Brainbow
Le tecniche Brainbow si basano sulla ricombinazione Cre-Lox, in cui la proteina Cre ricombinasi guida l’inversione o l’escissione del DNA tra siti loxP. Il metodo originale Brainbow comprende sia Brainbow-1 che Brainbow-2, che utilizzano diverse forme di ricombinazione Cre-Lox. Brainbow-3, una versione modificata di Brainbow-1, è stato sviluppato nel 2013. Per tutti i sottotipi di Brainbow, l’espressione di un dato XFP è un evento stocastico, o casuale.
Brainbow-1 utilizza costrutti di DNA con diversi geni di proteine fluorescenti (XFP) separati da forme mutanti e canoniche di loxP. Questo crea una serie di possibilità di escissione reciprocamente esclusive, poiché la ricombinazione mediata da cre avviene solo tra siti loxP identici. Dopo la ricombinazione, la proteina fluorescente che rimane direttamente dopo il promotore è espressa in modo univoco. Così, un costrutto con quattro XFP separati da tre diversi siti loxP, tre eventi di escissione e il costrutto originale può produrre quattro diverse proteine fluorescenti.
Brainbow-2 usa l’escissione e l’inversione Cre per permettere molteplici possibilità di espressione in un dato costrutto. In un segmento di DNA con due XFP orientate in modo opposto, Cre induce un evento di inversione casuale che lascia una proteina fluorescente nell’orientamento corretto per l’espressione. Se due di queste sequenze invertibili sono allineate, sono possibili tre diversi eventi di inversione. Quando si considerano anche gli eventi di escissione, una delle quattro proteine fluorescenti sarà espressa per una data combinazione di escissioni e inversioni Cre.
Brainbow-3 mantiene il formato loxP di Brainbow-1, ma sostituisce i geni RFP, YFP e CFP con mOrange2, EGFP e mKate2. mO2, EGFP e mK2 sono stati scelti sia perché i loro spettri di eccitazione ed emissione fluorescenti si sovrappongono minimamente, sia perché condividono una minima omologia di sequenza, permettendo la progettazione di anticorpi selettivi che possono essere usati per rilevarli in protocolli immunoistochimici. Brainbow-3 affronta anche il problema del riempimento irregolare dei neuroni con gli XFP usando derivati farnesilati degli XFP, che sono più uniformemente trafficati nelle membrane neuronali.
Brainbow è implementato in vivo incrociando due ceppi di organismi transgenici: uno che esprime la proteina Cre e un altro che è stato trasfettato con diverse versioni di un costrutto loxP/XFP. L’uso di più copie del transgene permette agli XFP di combinarsi in un modo che può dare uno dei circa 100 colori diversi. Così, ogni neurone è etichettato con una tonalità diversa in base alla sua data espressione combinatoria e stocastica di proteine fluorescenti.
Per chiarire i modelli di espressione XFP differenziali in una forma visibile, le fette di cervello sono imaged con microscopia confocale. Quando esposto a un fotone con la sua particolare lunghezza d’onda di eccitazione, ogni fluoroforo emette un segnale che viene raccolto in un canale rosso, verde o blu, e la combinazione di luce risultante viene analizzata con un software di analisi dei dati. La sovrapposizione di neuroni colorati in modo diverso permette il disinserimento visivo di complicati circuiti neurali.
Brainbow è stato testato prevalentemente nei topi fino ad oggi; tuttavia, la tecnica di base descritta sopra è stata anche modificata per l’uso in studi più recenti dall’avvento del metodo originale introdotto nel 2007.
MiceEdit
Il cervello di topo ha 75.000.000 di neuroni ed è più simile a un cervello umano rispetto alla drosofila e ad altri organismi comunemente usati per modellare questa tecnica, come C. elegans. I topi sono stati i primi organismi in cui il metodo Brainbow di neuroimaging è stato impiegato con successo. Livet et al. (2007) hanno sviluppato due versioni di topi Brainbow usando Brainbow-1 e Brainbow-2, che sono descritti sopra. Nell’utilizzo di questi metodi per creare una mappa completa e tracciare gli assoni di un muscolo di topo, è necessario raccogliere decine di migliaia di immagini e compilarle in pile per creare uno schema completo. È quindi possibile tracciare ogni assone motore e i suoi contatti sinaptici per costruire un connettoma completo del muscolo.
Altri esempi di neuroni esaminati utilizzando la tecnica Brainbow nei topi transgenici si trovano nel nervo motore che innerva i muscoli dell’orecchio, i tratti di assone nel tronco cerebrale e il giro dentato ippocampale.
DrosophilaEdit
La complessità del cervello di Drosophila, composto da circa 100.000 neuroni, lo rende un candidato eccellente per l’implementazione di tecniche di neurofisiologia e neuroscienze come Brainbow. Infatti, Stefanie Hampel et al. (2011) hanno combinato Brainbow in combinazione con strumenti di targeting genetico per identificare i singoli neuroni all’interno del cervello di Drosophila e vari lineage neuronali. Uno degli strumenti di targeting genetico era un sistema di espressione binaria GAL4/UAS che controlla l’espressione di UAS-Brainbow e mira l’espressione a piccoli gruppi di neuroni. L’utilizzo di metodi “Flip Out” ha aumentato la risoluzione cellulare del costrutto reporter. L’espressione delle proteine fluorescenti, come con l’originale Brainbow, dipendeva dalla ricombinazione Cre corrispondente ai siti lox abbinati. Hampel et al. (2011) hanno anche sviluppato una loro variazione di Brainbow (dBrainbow), basata sull’etichettatura anticorpale di epitopi piuttosto che sulla fluorescenza endogena. Due copie del loro costrutto producono sei colori brillanti e separabili. Questo, insieme alle semplificazioni nell’assegnazione dei colori, ha permesso loro di osservare le traiettorie di ogni neurone su lunghe distanze. In particolare, hanno tracciato i motoneuroni dal lobo antennale alle giunzioni neuromuscolari, permettendo loro di identificare gli obiettivi muscolari specifici dei singoli neuroni.
In definitiva, questa tecnica fornisce la capacità di mappare efficacemente i circuiti neuronali in Drosophila in modo che i ricercatori siano in grado di scoprire più informazioni sulla struttura del cervello di questo invertebrato e come si relaziona al suo comportamento conseguente.