Comprendere la base strutturale della restrizione dell’HIV-1 da parte del doppio dominio APOBEC3G a lunghezza intera

.dominio APOBEC3G

Caratteristiche strutturali complessive del fl rA3G

Un grande ostacolo negli studi strutturali delle proteine APOBEC a doppio dominio fl è stata la scarsa solubilità – le forme di tipo selvaggio sono spesso purificate come oligomeri non omogenei o grandi aggregati ad alta concentrazione. Al fine di ottenere fl A3G ben educato per la determinazione strutturale, abbiamo esaminato gli omologhi A3G da diverse specie di primati e abbiamo scoperto che A3G dalla scimmia rhesus (rA3G) aveva una migliore solubilità. Due costrutti mutazionali fl rA3G (denominati FKL e E / Q) hanno prodotto proteine ben educati e cristalli in diverse condizioni (Tabella supplementare 1) che diffrangevano a 2,47 e 2,40 Å, rispettivamente, (Tabelle supplementari 1 e 2, Fig. supplementare 1). Ulteriori modifiche in questi due costrutti migliorato la solubilità e la resa di rA3G compresa la sostituzione di un 8-residue CD1 loop 8 dal 4-residue loop 8 da hA3G-CD2 (come in entrambi E / Q e FLK costrutti, Tabella supplementare 1, Fig. 1), ulteriori mutazioni F126Y su CD1 loop 7, K180S/L184S su CD1 h6, e delezione 8-residue del CD2 loop 3 (come nel costrutto FKL, Tabella supplementare 1, Fig. supplementare 1B). Va notato che K128 di rA3G che agisce come barriera per la trasmissione cross-specie è mutato in un residuo di acido aspartico (D128) come in A3G umano (hA3G) 36. I costrutti contengono anche catalitico E259 a Q / A mutazione per evitare la potenziale tossicità durante l’espressione della proteina ricombinante. I residui mutati e le loro posizioni sulla struttura sono mostrati nella Fig. 1B supplementare. In entrambe le strutture CD1 e CD2 sono piegati in domini indipendenti collegati da un breve linker di 5 residui (residui R194 a D198) (Fig. 1a, b). Le due strutture, nonostante la somiglianza strutturale generale (Fig. 1a, b), mostrano evidenti differenze nelle conformazioni di CD2 e nell’orientamento di impacchettamento tra CD1 e CD2 (Fig. 1c, Fig. 2A supplementare).

Entrambe le strutture rA3G FKL e E/Q hanno la stessa struttura canonica CD1 e si sovrappongono bene tra loro (Fig. 2B supplementare, rmsd di 0.445 Å). Le differenze conformazionali molto più grandi in ogni dominio CD2 risultano in una sovrapposizione rmsd di 0,862 Å. Quando si allineano le strutture FKL e E / Q attraverso il loro dominio CD1, il dominio CD2 della struttura E / Q mostra una rotazione di ~ 29 ° rispetto al CD2 della struttura FKL, causando il dominio E / Q CD2 per spostare ~ 15 Å verso il basso e ~ 8 Å verso CD1, e con conseguente interazione imballaggio molto più vicino con CD1 (Figura supplementare 2 A). L’interfaccia complessiva CD1-CD2 imballaggio ha una superficie sepolta di ~ 623 Å2 per la struttura FKL e ~ 700 Å2 per la struttura E / Q. L’imballaggio CD1-CD2 più stretto nella struttura E/Q porta solo ad una superficie sepolta leggermente maggiore rispetto alla struttura FKL, probabilmente a causa del refolding e la densità mancante dell’interfaccia che localizza elementi strutturali (h2-loop3) del suo CD2.

Due tipi di interazioni tra i domini CD1 e CD2

Mentre la struttura FKL mostra un ripiegamento canonico del suo dominio CD2 (Fig. 2C supplementare), la struttura E/Q mostra una significativa alterazione della conformazione del CD2 (Fig. 2D supplementare), con importanti cambiamenti sull’elica 2 (h2), loop 3, loop 4, e il centro Zn-attivo. Il lungo h2 del CD2 nella struttura FKL (Fig. 2C supplementare) è diventato un breve 310 elica (h2′) nella struttura E / Q (Fig. supplementare 2D), con conseguente disordinato 14-residuo tratto che attraversa parti di loop 3 e h2 (residui A246 a E259) (Fig. supplementare 1A). Il passaggio a un breve 310 h2 e la struttura estesa bobina casuale è necessario per evitare scontri in questa conformazione stretto imballaggio (Fig. 1e). Tuttavia, questo interrompe anche la conformazione del centro CD2 Zn-attivo all’interno delle regioni di h2 e loop 3 che diventano disordinati, con conseguente assenza di Zn-coordinamento (Fig. supplementare 2D). L’assenza di Zn-coordinamento è osservato in un solo altro APOBEC, la struttura APOBEC3F (A3F) CD246,47. Tuttavia, lo Zn contenente o assente A3F-CD2 strutture sono essenzialmente identiche, che anche allineare bene a diverse altre strutture APOBEC (Supplementary Fig. 2E), mentre la E / Q CD2 è unico nel suo refolded h2-loops 3 e 4 e la conformazione Zn-centro (Supplementary Fig. 2E, F).

Mentre è possibile che la perdita di Zn e il ripiegamento di CD2 nella struttura E/Q potrebbe essere il risultato delle mutazioni in questo costrutto, abbiamo studiato se la variante E/Q ha attività di catalisi difettosa. L’inversione di E259Q nel costrutto E/Q al costrutto catalitico WT E259 (costrutto E/Q*) ha restituito la piena attività della variante nel saggio di deaminazione utilizzando lisati di espressione delle cellule HEK293T (Fig. 3 supplementare). Inoltre, E/Q* che porta le singole mutazioni F126Y, K180S/L184S, o CD2Δloop3 (come nella struttura FKL) sono tutti attivi, anche se l’attività del costrutto FKL* (con E259A riportato a E259) con le mutazioni combinate è inferiore a E/Q* e WT. Questi risultati suggeriscono che anche se la struttura cristallizzata E/Q, priva di Zn nel dominio CD2, rappresenta uno stato strutturale A3G cataliticamente inattivo, il ritorno del residuo catalitico a E259 può ripristinare completamente la sua attività di deaminasi paragonabile a WT. Le mutazioni combinate in FKL influenzano parzialmente la sua attività catalitica.

A causa della differenza di ~29° nell’angolo relativo di rotazione nell’imballaggio tra ogni dominio nelle strutture FKL e E/Q, le interazioni molecolari dettagliate tra CD1 e CD2 differiscono tra le due strutture. I domini CD1 e CD2 nella struttura FKL interagiscono tra loro principalmente attraverso h3, h4, e il loop 7 di CD1 e h1, h2, β2, e il loop 3 di CD2 (Fig. 1a, d). Nella struttura E/Q, i due domini interagiscono principalmente attraverso h3, h4 e h6 di CD1 con h2′, β2, loop 4 e loop 10 di CD2 (Fig. 1b, e). Di conseguenza, circa il 40% dei residui interagenti tra CD1 e CD2 differiscono nelle due strutture (vedi un elenco completo dei residui interagenti nella Fig. 4 supplementare), e anche quando gli stessi residui partecipano a questa interazione, spesso fanno diversi contatti di legame a causa del cambiamento di angolo di impacchettamento tra i due domini. La capacità di impacchettare i domini CD1 e CD2 con diversi angoli e interazioni tra i residui indica un certo grado di plasticità nella disposizione dei domini di fl A3G.

Dimero rA3G a lunghezza intera e caratteristiche dell’area di dimerizzazione

Il costrutto E/Q è stato cristallizzato in diverse condizioni di pH e sale (Tabella 1 supplementare) ma ha mostrato costantemente la stessa struttura e dimerizzazione tramite interazioni CD1-CD1 (Fig. 2a, b), principalmente attraverso l’imballaggio diretto di diversi residui su h6 (K180, L184, A187), loop 1 (I26) e loop 7 (F126, W127) da entrambe le subunità (Supplementary Fig. 5A, B). È interessante notare che queste interazioni sono identiche a quelle precedentemente riportate per il dominio rA3G-CD1 da solo18, nonostante l’inclusione della mutazione K128D che è fondamentale per trasformare rA3G da HIV-1 Vif insensibile a sensibile alla degradazione. Vale la pena notare che tale dimerizzazione di fl rA3G porta solo ad un piccolo aumento della dimensione più grande da 85 Å di un monomero a 95 Å di un dimero (Fig. 2a, b).

Un esame dettagliato dei residui allineati su entrambi i lati della zona di interfaccia dimerica rivela due caratteristiche salienti. In primo luogo, un totale di 18 residui positivi/polari e idrofobici sono allineati intorno alla giunzione del dimero rA3G in un modo adatto all’interazione con acidi nucleici a singolo filamento come l’RNA (inserto B in Fig. 2). Questi 18 residui sono organizzati in due set, con il primo set in senso orario a partire dal monomero superiore (in verde), R24, H181, N177, N176, K180, e continuando al monomero inferiore (in azzurro) W127, Y125, Y124, e S28, e poi con il set speculare di questi stessi residui. In secondo luogo, attraverso la dimerizzazione, l’R24 e i vicini residui positivi K180 e H181 di ogni monomero sono posizionati strettamente nello spazio, con circa 7 Å di distanza tra i due residui R24. Questa disposizione spaziale aumenta significativamente i potenziali elettrostatici locali (EP) da circa +1.9 kT/e come monomero a +8.3 kT/e come dimero (Fig. 2c e Inset C, Fig. 2d e Inset D). La presenza di residui ben allineati adatti per il legame di acidi nucleici a singolo filamento, nonché il PEP positivo migliorato (PEP) intorno alla giunzione dimero osservato fortemente implicare che questa zona può legare RNA come un dimero, e suggerisce la rottura di questa interfaccia dimerizzazione A3G può avere un impatto RNA vincolante attraverso la rottura del PEP migliorata (Fig. 2c) al PEP basso come in una forma monomerica (Fig. 2d).

Effetto mutazione dimero su associazione RNA e multimerizzazione

Il nostro studio precedente sul dominio CD1 solo suggerito il dimer-interfaccia residui FWKL (F126, W127, K180, L184) può essere coinvolto in entrambi dimerizzazione e legame RNA, sia attraverso l’interazione diretta con RNA o indirettamente generando una superficie di legame RNA via dimerizzazione18. Ispezione della struttura del dimero rA3G fl rivela che, mentre i residui FWKLA (F126, W127, K180, L184, A187) partecipano direttamente alle interazioni di dimerizzazione (Supplementary Fig. 5A), solo W127 è accessibile per pi-stacking o legame a idrogeno con una base di acido nucleico, suggerendo che è W127 che ha il doppio ruolo critico in dimerizzazione o/e RNA binding, che è stato suggerito anche da precedenti studi mutazionali15,18,40,48.

Loop 7 di rA3G si trova vicino all’interfaccia di dimerizzazione e contiene una serie di residui idrofobici (Y124, Y125, e F126) che si impacchettano con e probabilmente stabilizzare W127 (Supplementary Fig. 5B). Per affrontare se la dimerizzazione è necessaria per l’associazione RNA e per considerare anche il possibile doppio ruolo di W127, abbiamo progettato una serie di mutanti dimer-interfaccia di rA3G che ha lasciato ciclo 7 invariato (Tabella supplementare 3, Fig. supplementare 5A, B). Come tale, solo i residui di interfaccia sepolti al di fuori del loop 7 sono stati mutati, generando i mutanti rM10, rM11, e rM15 (Tabella supplementare 3). Come controllo, abbiamo anche incluso un mutante rM9 con cambiamenti su entrambi loop 7 e h6 di CD1 (F126A-W127A-A187Y) che si prevedeva di provocare un fenotipo simile come il mutante FWKL precedentemente segnalato del CD1 da solo18; cioè interruzione di entrambi dimerizzazione e associazione RNA. Un vicino wild-type rA3G (WT) con una solubilità-enhancing loop switching su CD1 loop 8 e il suo corrispondente mutante cataliticamente inattivo (costrutto E / Q) sono stati inclusi anche (Tabella supplementare 3). L’associazione dell’RNA e lo stato di oligomerizzazione di questi mutanti dopo l’espressione ricombinante in E. coli sono stati esaminati.

Dopo la purificazione su colonna di affinità dai lisati cellulari di E. coli, l’associazione dell’RNA della proteina di fusione sumo-rA3G è stata analizzata mediante urea-PAGE denaturante (Fig. 3a-c). Mentre il WT e il mutante E/Q (corsie 7, 8 in Fig. 3b, c) avevano un’associazione RNA simile, tutti i mutanti dimer-interface (rM10, rM11, rM15 nelle corsie 2, 3, 5, rispettivamente, in Fig. 3b, c) aveva associazione RNA notevolmente ridotto (corsia 7) prima o dopo il trattamento RNase A, con rM10 (T183D-L184D-A187Y), rM15 (I26A-K180S-L184S-A187E) e il mutante di controllo rM9 mostrando poco RNA rilevabile dopo aver attraversato lo stesso processo di purificazione (corsie 1, 2, 5). Cromatografia di esclusione della dimensione (SEC) ha rivelato che rM10 e rM15, così come il mutante di controllo rM9, eluito prevalentemente come un monomero prima e dopo il trattamento RNase A (Fig. 3d, e; Supplementary Fig. 6A, B), confermando interruzione di dimerizzazione / multimerizzazione. Così, questi risultati suggeriscono che nelle condizioni sperimentali mutando residui sepolti all’interno dell’interfaccia non solo interrompe dimerizzazione, ma colpisce anche l’associazione RNA anche quando loop 7 è invariato, probabilmente a causa della perdita della PEP rafforzata come risultato della rottura del dimero (Fig. 2c, d).

Poiché non abbiamo potuto eseguire lo stesso tipo di test biochimico per valutare mutanti simili in A3G umano (hA3G) a causa della sua scarsa solubilità, abbiamo generato un rA3G-hA3G chimera mutante (h6 chimera) in cui il rA3G CD1 h6 è sostituito con hA3G CD1 h6 (vedi Tabella 3 supplementare). Questa chimera h6 comportato in modo simile come rA3G WT durante la purificazione in termini di dimero / multimerizzazione prima o dopo il trattamento RNase A (Supplementary Fig. 7A, B), così come associazione RNA, soprattutto dopo il trattamento RNase A (Supplementary Fig. 7C, D). Vale la pena notare che, come mostrato nella Fig. supplementare 7A, B, mentre la proteina chimera H6 anche spostato a dimero (D) e monomero (M) frazioni dopo RNase A trattamento (gel SDS-PAGE in Fig. 7D), il suo profilo SEC mostra picchi più eterogenei di quello di rA3G WT, forse perché la proteina chimerica ha tre residui (Y181, I183, I187) da hA3G che sono più idrofobici di quelli in rA3G (H181, T183, A187), e quindi meno stabile / solubile. Questi risultati suggeriscono la possibilità che CD1 h6 può essere intercambiabile tra rA3G e hA3G, che porta alla presenza della stessa area PEP che ha essenzialmente lo stesso set di residui di superficie su entrambe le proteine.

effetto mutazione PEP su associazione RNA e multimerizzazione

Abbiamo poi studiato se la PEP-superficie rafforzata formata intorno alla giunzione dimer (Fig. 2. Inset b) è importante per l’associazione RNA. Quattro residui positivi/polari centrati intorno a R24 sono stati mutati per generare rM12 (R24T-S28A-N176A-N177D, Tabella supplementare 3). È stato incluso anche un mutante contenente solo R24T. L’associazione RNA di rM12 è stata ridotta rispetto a R24T e WT (corsie 4, 6, 7 in Fig. 3b, c), indicando un ruolo di questi residui all’interno dell’area PEP nel migliorare il legame RNA. Tuttavia, rispetto a rM9 (F126A/W127A/A187Y), rM12 aveva ancora una notevole quantità di associazione RNA prima e dopo il trattamento RNase A (corsie 1, 4 in Fig. 3b, c), forse a causa della parziale interruzione del legame RNA alla zona PEP ma non ad altre aree di rA3G. Inaspettatamente, l’analisi SEC ha rivelato che rM12 aveva un importante picco monomerico anche prima del trattamento RNase A (Fig. 3d, e, Supplementary Fig. 6A, B), indicando interruzione di dimerizzazione / multimerizzazione senza mutare direttamente l’interfaccia dimerizzazione. Questo effetto negativo della mutazione PEP sull’associazione RNA e dimerizzazione/multimerizzazione è stato ulteriormente confermato da due mutanti rA3G più contenenti mutazioni PEP, rM13 e rM14 (Tabella 3 supplementare, Fig. 7 supplementare). Questi due mutanti hanno mostrato diversi livelli di interruzione dell’associazione RNA (Fig. 7A supplementare) e dimerizzazione/multimerizzazione anche prima del trattamento RNase A sotto la condizione testata (profili SEC e gel in Fig. 7C supplementare).

Interessante, anche se R24T singolo mutante e WT ha mostrato quantità simili di RNA associato rilevato da gel RNA in Fig. 3b, c, l’analisi dettagliata SDS-PAGE delle loro frazioni di picco SEC prima del trattamento RNase A ha rivelato che la maggior parte della proteina R24T distribuito nelle frazioni si sviluppa intorno al picco monomerico (M) posizione (Fig. 6A supplementare), che è in contrasto con il WT che è per lo più distribuito nel volume vuoto (V) frazioni. Questi risultati indicano il cambiamento di associazione RNA e comportamento multimerizzazione con una singola mutazione R24T all’interno della zona PEP, che è coerente con studi precedenti di R24A mutazioni 14,30,38,40. Presi insieme, questi risultati dimostrano che, in queste condizioni di saggio, i residui all’interno dell’area PEP rafforzata della giunzione dimerica (R24/S28/N176/N177) svolgono un ruolo importante nel mediare l’associazione di RNA, e l’associazione di RNA attraverso questi residui è al contrario richiesto per stabilizzare la dimerizzazione e successiva multimerizzazione di ordine superiore.

Effetto delle mutazioni PEP/dimero sul legame RNA/DNA in vitro

Le strutture fl rA3G rivelano ulteriori aree con residui caricati positivamente al di fuori dell’area PEP potenziata come mostrato in Fig. 2c. Mentre questi residui caricati positivamente al di fuori dell’area PEP potrebbero non giocare un ruolo importante nella formazione di complessi A3G-RNA stabili come osservato dai lisati delle cellule di E. coli, potrebbero comunque contribuire a legare i substrati definiti ssRNA e ssDNA. Per testare questo, ogni campione di proteina purificata è stata sottoposta a un trattamento RNase estesa al fine di rimuovere quanto più RNA legato possibile, e l’affinità di legame verso 50 nt ssRNA o ssDNA oligomeri è stato testato utilizzando un saggio di gel shift. Tutti i mutanti hanno mostrato di legarsi a 50 nt di ssRNA o ssDNA, e le costanti di dissociazione stimate (Kd, Tabella 3 supplementare) hanno indicato che la maggior parte dei mutanti avevano un legame ridotto rispetto a WT e E/Q. Questi risultati indicano che in questo sistema ricostituito dove erano presenti alte concentrazioni di proteine e acidi nucleici, questi vari mutanti rA3G dimer-interface e area PEP sono ancora in grado di legarsi a RNA e ssDNA attraverso altri residui al di fuori dell’area PEP alla giunzione del dimero.

In generale, la riduzione del legame di questi mutanti è più grave per il legame ssDNA rispetto al legame RNA. È interessante notare che il test della deaminasi utilizzando le proteine purificate di questi mutanti rA3G (rM9-rM12 e rM15) ha rivelato che questi mutanti dimer-interface e i mutanti che legano l’RNA hanno tutti mostrato una ridotta attività deaminasi rispetto a WT (Figura 8 supplementare). L’abbassamento del legame ssDNA di questi mutanti potrebbe spiegare, almeno in parte, i vari livelli di riduzione dell’attività della deaminasi. Tuttavia, il grado di abbassamento del legame ssDNA non sembra avere una stretta correlazione con il livello di interruzione dell’attività della deaminasi. Per esempio, rM12 ha mostrato il più basso legame ssDNA (Tabella 3 supplementare) ma non è quello con la minore attività deaminasi (Fig. 8 supplementare).

Effetti delle mutazioni PEP/dimer-interface sulla restrizione dell’HIV

La mutazione W127A su A3G umano (hA3G) è nota per interrompere il confezionamento del virione e, quindi, la restrizione dell’HIV, probabilmente abolendo il legame RNA mediato da questo residuo. Tuttavia, gli studi che hanno indotto l’imballaggio di mutanti hA3G W127 attraverso una fusione peptide Vpr hanno identificato carenze nella restrizione di HIV15. Per ottenere ulteriori approfondimenti sul meccanismo di restrizione HIV-1 da hA3G, abbiamo progettato ulteriori mutanti hA3G guidato dalla struttura rA3G e dati mutazionali. L’intenzione di queste mutazioni hA3G (Tabella supplementare 4) è stato quello di disturbare le interazioni intramolecolari CD1-CD2 (M2, M3, M4) (Supplementary Fig. 9A, B), interrompere il legame RNA intorno alla giunzione dimer mutando un numero crescente di residui polari / caricati (M12, M13, M14), o per interrompere le interazioni proteina-proteina dimero mutando un numero crescente di residui sepolti (M6, M10, M11) (Supplementary Fig. 9C).

Come previsto, WT hA3G non aveva attività di restrizione HIV-1 in presenza di Vif, ma completamente limitato HIV-1 in assenza di Vif, e il Vif-resistente M1 (D128K) costruire completamente limitato infezione da HIV con o senza Vif (Fig. 4a-c). D’altra parte, il W127A contenente mutante M9 (con mutazioni F126A/W127A/I187Y, Supplementary Fig. 9C) noto per interrompere sia il legame RNA e dimerizzazione non aveva attività di restrizione indipendentemente dalla presenza Vif (Fig. 4a-c). Questo è coerente con la letteratura precedente affermando W127 è importante per l’attività di restrizione HIV a causa della sua capacità di legame RNA che è necessario per hA3G imballaggio virione e deaminazione-indipendente restrizione della trascrizione inversa 14,15. Infatti, anche se la sua sensibilità alla Vif-degradazione sembrava essere ridotto (Fig. 10A supplementare), ~ 5 a 10 volte meno proteina mutante M9 è stato confezionato in virione in presenza o in assenza di Vif rispetto al WT hA3G (Fig. 4a, b). Questi risultati di WT e dei mutanti di controllo M1 e M9 di hA3G hanno dimostrato la piena attività o la mancanza di attività nel nostro studio.

Per i mutanti progettati per influenzare le interazioni intramolecolari CD1-CD2, sono stati mutati più residui vicino o all’interno dell’interfaccia interdominio sul lato CD2 per M2 e M3 e sul lato CD1 per M4 (Fig. 9A, B). M2 e M3 avevano entrambi un’attività di restrizione dell’HIV-1 significativamente inferiore in assenza di Vif (Fig. 4c). M2 portando mutazioni su CD2 loop 1 e 3 intorno all’interfaccia con CD1 ha mostrato una completa perdita di attività catalitica (Fig. 4e), probabilmente perché alcuni di questi residui mutati, come H216, sono importanti per l’interazione ssDNA substrato 49. M3 portando mutazioni sull’interfaccia CD2 con CD1, a partire dal linker residui R194/H195 (Supplementary Fig. 9A, B), aveva solo ~ 10% di attività deaminasi WT (Fig. 4e), forse a causa della perdita di interazione corretta CD2 con CD1 per influenzare coordinato ssDNA legame substrato per l’attività catalitica efficiente. M4 che trasportano mutazioni multiple intorno all’interfaccia interdominio su CD1 visualizzato caratteristiche simili a WT indicando queste mutazioni non hanno alcun effetto evidente sulla capacità di restrizione. È interessante notare che questa mutazione aveva piena attività catalitica (Fig. 4e), suggerendo certa plasticità tra CD1-CD2 interazioni interfaccia per funzioni.

M12 e M13 sono stati progettati per interrompere solo il legame RNA alla zona PEP alla giunzione del dimero, e M14 contiene la maggior parte delle mutazioni di M12 e M13 più quattro residui aggiuntivi R / K (K52/K63/R69/K76) per eliminare l’unica superficie rimanente carica positiva su A3G-CD1 (Supplementary Fig. 9C). Sorprendentemente, questi mutanti hanno tutti mostrato ~70% di attività di restrizione dell’HIV-1 in assenza di Vif (Fig. 4c). Anche se era difficile quantificare la sensibilità Vif a causa del persistente basso livello di espressione di M12, M13, e M14 in Vif-sensibilità test (Supplementary Fig. 10A), tutti e tre i mutanti, simile a WT, non ha mostrato alcuna attività di restrizione HIV in presenza di Vif (Fig. 4c), suggerendo che erano in realtà ancora sufficientemente sensibile alla degradazione mediata Vif. La ragione per solo 70% HIV-1 attività di restrizione di M12-14 non era dovuto ai loro livelli di proteina inferiore stato stazionario rilevato in lisati di cellule HEK293T (Fig. 4a, b), dal momento che la trasfezione di meno plasmide di espressione WT per ottenere livelli di espressione cellulare simili come M12-M14 ancora portato a ~ 4 volte più HIV-1 restrizione da WT (Fig. supplementare 10B). Questo è coerente con la deaminazione-indipendente attività di restrizione, come questi tre mutanti avevano interrotto l’attività di deaminazione (Fig. 4d, e). Specialmente M14 aveva una perdita completa dell’attività di deaminasi (Fig. 4e). Coerente con questo era il tasso di mutazione di fondo di M14 basato sui risultati di sequenziamento del DNA provirale (Tabella 5 supplementare). Eppure ha visualizzato ~70% HIV-1 attività di restrizione. Questi risultati dimostrano chiaramente che i residui mutati in M12-14 per interrompere il legame dell’RNA nella PEP e nelle aree vicine su CD1 hanno mostrato solo un difetto parziale nel limitare l’HIV, indicando che hanno mantenuto un certo livello di incapsulamento del virione e la restrizione dell’HIV-1, che è in contrasto con il ruolo del legame dell’RNA mediato attraverso mutazioni contenenti W127 nel mutante M9 che è fondamentale per l’imballaggio del virione e la restrizione dell’HIV (Fig. 4a-c).

I mutanti destinati a interrompere solo le interazioni proteina-proteina dimer con numero crescente di mutazioni sono da M6 a M11 (Tabella supplementare 4, Fig. supplementare 9C). M6 e M7 hanno mostrato solo una parziale perdita di attività di restrizione in assenza di Vif, nonostante la perdita del 95% di attività catalitica per M7 a causa delle tre mutazioni aggiuntive su CD2 (Fig. 4e). Pertanto, le mutazioni in M6 e M7 non sono critici per HIV-restrizione. M10 ha mostrato fenotipo più grave in HIV-1 restrizione in assenza di Vif anche se ha mantenuto qualche attività catalitica (Fig. 4e), suggerendo mutazioni su M10 sono importanti per l’imballaggio virale e HIV-limitazione. M11 è simile a M10 nell’attività di deaminasi, ma con un fenotipo meno grave in termini di attività di restrizione e integrazione (Fig. 4c, d). E’ possibile che M11 abbia mantenuto più capacità di legame dell’RNA rispetto a M10 (da rM10-11 dell’analisi del mutante rA3G, Fig. 3a-e), con conseguente fenotipo meno grave. Presi insieme, questi risultati hanno mostrato che i residui mutanti all’interno dell’interfaccia sepolto proteina-proteina dimero da solo ancora mantenuto HIV-restrizione attività a livelli ridotti (Fig. 4c), e la rottura di attività deaminasi di questi mutanti (Fig. 4e) può in parte spiegare la riduzione dell’attività di restrizione HIV. Questo ancora una volta è in contrasto con il mutante M9 che non ha mostrato alcuna attività di restrizione dell’HIV (Fig. 4a-c).