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Effetti cellulari
I polifenoli del mirtillo sono potenti antiossidanti intracellulari ad una bassa concentrazione (<1µg/l) in varie cellule di mammiferi (Bornsek et al., 2012). È probabile che, al di là di un’attività diretta di scavenging, i polifenoli del mirtillo migliorino gli antiossidanti endogeni (Bornsek et al., 2012). Nei neuroni, un aumento della quantità di glutatione e di acido ascorbico (Papandreou et al., 2009) così come un aumento dell’attività degli enzimi antiossidanti come la catalasi e la superossido dismutasi sono stati osservati (Vuong et al., 2010) come conseguenze dell’esposizione al mirtillo. L’attività antiossidante degli estratti di mirtillo è anche associata a una riduzione della produzione di ROS (Jeong et al., 2013) e una conseguente riduzione dei loro effetti, compresa la perossidazione lipidica (Papandreou et al., 2009). Come menzionato, la β-amiloide è una proteina aberrante coinvolta nella neurodegenerazione. La soppressione dello stress ossidativo da parte dei polifenoli del mirtillo contrasta l’effetto citotossico della β-amiloide nei topi (Jeong et al., 2013). Gli estratti di mirtillo esercitano effetti neuroprotettivi contro la neurotossicità della β-amiloide in colture di cellule ippocampali di ratti, con un tasso inferiore di perdita neuronale (Brewer et al., 2010). La tossicità della β-amiloide aumenta con l’età ed è elevata nella malattia di Alzheimer. L’effetto anticitotossico dei polifenoli del mirtillo in risposta alla β-amiloide si basa sul ripristino di una normale risposta cellulare allo stress che coinvolge, a sua volta, la produzione di proteine, come la chinasi fosforilata regolata extracellulare (pERK) e la proteina fosforilata legata all’elemento di risposta ciclico-AMP (pCREB), che sono sovraespresse sotto la stimolazione della β-amiloide in vitro (Brewer et al., 2010). Gli estratti di mirtillo invertono la diminuzione indotta dalla β-amiloide del glutatione intracellulare inducendo un aumento transitorio dei ROS, che risulta in un aumento finale della sintesi del glutatione (Brewer et al., 2010), un meccanismo noto come ormesi. I polifenoli del mirtillo ripristinano la disponibilità di ATP e l’attività sinaptica nelle cellule ippocampali, entrambe ridotte dalla β-amiloide (Fuentealba et al., 2011). I flavonoidi del mirtillo possono anche modificare la disponibilità di β-amiloide in due modi. Inibiscono l’espressione della β-secretasi, l’enzima limitante coinvolto nella produzione di peptidi β-amiloidi, e questo avviene attraverso la riduzione mediata dal mirtillo della segnalazione del fattore nucleare kappa B (NF-κB) (Paris et al., 2011). I polifenoli del mirtillo migliorano la clearance microgliale di β-amiloide, inibiscono la sua aggregazione in grovigli neurofibrillari (Fuentealba et al., 2011; Zhu et al, 2008), e sopprimere l’attivazione microgliale nei topi, effetti mediati dalla soppressione del p44/42 mitogen-activated protein kinase (MAPK) segnalazione (Zhu et al., 2008).
Antociani mirtillo anche svolgere un ruolo chiave contro la neurodegenerazione in materia di infiammazione. Come accennato, le cellule microgliali sono attivate dallo stress ossidativo rilasciando citochine proinfiammatorie e ulteriori ROS, che amplificano i danni e inducono una risposta neuronale. Diversi modelli sperimentali sono stati utilizzati per studiare la neuroinfiammazione. Il lipopolisaccaride (LPS) è un potente induttore di infiammazione. Le cellule microgliali attivate da LPS e pretrattate con antociani di mirtillo riducono la produzione di citochine proinfiammatorie, come TNF-α, interleuchina 1 β (IL-1β), e ROS (NO), e riducono l’espressione di enzimi coinvolti nell’infiammazione, per esempio, NO sintetasi (NOS) e cicloossigenasi (COX) (Carey et al., 2013; Lau et al., 2007). È stato dimostrato che ciò avviene attraverso la soppressione dell’attivazione di NF-κB (Lau et al., 2009) e la diminuzione dei suoi livelli (Goyarzu et al., 2004), entrambi causati dagli antociani del mirtillo. (NF-κB) è un fattore di trascrizione coinvolto nella sintesi di diversi mediatori dell’infiammazione. Lo stato di attivazione delle cellule microgliali viene quindi soppresso dalle antocianine di mirtillo, come dimostrato dalla riduzione dei marcatori di attivazioni (ad esempio, perossiredoxine; Miah et al., 2013). I neuroni possono rispondere a LPS anche aumentando lo stress ossidativo e l’infiammazione. Gli estratti di mirtillo hanno almeno tre effetti positivi sui neuroni stimolati da LPS: riduzione dello stress ossidativo, miglioramento dell’omeostasi del calcio e aumento della vitalità cellulare (Joseph et al., 2010b). La vitalità cellulare è dovuta all’ormesi (Joseph et al., 2010b), un temporaneo aumento dello stress ossidativo che attiva l’espressione genica volta a migliorare la sopravvivenza cellulare. Le antocianine del mirtillo migliorano anche la neuroprotezione mediata dalla proteina 70 dello shock termico (HSP 70) nei neuroni ippocampali stimolati da LPS (Galli et al., 2006). Un altro induttore di infiammazione è l’acido kainico; i polifenoli del mirtillo contrastano la produzione di citochine (NF-κB)-dipendenti e attivano fattori di crescita come l’insulin-like growth factor 1 (IGF-1; Shukitt-Hale et al., 2008). È possibile che le antocianine contenute nei mirtilli abbiano insieme effetti sinergici nella neuroprotezione, perché i loro effetti sono più importanti in presenza di estratti non frazionati (Carey et al., 2013; Joseph et al, 2010b).
I polifenoli del mirtillo esercitano una potente attività neuroprotettiva contro l’eccitotossicità glutammatergica, come dimostrato nei neuroni di ratto; le colture esposte al glutammato e agli estratti di frutti e foglie di mirtillo hanno mostrato segni di degenerazione significativamente inferiori al basale (Vyas et al., 2013).
Come detto, l’invecchiamento diminuisce la sensibilità a diversi neurotrasmettitori. Tra questi, il sistema colinergico ha particolare importanza perché mostra un’elevata sensibilità all’invecchiamento, e la sua funzione influenza le prestazioni cognitive. L’invecchiamento riduce la sensibilità all’acetilcolina come conseguenza dello stress ossidativo; induce una perdita funzionale dei recettori muscarinici striatali con recettori residui che diventano più sensibili allo stress ossidativo nel tempo (Joseph et al., 2006). Gli estratti di mirtillo possono ripristinare una normale sensibilità all’acetilcolina, migliorando la segnalazione dello stress ossidativo molecolare e l’omeostasi del calcio alla base della ridotta risposta dei recettori (Joseph et al., 2006; 2010a). Inoltre, i polifenoli del mirtillo migliorano la funzione colinergica attraverso l’inibizione dell’attività dell’acetilcolinesterasi (Papandreou et al., 2009).
Altri meccanismi di miglioramento delle prestazioni cognitive dai polifenoli del mirtillo coinvolgono la plasticità sinaptica, la memoria e il miglioramento della sopravvivenza cellulare. È stato osservato che l’integrazione di mirtillo migliora la funzionalità del potenziamento a lungo termine (LTP) nei ratti anziani, ripristinando il livello osservato nei ratti giovani; questo avviene attraverso la prevenzione del declino della forza sinaptica, e questo a sua volta compensa la ridotta espressione dei recettori del glutammato coinvolti nel LTP (Coultrap et al., 2008). L’integrazione di mirtillo aumenta altri parametri legati al miglioramento della memoria, come la neurogenesi ippocampale, l’attivazione ERK e i livelli di IGF-1 (Casadesus et al., 2004). Gli effetti benefici del mirtillo sulla neurogenesi ippocampale coinvolgono anche i cambiamenti nell’omeostasi del calcio e nella segnalazione dello stress legati all’espressione genica dipendente dalla pCREB, dalla protein kinase C γ (PKC γ) e dalla pMAPK (Joseph et al., 2007). Questi cambiamenti molecolari comprendono anche un aumento dei livelli ippocampali di fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) e sono correlati alle prestazioni di memoria dei ratti (Rendeiro et al., 2012). L’aumento di BDNF implica una sintesi proteica sostenuta dalla via ERK-CREB-BDNF nei neuroni ippocampali (Williams et al., 2008). La neurogenesi ippocampale e le relative prestazioni di memoria sono sensibili agli effetti dello stress ossidativo. Lo stress ossidativo upregola i geni legati all’apoptosi, compresi i geni legati a (NF-κB), e downregola i geni legati alla sopravvivenza cellulare nell’ippocampo (Shukitt-Hale et al., 2012). Nel cervello dei ratti integrati con mirtillo, i geni che promuovono la sopravvivenza cellulare sono stati trovati upregolati (Shukitt-Hale et al., 2012). Inoltre, nelle colture neuronali, una forma di succo di mirtillo modificato ha dimostrato di aumentare gli enzimi che proteggono dallo stress ossidativo, promuovere la sopravvivenza cellulare e inibire l’apoptosi attraverso meccanismi molecolari che coinvolgono l’espressione genica (ad esempio, MAPK per la sopravvivenza e ERK per l’inibizione dell’apoptosi; Vuong et al., 2010).
I meccanismi di neuroprotezione mediati dal mirtillo sono anche dimostrati in alcuni modelli sperimentali di patologia, per esempio, la malattia ischemica del cervello. I ratti integrati con mirtilli per sei settimane che hanno subito un ictus indotto dalla legatura dell’arteria carotide comune sinistra e in seguito all’ipossia hanno avuto una perdita neuronale media del 17% nell’ippocampo sinistro; i ratti di controllo in confronto avevano una perdita del 40% nella stessa area (Sweeney et al., 2002). Allo stesso modo, una dieta arricchita di mirtilli per quattro settimane è stata responsabile di una diminuzione significativa rispetto ai controlli del volume del danno da ischemia-riperfusione nella corteccia dei ratti che hanno subito una legatura dell’arteria cerebrale medio-destra, nonché di una ridotta attività apoptotica (bassi livelli di caspasi; Wang et al., 2005). Un altro studio (Shin et al., 2006) conferma questi risultati nello stesso modello e aggiunge che le antocianine esercitano una soppressione dell’apoptosi bloccando le vie di segnalazione c-Jun N-terminal kinase (JNK) e p53, perché la loro espressione è stata trovata significativamente più bassa nelle aree sia di infarto che di penombra ischemica. Secondo quanto discusso finora, è possibile che la neuroprotezione da mirtillo nei neuroni ischemici coinvolga l’inibizione dell’eccitotossicità, lo stress ossidativo, l’infiammazione e la compromissione dell’omeostasi ionica oltre all’apoptosi (Shin et al., 2006). Questi meccanismi di neuroprotezione possono essere interconnessi e integrati per migliorare la sopravvivenza delle cellule (vedi Tabella 2.1). Gli effetti neuroprotettivi delle antocianine del mirtillo sono stati dimostrati anche nella retina, riducendo i danni indotti dalla luce a livello strutturale e funzionale (Liu et al., 2012; Tremblay et al., 2013). Gli effetti dei polifenoli del mirtillo legati all’espressione genica e ai meccanismi antiossidanti potrebbero anche spiegare l’aumento della durata della vita degli animali con una dieta integrata con mirtillo (Peng et al., 2012; Wilson et al., 2006).