BiomedicalReports

Introduzione

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è un tumore primario degli epatociti, che rappresenta l’80% di tutti i tumori primari del fegato. A livello globale, HCC è classificato come la quarta causa principale di mortalità legata al cancro (1). I pazienti con malattie croniche del fegato associate a epatite Bvirus o infezioni da virus dell’epatite C sviluppano frequentemente HCC (2). C’è stato un miglioramento delle tecniche chirurgiche e lo sviluppo di diverse modalità di trattamento non chirurgico; tuttavia, il miglioramento per la prognosi estremamente povera dei pazienti HCC rimane limitato (3).

Extensive indagini di apoptosi, noto anche come morte cellulare programmata, negli ultimi decenni ha evidenziato questo processo come un metodo adatto per la terapia del cancro (4,5). Tuttavia, numerosi farmaci con effetti apoptotici sono attualmente limitati per la terapia del cancro a causa degli effetti collaterali. Pertanto, l’identificazione di agenti terapeutici nuovi e affidabili che possono efficacemente indurre l’apoptosi delle cellule tumorali nel trattamento dei pazienti con HCC è importante.

Di recente, la medicina tradizionale cinese ha un ruolo importante nel trattamento dei tumori maligni grazie ai suoi effetti significativamente migliorati e ai minori effetti collaterali (6). Il geco, una delle popolari medicine tradizionali cinesi, è stato usato come un farmaco grezzo per trattare i tumori maligni nella pratica clinica (7-9). I crudepeptidi di Gecko e l’estratto etanolico di Gecko possono indurre l’apoptosi nelle cellule HCC umane ed esercitare un’attività antitumorale nei topi portatori di ascite H22, come dimostrato nei nostri studi precedenti (10,11). Lo scopo del presente studio è stato quello di esaminare l’effetto apoptotico e il meccanismo sottostante della miscela di peptidi di geco (GPM) nel carcinoma epatico umano HepG2 in vitro.

Materiali e metodi

Materiali medici e reagenti

Gecko japonicus è stato acquistato da BozhouYonggang Medicinal Herbs Factory Co. Ltd. (Anhui, Cina). La linea cellulare HCC umana HepG2 è stata presentata dal Medical Science ResearchInstitute di Henan (Henan, Cina).

Bromuro di metiltiazolildifenil-tetrazolio (MTT) e Hoechst 33258 sono stati acquistati da Sigma (St. Louis, MΟ, USA).Il kit per il test di attività della caspasi è stato acquistato dal BeyotimeInstitute of Biotechnology (Beijing, Cina). L’anticorpo primario contro il fattore induttore di apoptosi (AIF) è stato acquistato dalla BosterInc. (Wuhan, Hubei, Cina), e l’anticorpo β-actina è stato acquistato da Proteintech (Wuhan, Hubei, Cina). L’anticorpo primario contro il citocromo c (Cyt c) e l’anticorpo secondario coniugato al topo o al coniglio sono stati acquistati da Zhongshan GoldenBridge Biotechnology Co. Ltd. (Pechino, Cina).

Il lettore di micropiastre era il prodotto di BioTekInstruments, Inc. (Winooski, VT, USA). I microscopi BX41 a fluorescenza e invertiti erano il prodotto di Olympus (Tokyo, Giappone).

Preparazione del GPM

Le polveri di geco (100 g) sono state mescolate con 400 m di acqua bidistillata e trasformate in un omogeneizzato. Dopo la centrifugazione a 5.600 × g per 5 minuti, la precipitazione è stata raccolta e immersa in 400 ml di soluzione di etanolo al 55%. Il surnatante è stato ottenuto dopo la centrifugazione a 5.600 × g per 5 min, ed è stato evaporato a pressione ridotta a 55°C. Successivamente, le polveri gialle sono state raccolte dopo la liofilizzazione del liquido residuo. La cromatografia per filtrazione su gel (SephadexG-25) è stata utilizzata per purificare le polveri gialle e, infine, è stato raccolto il GPM.

Cultura cellulare e osservazione morfologica

Le cellule HepG2 sono state coltivate in un terreno Dulbecco’s modifiedEagle’s medium integrato con 10% di siero fetale bovino, 100 U/mlpenicillina e streptomicina a 37°C in un incubatore umidificato al 5% di CO2. Il mezzo di coltura è stato sostituito ogni 2 giorni e le cellule in fase di crescita logaritmica sono state utilizzate per i seguenti esperimenti. Le cellule HepG2 (3.0×104cellule/ml) sono state incubate con varie concentrazioni di GPM per 24 ore. Le cellule sono state osservate e le immagini catturate da un microscopio a contrasto di fase invertito per rilevare i cambiamenti morfologici.

Saggio MTT

Le cellule HepG2 sono state seminate in una piastra da 96 pozzetti ad una densità di 6.0×103 cellule/pozzetto. Ad ogni pozzetto sono state aggiunte diverse concentrazioni di GPM e 0,003 mg/ml di fluorouracile (5-Fu). Dopo l’incubazione per 20, 44 e 68 ore, rispettivamente, sono stati aggiunti 20 µl di reagente MTT (5 mg/l) per pozzetto e incubati per altre 4 ore. Il surnatante è stato sostituito da 200 µl di dimetilsolfossido e l’assorbanza (A) a 490 nm è stata misurata con un lettore ELX800 UniversalMicroplate. Il tasso di inibizione della proliferazione cellulare (IR) era il seguente: IR = (1-AGPM/Acontrollo) ×100%.

Macchiatura di Hoechst 33258

Dopo la coltura notturna in una piastra a 6 pozzetti, le cellule HepG2 sono state trattate con varie concentrazioni di GPM (0,0,06 o 0.08 mg/ml) e 0,003 mg/ml di 5-Fu in terreno di coltura fresco a 37°C per 24 ore. Le cellule sono state lavate due volte con fosfato-bufferedsalina (PBS) e colorate con la soluzione colorante Hoechst 33258 (10µg/ml). Dopo 15 minuti di incubazione al buio, le cellule sono state lavate due volte con PBS freddo e sono state esaminate con il microscopio a fluorescenza.

Analisi dell’attività della caspasi

La determinazione dell’attività della caspasi-3 e della caspasi-9 è stata eseguita con il kit di analisi dell’attività della caspasi, seguendo il protocollo del produttore. Dopo l’esposizione a diverse concentrazioni di GPM (0, 0,06 o 0,08 mg/ml) e 0,003 mg/ml 5-Fu per 24 ore, le cellule sono state raccolte e risospese in tampone di lisi. Successivamente, le cellule sono state incubate nel tampone di lisi per 20 minuti e sono state centrifugate a 16.000 × g a 4°C per 3 minuti. I surnatanti sono stati raccolti e i livelli di proteine sono stati determinati con il metodo Bradford, e le attività della caspasi-3 e della caspasi-9 sono state misurate con il tampone di reazione (contenente ditiotreitolo) e i substrati di caspasi Ac-DEVD-pNA e Ac-LEHD-pNA, rispettivamente. I valori ottenuti alla densità ottica a 405 nm sono stati espressi come:AGPM/AControl.

Analisi western blot

Le cellule HepG2 sono state trattate con GPM (0, 0,06 o 0,08mg/ml) e 0,003 mg/ml 5-Fu per 24 h, rispettivamente. Brevemente, le cellule sono state trattate con tampone di lisi in ghiaccio per 30 min, e sono state centrifugate a 13.000 × g per 30 min a 4°C. La concentrazione di proteine è stata determinata con il metodo Bradford. La membrana PVDF è stata bloccata con il 5% di latte secco non grasso in PBS per 1 ora a 37°C, lavata 3 volte con Tris-buffered saline contenente 0.1%Tween-20 (TBST) per 15 min, ed è stata seguita dall’incubazione con gli anticorpi primari: Caspase-3 (cat. no. sc-7148; 1:200, policlonale di coniglio anti-umano), caspase-9 (cat. no. sc-8355; 1:200, policlonale di coniglio anti-umano), Cyt c (cat. no. sc-13156; 1:500, monoclonale di topo anti-umano), AIF (cat. no. PB0388; 1:200, policlonale di coniglio anti-umano) e β-actina (cat. no. 66009-1-Ig;1:5,000, monoclonale di topo anti-umano) durante la notte a 4°C.Successivamente, i campioni sono stati lavati con TBST per 30 minuti, e la membrana è stata incubata con i corrispondenti anticorpi secondari per 1 ora. La chemiluminescenza è stata rilevata con ECL Plus (Beyotime Institute of Biotechnology).

Analisi statistica

I dati sperimentali sono rappresentati come media ± deviazione standard. Le differenze tra i gruppi sono state esaminate con l’analisi della varianza a una via utilizzando il sistema SPSS 19.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA). P<0.05 è stato considerato per indicare una differenza statisticamente significativa.

Risultati

GPM inibisce la proliferazione delle cellule HepG2

L’effetto di GPM sulla crescita delle cellule HepG2 è stato valutato dal test MTT. I risultati hanno mostrato che GPM ha inibito significativamente la proliferazione delle cellule HepG2 in modo dose e tempo-dipendente (Fig. 1). Dopo il trattamento con GPM per 24, 48 o 72 ore, i valori di IC50 erano 0,154, 0,133 e 0,051 mg/ml, rispettivamente. Le cellule trattate con GPM hanno esibito una morfologia arrotondata, perdita di restringimento e di attaccamento (Fig. 2).

Effetti di GPM sulla morfologia nucleare

La morfologia apoptotica delle cellule è stata identificata dalla colorazione Hoechst 33258. Come mostrato in Fig. 3, i cambiamenti morfologici nelle caratteristiche apoptotiche, come la condensazione nucleare, la condensazione cromosomica e i corpi granulari apoptotici nelle cellule trattate con GPM sono stati osservati anche con la microscopia a fluorescenza.

Effetti del GPM sulla caspasiattività

Come iniziatori ed esecutori della morte cellulare, le proteasi cisteiniche hanno un ruolo importante nel processo apoptotico (12). Come mostrato in Fig. 4, il trattamento con GPM ha causato un aumento significativo dose-dipendente dell’attività della caspasi-3 e della caspasi-9, suggerendo un effetto apoptotico di GPM nelle cellule HepG2.

Effetti di GPM sui livelli di espressione delle proteine apoptotiche

Come mostrato in Fig. 5, western blotting ha dimostrato che il rilascio di Cyt c e AIF dai mitocondri al citosol è aumentato, mentre i livelli di espressione di caspasi-3 e caspasi-9 sono stati upregolati dal trattamento con GPM in modo dose-dipendente. I cambiamenti nelle proteine erano significativamente diversi rispetto al gruppo di controllo (Fig. 6) (P<0.05).

Discussione

Negli ultimi decenni, l’incidenza del cancro è aumentata notevolmente, che causa gravi danni alla salute umana(13). Anche se le strategie terapeutiche contemporanee hanno mostrato un’evidente capacità anticancro, gravi effetti collaterali rimangono inevitabili. La ricerca di nuovi agenti antitumorali che siano più efficaci ma meno tossici ha attirato una crescente attenzione (14). L’estrazione di peptidi da medicine naturali per la terapia del cancro è stata ampiamente riportata in tutto il mondo ed è promettente nel trattamento del cancro. I peptidi potrebbero avere un ruolo in vari modi, come l’inibizione della proliferazione dei tumori, l’arresto del ciclo cellulare, la soppressione dell’angiogenesi tumorale e l’induzione dell’apoptosi (15). Il geco è stato ampiamente utilizzato nella medicina tradizionale cinese per centinaia di anni. Nei nostri studi precedenti, i peptidi grezzi di geco hanno mostrato un’efficace attività antitumorale sui topi portatori di H22 e sulla linea cellulare HepG2 (16,17), ma gli effetti del GPM sugli epatociti umani devono ancora essere chiariti. Pertanto, lo scopo del presente studio è stato quello di rivelare ulteriormente il meccanismo molecolare sottostante attraverso il quale GPM induce l’apoptosi nella linea cellulare umana HCC HepG2.

Nel presente studio, il test MTT ha rivelato che GPM potrebbe inibire la crescita delle cellule HepG2 in modo dose e tempo-dipendente. Ulteriori esperimenti hanno dimostrato che questa inibizione era dovuta al trattamento con GPM, che ha indotto una morte cellulare dose-dipendente con tipici cambiamenti morfologici. Utilizzando Hoechst 33258 colorazione, è stato dimostrato che la morte cellulare indotta da GPM in cellule HepG2, che appartiene all’apoptosi, per la caspasi-3 e caspasi-9 livelli di espressione è stato aumentato a seguito di trattamento GPM. L’analisi Western blotting ha anche mostrato che il GPM potrebbe stimolare il rilascio di Cyt c e AIF dagli itocondri nel citosol, suggerendo che l’apoptosi indotta dal GPM nelle cellule HepG2 è mediata dalla via apoptotica mitocondriale.

L’apoptosi è il principale meccanismo di controllo con cui le cellule muoiono in numerose condizioni, come la riparazione errata dei danni al DNA (18). Questo processo cellulare autodistruttivo è fondamentale per lo sviluppo degli organi, il rimodellamento dei tessuti, la regolazione immunitaria e diverse condizioni di malattia (19). Numerosi agenti antitumorali esercitano i loro effetti terapeutici inducendo l’apoptosi (20-24). I mitocondri hanno un ruolo essenziale nella regolazione dell’apoptosi cellulare, e ci sono alcune proteine che sono strettamente associate all’apoptosi cellulare nell’intermembrana (25).

L’ultrastruttura mitocondriale è normale durante l’apoptosi cellulare, ma la sua funzione è significativamente cambiata.La disfunzione mitocondriale induce l’apertura dei pori di transizione della permeabilità mitocondriale e libera proteine apoptogene mitocondriali, come AIF (26) e Cyt c (27). Normalmente, le proteine AIF e Cyt c si trovano nello spazio intermembrana dei mitocondri, mentre sotto l’azione di vari AIF, vengono rilasciate dagli itocondri al citoplasma. L’AIF viene infine trasferito al nucleo, causando i cambiamenti caratteristici dell’apoptosi. L’AIF è stata la prima proteina scoperta a mediare la morte cellulare indipendente dalla caspasi (28). Il Cyt c viene rilasciato nel citosol e induce l’apoptosi caspasi-dipendente, portando all’attivazione delle caspasi e all’apoptosi (29,30). L’AIF potrebbe aumentare i segnali apoptotici promuovendo il rilascio mitocondriale di Cyt c. Anche se l’apoptosi indotta dall’AIF non dipende dalla caspasi, esiste un’azione incrociata, una sinergia e persino un antagonismo tra AIF, caspasi e Cyt c. A causa di vari segnali di morte e tipi di cellule, la regolazione dell’apoptosi cellulare è effettivamente realizzata attraverso varie interazioni e l’intera rete di segnali, che richiedono ulteriori studi.

La caspasi, una famiglia di proteasi cisteina, è una sezione integrale della via apoptotica. L’induzione dell’apoptosi è associata all’attivazione della caspasi (31). La caspasi-3 è a valle dell’apoptosi cellulare, e la caspasi-9 è la caspasi apicale nella via dell’apoptosi iniziata dagli itocondri (32). L’attivazione della caspasi-3 è correlata all’attivazione della caspasi-9 (33). Il rilascio di Cyt c innesca l’attivazione della caspasi-9 attraverso la formazione dell’apoptosoma. La successiva attivazione dell’iniziatore caspasi-9 causa la scissione dell’effettore caspasi-3, che successivamente attiva la DNasi e causa la frammentazione del DNA nel nucleo (34). In sintesi, la caspasi-3 è una caspasi esecutrice che può essere attivata dal seguente percorso mitocondriale che coinvolge l’attivazione della caspasi-9 a causa del rilascio di Cyt c nel citosol (35), causando infine la morte cellulare programmata. Questi risultati dimostrano che il GPM può essere un potenziale agente terapeutico per il trattamento dell’HCC.

Riconoscimenti

Il presente studio è stato sostenuto da una sovvenzione dei programmi chiave per lo sviluppo scientifico e tecnologico della provincia di Henan (n. 142102310031).

Glossario

Abbreviazioni

Abbreviazioni:

GPM	miscela di peptidi del geco
Cyt c	citocromo c

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