata avviata a 95 °C per dieci minuti e completata da 45 cicli di amplificazione (denaturazione a 95 °C per 15 s, ricottura a 55 °C per 45 s ed estensione a 65 °C per un minuto).
La seconda piastra è stata utilizzata per lo screening della presenza di infezione da HPV utilizzando primer MY11/GP6 dall’ORF HPV L1. Le sequenze nucleotidiche dei primer MY11/GP6 sono le seguenti: MY11 forward primer: 5′- GCM CAG GGW CAC AAY AAT GG -3′ e GP6 reverse primer: 5′- GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3′. La dimensione prevista del frammento amplificato è 185-bp. L’amplificazione PCR è stata avviata a 95 °C per dieci minuti e completata da 45 cicli di amplificazione (denaturazione a 95 °C per 15 s, annealing a 45 °C per 45 s ed estensione a 65 °C per un minuto).
La terza piastra è stata utilizzata per lo screening della presenza di infezione da HPV utilizzando primer HVP2/B5 dell’ORF di HPV L1 . Le sequenze nucleotidiche dei primer HVP2/B5 sono le seguenti: HVP2 forward primer: 5′- TCN MGN GGN CAN CCN YTN GG -3′; B5 reverse primer: 5′- AYN CCR TTR TTR TGN CCY TG -3′. La dimensione prevista del frammento amplificato è di 650 bp. L’amplificazione PCR è stata avviata a 95 °C per dieci minuti e completata da 45 cicli di amplificazione (denaturazione a 95 °C per 15 s, annealing a 50 °C per 45 s ed estensione a 65 °C per un minuto).
Spettri di fluorescenza sono stati registrati durante la fase di elongazione di ogni ciclo PCR. Il Sequence Detection Software (SDS v1.7) di ABI 7500 real-time PCR è stato utilizzato per generare la curva di amplificazione per ogni reazione. Una curva di dissociazione è stata generata dopo ogni reazione per differenziare gli ampliconi specifici da quelli non specifici. Sulla base della curva di amplificazione, tutti i campioni con amplificazione dell’HPV a partire da qualsiasi ciclo e fino al numero di ciclo 40 (con una linea di cut-off di 0,2) sono stati selezionati per l’analisi. Solo i campioni con una curva di dissociazione tra 70 °C e 80 °C e con un valore di derivazione compreso tra 0,100-0,500 sono stati considerati HPV DNA positivi.
Sanger sequencing
Il DNA dell’HPV nelle verruche è stato amplificato mediante PCR annidata prima del sequenziamento, utilizzando l’AmpliTaq Gold Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) I primer HVP2/B5 sono stati utilizzati nella prima PCR, e i primer CN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R e C4F/C4R nella seconda PCR. La prima amplificazione PCR è stata avviata a 95 °C per dieci minuti e completata da 35 cicli di amplificazione (denaturazione a 95 °C per 15 s, annealing a 50 °C per 45 s ed estensione a 68 °C per un minuto). La seconda amplificazione PCR è stata effettuata utilizzando 3 μl del primo prodotto PCR e le stesse condizioni di ciclo. I genotipi di HPV ad ampio spettro attesi da rilevare dalle verruche cutanee utilizzando i primer HVP2/B5 e CN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R e C4F/C4R comprendono i tipi di HPV dei generi alfa (HPV 2, 3, 7, 10, 27, 28, 29, 40, 43, 57, 77, 91 e 94), gamma (HPV 4, 65, 95, 48, 50, 60 e 88), mu (HPV 1 e 63), e nu (HPV 41) .
I prodotti PCR sono stati purificati utilizzando un kit di purificazione PCR (NucleoSpin Extract II PCR Purification Kit, Macherey-Nagel GmbH & Co.KG, Düren, Germania) secondo le istruzioni del produttore. Sono stati poi sottoposti a reazione di sequenziamento Sanger utilizzando BigDye terminator v3.1 mix di sequenziamento del ciclo (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), e i primer PCR annidati descritti sopra. Le purificazioni PCR post sequenziamento sono state eseguite per rimuovere i terminatori deoxy dye fluorescenti non legati utilizzando il kit di purificazione BigDye XTerminator™ (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). I campioni sono stati denaturati per 2 minuti a 95 °C e immediatamente raffreddati su ghiaccio e caricati su un analizzatore genetico ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). I campioni sono stati elettroforesi su un array capillare da 50 cm utilizzando il polimero POP 6 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) come mezzo di separazione.
I campioni sono stati analizzati utilizzando il software Sequencing Analysis v 3.7 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). L’allineamento della sequenza HPV è stato eseguito con le sequenze presentate nel database GenBank utilizzando il software BLASTn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) e il database HPV del Los Alamos Data National Laboratory Theoretical Biology and Biophysics (https://pave.niaid.nih.gov/).
Quando le sequenze ottenute erano di scarsa qualità a causa della bassa resa del prodotto di PCR, i prodotti di PCR sono stati clonati nel vettore pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI) dopo la purificazione con il kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega), e il sequenziamento degli inserti è stato eseguito utilizzando primer forward e reverse M13.
Analisi statistica
I dati della diagnosi clinica, i dati demografici e le analisi virologiche sono stati tabulati e analizzati utilizzando il software statistico SPSS ‘Statistical Package for Social Sciences, SPSS versione 25.0’ (IBM Corp, Armonk, NY, USA). Sono state calcolate le statistiche descrittive: frequenze/percentuali, misure di centro e dispersione. Per testare l’uguaglianza delle medie, il test t a due campioni è stato usato per tutte le variabili continue quando la normalità era tenuta, altrimenti è stato usato il test U di Mann Whitney. Per confrontare le medie di tre gruppi, è stata utilizzata l’analisi della varianza o il test di Kruskal-Wallis a seconda delle ipotesi soddisfatte. Il test chi-quadro di Pearson per l’indipendenza o il test esatto di Fisher sono stati utilizzati per testare le associazioni tra due variabili categoriche quando le ipotesi erano soddisfatte. Per modellare un risultato binario con una serie di covariate, è stata implementata la regressione logistica, e sono stati stimati gli odds ratio grezzi e aggiustati e i loro intervalli di confidenza al 95%. Tutti i test erano a due code e un valore P inferiore al 5% è stato considerato statisticamente significativo.