Auxotrophy
GeneticsEdit
In genetica, si dice che un ceppo è auxotrofo se porta una mutazione che lo rende incapace di sintetizzare un composto essenziale. Per esempio, un mutante di lievito con un gene inattivato della via di sintesi dell’uracile è un auxotrofo dell’uracile (per esempio, se il gene della decarbossilasi dell’orotidina 5′-fosfato è inattivato, il ceppo risultante è un auxotrofo dell’uracile). Un tale ceppo non è in grado di sintetizzare l’uracile e sarà in grado di crescere solo se l’uracile può essere assunto dall’ambiente. Questo è l’opposto di un prototrofo dell’uracile, o in questo caso un ceppo wild-type, che può ancora crescere in assenza di uracile. I marcatori genetici auxotrofi sono spesso utilizzati nella genetica molecolare; sono stati notoriamente utilizzati nel lavoro di Beadle e Tatum, vincitore del premio Nobel, sull’ipotesi un gene-un enzima, che collega le mutazioni dei geni alle mutazioni delle proteine. Questo permette poi la mappatura del percorso biosintetico o biochimico che può aiutare a determinare quale enzima o quali enzimi sono mutati e disfunzionali nei ceppi di batteri auxotrofi studiati.
I ricercatori hanno usato ceppi di E. coli auxotrofi per specifici aminoacidi per introdurre analoghi aminoacidi non naturali nelle proteine. Per esempio, le cellule auxotrofe per l’aminoacido fenilalanina possono essere coltivate in mezzi integrati con un analogo come la fenilalanina para-azido.
Molti esseri viventi, compresi gli esseri umani, sono auxotrofi per grandi classi di composti richiesti per la crescita e devono ottenere questi composti attraverso la dieta (vedi vitamina, nutriente essenziale, aminoacido essenziale, acido grasso essenziale).
Il complesso modello di evoluzione dell’auxotrofia vitaminica attraverso l’albero della vita eucariotica è intimamente connesso all’interdipendenza tra gli organismi.
Il test di mutagenicità (o test di Ames)Edit
Il test di mutagenesi della Salmonella (test di Ames) utilizza ceppi multipli di Salmonella typhimurium che sono auxotrofi all’istidina per testare se una data sostanza chimica può causare mutazioni osservando la sua proprietà auxotrofa in risposta ad un composto chimico aggiunto. La mutazione che una sostanza chimica o un composto provoca viene misurata applicandola ai batteri su una piastra contenente istidina e poi spostando i batteri su una nuova piastra senza istidina sufficiente per una crescita continua. Se la sostanza non muta il genoma dei batteri da auxotrofo a istidina a prototrofo a istidina, allora i batteri non mostrerebbero crescita sulla nuova piastra. Quindi, confrontando il rapporto tra i batteri sulla nuova piastra e la vecchia piastra e lo stesso rapporto per il gruppo di controllo, è possibile quantificare quanto sia mutagena una sostanza, o meglio, quanto sia probabile che causi mutazioni nel DNA. Una sostanza chimica è considerata positiva al test di Ames se provoca mutazioni aumentando il tasso di reversione osservato e negativa se si presenta simile al gruppo di controllo. C’è un numero normale, ma piccolo, di colonie revertenti che ci si aspetta quando un batterio auxotrofo viene piastrato su un terreno senza il metabolita di cui ha bisogno perché potrebbe mutare di nuovo in prototrofia. Le probabilità che ciò accada sono basse e quindi si formano colonie molto piccole. Se viene aggiunta una sostanza mutagena, tuttavia, il numero di revertants sarebbe visibilmente più alto che senza la sostanza mutagena. Il test di Ames, fondamentalmente, è considerato positivo se una sostanza aumenta la possibilità di mutazione nel DNA dei batteri abbastanza da causare una differenza quantificabile nei revertants della piastra mutagena e della piastra del gruppo di controllo. Il test di Ames negativo significa che il possibile mutageno non ha causato un aumento dei revertants e il test di Ames positivo significa che il possibile mutageno ha aumentato la possibilità di mutazione. Questi effetti mutageni sui batteri sono studiati come un possibile indicatore degli stessi effetti su organismi più grandi, come gli esseri umani. Si suggerisce che se una mutazione può sorgere nel DNA batterico in presenza di un mutageno, allora lo stesso effetto potrebbe verificarsi per organismi più grandi causando il cancro. Un risultato negativo del test di Ames potrebbe suggerire che la sostanza non è un mutageno e non causerebbe la formazione di tumori in organismi viventi. Tuttavia solo poche delle sostanze chimiche risultanti dal test Ames positivo sono state considerate insignificanti quando testate in organismi più grandi, ma il test Ames positivo per i batteri non potrebbe ancora essere definitivamente collegato all’espressione del cancro in organismi più grandi. Mentre può essere un possibile determinante dei tumori per gli organismi viventi, gli esseri umani, gli animali e così via, più studi devono essere completati per arrivare a una conclusione.
Metodi basati sull’auxotrofia per incorporare aminoacidi innaturali nelle proteine e nei proteomiModifica
Un gran numero di aminoacidi innaturali, che sono simili alle loro controparti canoniche per forma, dimensione e proprietà chimiche, sono introdotti nelle proteine ricombinanti per mezzo di ospiti di espressione auxotrofica. Per esempio, ceppi di Escherichia coli auxotrofi di metionina (Met) o triptofano (Trp) possono essere coltivati in un mezzo minimo definito. In questo setup sperimentale è possibile esprimere proteine ricombinanti i cui residui canonici di Trp e Met sono completamente sostituiti con diversi analoghi correlati al mezzo. Questa metodologia porta ad una nuova forma di ingegneria proteica, che non viene eseguita dalla manipolazione dei codoni a livello del DNA (per esempio la mutagenesi diretta da oligonucleotidi), ma dalla riassegnazione dei codoni a livello della traduzione della proteina sotto un’efficiente pressione selettiva. Pertanto, il metodo è denominato incorporazione a pressione selettiva (SPI).
Nessun organismo studiato finora codifica altri aminoacidi oltre ai venti canonici; due aminoacidi canonici aggiuntivi (selenocisteina, pirrolisina) sono inseriti nelle proteine ricodificando i segnali di terminazione della traduzione. Questo confine può essere superato dall’evoluzione adattativa di laboratorio di ceppi microbici auxotrofi metabolicamente stabili. Per esempio, il primo tentativo chiaramente riuscito di evolvere l’Escherichia coli che può sopravvivere solo sull’amminoacido innaturale tienopirrolina come unico sostituto del triptofano è stato fatto nel 2015.