Convalida anticorpo

Non tutti gli anticorpi sono validi per ogni esperimento e condizione, devono essere convalidati per l’applicazione e la specie specifica. Attualmente, non esiste un mezzo standard di “validazione degli anticorpi”, e questo può avere un grande impatto sulla riproducibilità e affidabilità sperimentale. Le riviste e le agenzie di finanziamento hanno preso provvedimenti per affrontare questa lacuna. Molte ora hanno requisiti per dichiarare esplicitamente come si convaliderà un anticorpo per un uso specifico. Sfortunatamente, non ci sono criteri universalmente accettati per la convalida degli anticorpi. Quindi, è compito di ogni ricercatore convalidare ogni singolo anticorpo per l’applicazione prevista.

Convalida di base

I metodi standard di convalida degli anticorpi includono western blot, ELISA, citometria a flusso e IHC. La maggior parte dei ricercatori si trova a proprio agio con questi metodi collaudati. Il processo di convalida può richiedere molto tempo perché il ricercatore o il produttore deve convalidare l’anticorpo per ogni applicazione. Questa difficoltà è aggravata dal fatto che le condizioni di ogni test sono diverse. Per esempio, un western blot dipende dalla denaturazione delle proteine. Quindi, un anticorpo convalidato per il western blot può funzionare bene in condizioni di denaturazione ma può non riconoscere gli antigeni nella loro conformazione nativa (cioè, ELISA).1 Allo stesso modo, un anticorpo convalidato per l’affinità della proteina nativa potrebbe non riuscire a legare lo stesso antigene dopo la denaturazione o la fissazione.

I metodi di cui sopra svolgono ruoli necessari nella convalida degli anticorpi. Tuttavia, non possiamo fare affidamento solo su questi metodi, perché non rappresentano le applicazioni in continua espansione. Il livello di fiducia degli anticorpi convalidati può essere aumentato includendo altre tecniche di convalida.

Vecchie tecniche, nuovi usi

Per affrontare le carenze della convalida di base degli anticorpi, un gruppo di scienziati si è recentemente riunito per “proporre una serie di linee guida standard per la convalida degli anticorpi”.2 Essi suggeriscono che oltre ai metodi di convalida degli anticorpi di base, i ricercatori iniziano a basarsi su pilastri concettuali. Questi includono strategie genetiche, strategie di anticorpi indipendenti e l’espressione di proteine etichettate.2

• Strategie genetiche: CRISPR-Cas9 e altro

  Le strategie genetiche consistono in tecniche come CRISPR-Cas9, RNAi e siRNA knockdown, usate insieme a un test di rilevamento della proteina. Questi metodi rilevano qualsiasi legame non specifico da parte dell’anticorpo in questione dopo aver eliminato o abbattuto il gene appropriato. Se l’anticorpo è specifico, allora nessun segnale o un segnale ridotto dall’anticorpo dovrebbe essere rilevato nelle linee cellulari knock out o down, rispettivamente.

• Approccio anticorpo indipendente

  L’uso di anticorpi indipendenti è un altro metodo che potrebbe rilevare il legame non specifico. L’approccio dell’anticorpo indipendente impiega due anticorpi diversi (indipendenti) che legano lo stesso antigene ma epitopi diversi. Pertanto, i due anticorpi dovrebbero mostrare lo stesso pattern di rilevazione e nessun legame off-target.2 Questa tecnica richiede più campioni da testare per controllare l’espressione variabile della proteina bersaglio, il che potrebbe diventare costoso e richiedere molto tempo.2 Inoltre, la tecnica di validazione si basa sulla disponibilità di più anticorpi che riconoscono diversi epitopi sulla stessa proteina bersaglio. GenScript offre il binning degli epitopi nei serviziMonoExpress™ mAb che includono “anticorpi indipendenti” per gli antigeni proteici.

• Tagged Protein Expression

  Analizzare la rilevazione di proteine target taggate può anche fornire un modo per misurare il legame non specifico degli anticorpi. In questo metodo, le proteine bersaglio sono modificate con un tag di affinità (cioè, FLAG) o una proteina fluorescente (cioè, GFP). Poi, simile all’approccio anticorpo indipendente, il modello di rilevamento dell’anticorpo da convalidare viene confrontato con quello dell’anticorpo specifico del tag. Anche se semplice, un problema con questo metodo è garantire che le proteine etichettate siano espresse a livelli endogeni, perché “la sovraespressione potrebbe mascherare la rilevazione di eventi di legame fuori bersaglio”.2

  Anticorpi ricombinanti come alternativa agli anticorpi monoclonali?

  Una recente chiamata all’azione per quanto riguarda la convalida degli anticorpi ha suggerito che i ricercatori utilizzano solo anticorpi ricombinanti, piuttosto che anticorpi policlonali o anche monoclonali. Gli anticorpi monoclonali sono prodotti utilizzando linee cellulari di ibridoma. Sfortunatamente, le linee cellulari di ibridoma possono morire, perdere i loro geni che codificano gli anticorpi, o non crescere quando vengono tolti dalla conservazione congelata.3 Inoltre gli anticorpi monoclonali prodotti dagli ibridomi potrebbero legarsi a più di un bersaglio. Pertanto, determinare la sequenza dell’anticorpo codificato dall’ibridoma e produrre l’anticorpo in modo ricombinante supera questi problemi. Inoltre, a causa della sequenza definita, gli anticorpi ricombinanti possono fornire un altro livello di convalida rispetto all’utilizzo delle sole tecniche di cui sopra.3

  Questi metodi di convalida aggiuntivi si propongono di “fornire la prova che un anticorpo lega il suo bersaglio, e nella maggior parte dei casi, dovrebbero anche consentire la valutazione della potenziale cross-reattività nelle condizioni testate”.2 Tuttavia, vecchie e nuove strategie dovranno probabilmente essere eseguite in combinazione per convalidare correttamente l’anticorpo.

Scegliere il metodo appropriato di convalida degli anticorpi

Con tutti questi problemi che circondano gli anticorpi, come si fa a scegliere il metodo appropriato? Per esempio, il metodo CRISPR-Cas9 non comporta la modifica della proteina bersaglio e convalida che l’anticorpo non ha cross-reattività con altre proteine. Così, è possibile utilizzare questa tecnica per convalidare gli anticorpi per una vasta gamma di saggi, tra cui western blot, IHC, immunocitochimica (ICC), citometria a flusso, ELISA, immunoprecipitazione (IP), immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), e saggi proteici in fase inversa.2 Tuttavia, a causa delle difficoltà con l’espressione di una proteina modificata, la convalida di un anticorpo utilizzando l’espressione della proteina taggata è suggerita solo per western blot, IHC, ICC e citometria a flusso.

In secondo luogo, il ricercatore deve essere consapevole dei limiti del campione di tali metodi di convalida. Per esempio, sia CRISPR-Cas9/KO che le tecniche di espressione delle proteine etichettate non possono essere utilizzate per convalidare gli anticorpi in campioni di tessuti umani e fluidi corporei, come il plasma e il siero.2 Questo perché non è possibile eseguire manipolazioni genetiche negli esseri umani, a differenza delle linee cellulari.

Infine, indipendentemente dall’anticorpo e dal rispettivo metodo di convalida utilizzato dal fornitore di anticorpi, il ricercatore deve eseguire almeno una strategia di convalida nella sua particolare applicazione o contesto del campione.2

Validare ogni anticorpo per la sua specifica applicazione e specie è fondamentale per ottenere risultati riproducibili e affidabili. Queste informazioni ti aiuteranno a guidare la tua decisione sui metodi appropriati da utilizzare nel tuo laboratorio. Per ulteriore aiuto nella validazione degli anticorpi o in altre applicazioni, visitate GenScript Antibody Technical Resources.

Adattato dal contenuto creato da BitesizeBio per conto di GenScript.