Beta-Galattosidasi (Un migliore Miller)

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Fondo

β-La galattosidasi è codificata dal gene lacZ dell’operone lac in E. coli. È una grande proteina (120 kDa, 1024 aminoacidi) che forma un tetramero. La funzione dell’enzima nella cellula è quella di scindere il lattosio in glucosio e galattosio in modo che possano essere utilizzati come fonti di carbonio/energia. Il composto sintetico o-nitrofenil-β-D-galattoside (ONPG) è anche riconosciuto come substrato e scisso per produrre galattosio e o-nitrofenolo che ha un colore giallo. Quando l’ONPG è in eccesso rispetto all’enzima in una reazione, la produzione di o-nitrofenolo per unità di tempo è proporzionale alla concentrazione di β-Galattosidasi; quindi, la produzione di colore giallo può essere usata per determinare la concentrazione dell’enzima.

Perciò, perché ci interessa? Di solito, gli esperimenti sono progettati in modo che la concentrazione di β-Galattosidasi nella cellula sia una lettura per qualche aspetto di un sistema da studiare. Per esempio, un ricercatore può fondere un promotore al gene lacZ e usare i livelli di β-Gal come lettura dell’attività del promotore in varie condizioni. Nel 1972, Jeffrey Miller pubblicò “Experiments in Molecular Genetics” che conteneva un protocollo per determinare la quantità di β-Gal con ONPG. A causa di questo, i saggi ONPG/β-Gal sono indicati come saggi “Miller”, e una quantità standardizzata di attività β-Gal è una “Unità Miller”.

1 Unità Miller = \displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420} – (1,75*Abs_{550}))}{(t * v * Abs_{600})}

dove:

• Abs420 è l’assorbanza dell’o-nitrofenolo giallo,
• Abs550 è la dispersione dei detriti cellulari, che, moltiplicata per 1.75 approssima la dispersione osservata a 420nm,
• t = tempo di reazione in minuti,
• v = volume della coltura analizzata in millilitri,
• Abs600† riflette la densità cellulare.

Nota che questo valore è diverso per ogni spettrofotometro usato e dovrebbe essere calibrato piastrando diluizioni di colture Abs600 note per determinare le unità formanti colonie per Abs600.

Nel suo libro, il dott. Miller spiega che questa formula produce circa 1 unità Miller per E. coli non indotta (bassa produzione di β-Gal) e circa 1000 unità per una cultura completamente indotta (cresciuta su lattosio o IPTG).

Nella mia esperienza, le culture di MG1655 indotte con 1 mM IPTG in fase log hanno 1500-1800 unità Miller. La ragione della differenza non è nota, ma sospetto che derivi dalle differenze nella densità Abs600/cellula tra lo spettrofotometro del Dr. Miller e quello che uso io e dal fatto che faccio i miei saggi Miller a 30 °C (per comodità) mentre il Dr. Miller eseguiva i suoi saggi a 28 °C. Ho fatto fusioni promotore che generano ~ 40.000 unità Miller; tuttavia, come sarà discusso sotto, questo è troppo alto per il saggio e così il protocollo è stato cambiato per abbassare questo valore.

Protocollo

Il protocollo che uso è derivato da un documento di Zhang e Bremer (JBC 270, 1995, testo completo gratuito!) in cui il protocollo originale di Miller è stato notevolmente semplificato per permettere di misurare più campioni con meno manipolazione.

In breve, il protocollo consiste nel misurare la densità cellulare di una coltura di batteri (Abs600), poi rimuovere un’aliquota delle cellule dalla cuvetta e mescolarle con una soluzione di “permeabilizzazione” che contiene detergente che rompe le membrane cellulari (ma lascia intatto il β-Gal). Questo uccide le cellule e ferma la traduzione. Dopo l’incubazione, si aggiunge una soluzione di “substrato” ONPG e si lascia sviluppare il colore giallo. Una soluzione di “stop” viene poi aggiunta e l’assorbanza di o-nitrofenolo viene misurata.

1. Crescere le culture in qualsiasi condizione che si desidera testare.
2. Durante la crescita, pre-misurare 80 μL di aliquote di soluzione di permeabilizzazione in provette per microcentrifuga da 1. 5 mL e poi in un’altra.5 mL provette per microcentrifuga e chiuderle.
3. Misurare Abs600 e registrarlo!
4. Rimuovere un’aliquota di 20 μL della cultura e aggiungerla agli 80 μL di soluzione di permeabilizzazione.

Il campione è ora stabile per diverse ore. Questo ti permette di eseguire esperimenti time-course.

1. Dopo l’ultimo campione è preso, spostare i campioni e la soluzione di substrato per la stanza calda 30 ° C per 20-30 minuti.
2. Aggiungere 600 μL di soluzione di substrato per ogni tubo e NOTA IL TEMPO DI ADdizione.
3. Dopo colore sufficiente ha sviluppato, aggiungere 700 μL di soluzione di arresto, mescolare bene, e NOTA IL TEMPO STOP.
4. Dopo aver fermato l’ultimo campione (alcuni possono richiedere più tempo di altri, ma generalmente sono fatti in 30-90 minuti), trasferire le provette in una microcentrifuga e girare per 5-10 minuti alla massima velocità.
5. Rimuovere con cura le provette dalla centrifuga e trasferire la soluzione dalla parte superiore delle provette alla vostra cuvetta (s). Si sta cercando di evitare di avere materiale particolato nella cuvetta in modo che la dispersione non influenzerà la lettura.
6. Registrare Abs420. Questo dovrebbe essere inferiore a 1 e superiore a 0,05. Se è un po’ al di fuori di questo intervallo, non preoccuparti.

Calcolare le unità Miller come:

\displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420})}{((Abs_{600} \testo{ della cultura campionata})*(\testo{ volume } )*(\testo{tempo di reazione})}

Commenti sul test

• Reshma 11:28, 15 ottobre 2007 (CDT): Miller raccomanda una coltura con OD600 = da 0,28 a 0,70. Tuttavia, sostiene che possono essere usate anche colture notturne, ma che le cellule in crescita esponenziale danno saggi più precisi.

• Quando viene fatta la reazione? Non ho mai trovato una buona risposta per questo nella letteratura. Se ho lasciato che una reazione andasse a termine, ho misurato un Abs420 di ~2-3. Naturalmente, questo è fuori dalla gamma affidabile dello spettrofotometro, ma dà un’indicazione di quanto lontano la reazione può andare. Ho ottenuto dati riproducibili quando il colore giallo era appena rilevabile prima di aggiungere la soluzione di stop fino a circa il colore del brodo LB prima di fermarsi. Ricordate, avete bisogno del substrato per saturare l’enzima nel corso della reazione, quindi non lasciatelo andare troppo lontano. Io faccio abitualmente tre misurazioni separate per ogni cultura e faccio la media.
  • Reshma 11:28, 15 ottobre 2007 (CDT): Miller raccomanda che la lettura di OD420nm dovrebbe idealmente essere 0.6-0.9.

• Frequentemente, le persone usano cuvette di plastica monouso per misurare sia la torbidità della coltura che l’o-nitropenolo giallo. Per mia esperienza, le cuvette usa e getta hanno un’ottica ORRIBILE: sì, sono chiare, ma il percorso della luce è pateticamente distorto (basta guardare attraverso una di esse un oggetto lontano). Questo non è un grosso problema se la stessa cuvetta viene usata per il bianco e per il campione ed è orientata allo stesso modo nello spettrofotometro. Il problema sorge quando si misurano molti campioni diversi in diverse cuvette. I valori possono variare MOLTO anche per la stessa cultura misurata in diverse cuvette. Raccomando di usare una cuvetta di vetro o di quarzo di alta qualità, o di misurare i campioni in un lettore di piastre utilizzando piastre a fondo piatto da 96 pozzetti. Ho scoperto che il mio errore nel pipettare 150 μL di coltura per le misurazioni Abs600 era MOLTO inferiore rispetto all’utilizzo di cuvette monouso. Naturalmente, la torbidità misurata dovrebbe essere calibrata su cellule/mL come con una cuvetta da 1cm.

• Facendo girare i campioni e rimuovendo attentamente il campione dal surnatante, si evita di dover misurare la dispersione a 550nm e indovinare cosa sarebbe a 420nm.

• Se la reazione ha troppo β-Gal, il tubo diventerà giallo in pochi minuti (o addirittura secondi). Questo è troppo veloce. Uno dei maggiori contributi all’errore sarà la tua stima del tempo di reazione. Avendo le condizioni di reazione impostate in modo che ci voglia circa un’ora, gli errori di tempo diventano insignificanti. Se avete bisogno di rallentare la reazione, è possibile utilizzare meno cellule e aumentare la quantità di tampone di permeabilizzazione in modo che il volume è ancora 100 μL. In alternativa, è possibile re-ingegnerizzare il sito di legame al ribosoma del tuo costrutto β-Gal per indebolirlo. Ho scoperto che se le mie cellule stavano facendo 40.000 unità Miller di β-Gal, erano molto malate dallo stress di traduzione. Era meglio in questo caso indebolire la traduzione dell’mRNA β-Gal.
  • Faccio queste reazioni come faccio la cinetica enzimatica. Inizio i campioni a 10 secondi l’uno dall’altro (con il conteggio del tempo), quindi è possibile ottenere tempi di reazione accurati anche se si lasciano andare le reazioni solo per pochi minuti. Ottengo risultati molto riproducibili con tempi di reazione di 1,5-30 min. Una volta che si ottiene un tatto per quanto tempo le reazioni sarà necessario, è facile per raggruppare i campioni che avranno bisogno dello stesso tempo di reazione. Fare ogni campione in triplicato ti darà una certa sicurezza che i tuoi tempi siano riproducibili.–Kathleen 16:43, 14 December 2005 (EST)

• Ecco un esempio di alcuni dati reali che ho ottenuto usando questo test. Si trattava di un esperimento a tempo. In ogni momento, ho rimosso 1 mL da ciascuna delle mie culture, ho misurato la OD600, ho preso tre aliquote da 20 µL direttamente dalla cuvetta e ho aggiunto ciascuna a 80 µL di soluzione di permeabilizzazione. Ho eseguito il test esattamente come descritto sopra, e tutti i campioni sono stati tenuti a temperatura ambiente fino alla fine del percorso temporale. L’OD600 per queste culture variava da 0,4 a 4 (nel mio campione) nel corso di questo esperimento e i tempi di reazione per i saggi β-Gal variavano da 2 a 25 minuti. I tre test β-Gal individuali per ogni punto di tempo per ogni cultura (simboli rossi o neri) sono tracciati nel grafico per illustrare la riproducibilità del test all’interno di ogni esperimento.Kathleen

Ricette

Soluzione permeabilizzante

Ti servono 80 μL per campione.

• 100 mM fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4)
  • (Il protocollo Zhang ha 200 mM di fosfato di sodio. Non ho mai potuto ottenere questo in soluzione con gli altri componenti, non importa quello che ho provato così ho fatto marcia indietro a 100 mM. Ho anche usato 50 mM senza alcun cambiamento rilevabile.)
• 20 mM KCl
• 2 mM MgSO4
• 0,8 mg/mL CTAB (esadeciltrimetilammonio bromuro)
• 0.4 mg/mL deossicolato di sodio
• 5,4 μL/mL beta-mercaptoetanolo

Soluzione di substrato

Sono necessari 600 μL per campione.

• 60 mM Na2HPO4
• 40 mM NaH2PO4
• 1 mg/mL o-nitrofenil-β-D-Galattoside (ONPG)
• 2.7 μL/mL β-mercaptoetanolo

(Il protocollo Zhang ha anche 20 μg/mL CTAB e 10 μg/mL deoxycholate. Lascio questi fuori immaginando che c’è ancora molto dalla soluzione di permeabilizzazione e, se non sono ancora morti, non saranno.)

Soluzione di stop

Hai bisogno di 700 μL per campione.

• 1 M carbonato di sodio (Na2CO3)

L’alto pH della soluzione di stop denatura il β-Gal e raddoppia approssimativamente il colore giallo della reazione.