Effetti citotossici e genotossici dell’acefato sullo sperma umano

Abstract

L’uso estensivo di pesticidi organofosforici (OP) potrebbe alterare la qualità del seme e il DNA dello sperma in diverse fasi della spermatogenesi. L’acefato è un OP altamente tossico ampiamente utilizzato e, pertanto, abbiamo voluto valutare gli effetti dell’acefato sulla qualità dello sperma umano e sull’integrità del DNA spermatico. Gli spermatozoi raccolti da maschi sani sono stati esposti a 0, 50, 100 e 200 μg/mL di acefato e incubati per 1 ora, 2 ore e 3 ore. Il risultato ha mostrato un declino significativo della motilità a 100 μg/mL dopo 3 h e con 200 μg/mL dopo 1 h, 2 h e 3 h. La vitalità è stata significativamente ridotta a 200 μg/mL dopo 2 h e 3 h. L’integrità funzionale è stata significativamente colpita a 100 μg/mL dopo 3h e nella dose di 200 μg/mL dopo 2 h e 3h. Allo stesso modo, la capacitazione degli spermatozoi era significativamente colpita a 200 μg/mL dopo 1 h, 2 h e 3 h e a 100 μg/mL a 3 h. Il danno al DNA era significativamente aumentato solo nella dose di 200 μg/mL dopo 3 h. Lo studio suggerisce che l’esposizione all’acefato può provocare alterazioni della struttura e della funzione dello sperma contribuendo così al deterioramento della qualità dello sperma umano che scatena l’infertilità.

1. Introduzione

Negli ultimi decenni diversi studi hanno dimostrato una funzione riproduttiva distruttiva negli animali e nell’uomo a causa di sostanze chimiche prodotte dall’uomo e altri tossici. Purtroppo, relativamente pochi studi hanno affrontato sistematicamente l’impatto dell’esposizione ambientale sulla salute riproduttiva umana. Secondo studi recenti, a livello globale ogni anno le coppie che soffrono di infertilità (non riescono a concepire dopo 12 mesi di regolari rapporti sessuali non protetti) rappresentano circa 60-80 milioni. Il novantotto per cento dei casi di subfertilità maschile può essere attribuito principalmente alla qualità carente degli spermatozoi. Tuttavia, la subfertilità può essere considerata idiopatica e potrebbe essere il risultato di fattori di rischio come gli interferenti endocrini ambientali tra cui i pesticidi.

I pesticidi organofosfati sono esteri di acidi fosforici e tiofosforici e la loro tossicità è stata collegata alla loro capacità di inibire l’azione dell’acetilcolinesterasi portando all’accumulo di acetilcolina nelle giunzioni nervose. Molti studi epidemiologici hanno riconosciuto l’associazione tra l’esposizione ai pesticidi organofosfati (OP) e disturbi riproduttivi come infertilità, difetti alla nascita, esiti negativi della gravidanza e morti perinatali. I pesticidi organofosfati sono sospettati di alterare la funzione riproduttiva riducendo l’attività dell’acetilcolinesterasi cerebrale che colpisce la gonadotropina ipofisaria causando infertilità. Gli effetti sulla qualità dello sperma potrebbero essere valutati da parametri come la concentrazione di spermatozoi, la percentuale di spermatozoi mobili e la percentuale di spermatozoi con morfologia normale, insieme ai parametri di movimento dello sperma. Diversi studi hanno rivelato che gli uomini esposti a OP avevano un alto rischio di sviluppare parametri seminali anormali, tra cui una diminuzione della concentrazione di sperma, una diminuzione della motilità dello sperma, una diminuzione del numero di spermatozoi, e una maggiore aneuploidia dei cromosomi sessuali nello sperma. Uno studio condotto in Cina con diversi OP ha mostrato una chiara relazione tra la presenza di metaboliti urinari insetticida e la concentrazione di sperma e la motilità dello sperma in uomini appena sposati. Studi in vitro condotti utilizzando OP hanno fornito la prova che questi pesticidi potrebbero danneggiare il DNA nello sperma umano causando così effetti genotossici.

Tra gli OP ampiamente utilizzati e tossici in Sri Lanka, l’acefato (O,S-dimetil acetilfosforamidotioato) è un insetticida, utilizzato in agricoltura e per scopi domestici grazie alla sua proprietà insetticida ad ampio spettro. L’acefato è un insetticida sistemico con azione di contatto e di stomaco. Il meccanismo tossico dell’acefato è attribuito non solo all’inibizione dell’acetilcolinesterasi (AchE) ma anche ad agire come agente neurotossico ritardato. Sing e Jiang hanno riferito che l’acefato è un potente composto neurotossico, mutageno, cancerogeno e citotossico. Allo stesso modo, Farag et al. hanno rivelato che le dosi di 14 e 28 mg/kg/giorno di acefato hanno diminuito la motilità e il numero di spermatozoi in topi maschi adulti. Altri due studi hanno confermato che l’acefato diminuisce significativamente la fertilità, la dinamica dello sperma, il peso degli organi sessuali e gli ormoni sessuali nei ratti maschi albini. Pertanto, simile ad altri OP, c’è un rischio potenziale di questo composto sulla salute riproduttiva degli esseri umani.

L’acefato è ampiamente utilizzato dagli agricoltori dello Sri Lanka, che sono nella loro prima età riproduttiva. Negli ultimi due o tre decenni, è diventato chiaro che l’esposizione professionale ai pesticidi potrebbe influenzare la fertilità degli uomini, indicando così alti rischi di esposizione di questi giovani coltivatori. La regolamentazione dei pesticidi si basa principalmente su modelli animali e i dati sull’esposizione umana e la qualità del seme continuano ad essere scarsi e limitati. Pertanto, il presente studio è stato condotto per indagare gli effetti dell’acefato sulla fertilità maschile umana e l’integrità del DNA delle cellule spermatiche in vitro.

2. Materiali e metodi

2.1. Materiale di prova

Acefato non formulato (nome commerciale: Surrender; formula molecolare: C4H10NO3PS; peso molecolare: 183,16 g/mol; purezza: 99,0%; dosaggio di campo raccomandato dal produttore: 1 g di acefato in 1 L di acqua) è stato ottenuto da Hayleys Agriculture Ltd., Colombo, Sri Lanka. Poiché l’acefato è facilmente solubile in Biggers Whitten Whittingham (BWW), è stato usato come controllo.

2.2. Raccolta e preparazione dello sperma

I campioni di sperma sono stati raccolti da donatori maschi sani (età 20-30 anni) dell’Università di Sri Jayewardenepura, Sri Lanka, in una fiala sterile. Prima della raccolta dello sperma ai donatori è stato dato un foglio informativo e un modulo di consenso che chiedeva la loro disponibilità a partecipare allo studio. A tutti i soggetti partecipanti è stato chiesto di astenersi da qualsiasi attività sessuale per 3-5 giorni prima della raccolta dello sperma. Gli uomini (età media di ) con concentrazione di sperma, motilità, morfologia, viscosità, tempo di liquefazione e pH normali e assenza di forme immature e leucociti sono stati selezionati per lo studio. I parametri dello sperma (motilità, vitalità, test di rigonfiamento ipoosmotico e morfologia) sono stati valutati secondo le linee guida dell’Organizzazione Mondiale della Sanità. Poiché gli effetti dell’acefato potrebbero amplificarsi in presenza di sperma anormale, è importante selezionare donatori con una qualità dello sperma accettabile per lo studio.

L’approvazione etica (autorizzazione etica numero di riferimento: 712/13) è stata ottenuta dal Comitato di revisione etica, Facoltà di Scienze mediche, Università di Sri Jayewardenepura, Nugegoda, Sri Lanka.

2.3. Determinazione dei livelli di dose

Per determinare i livelli di dose, è stato effettuato il valore LD50 dell’acefato per la motilità dello sperma. Quindi, è stato preparato un campione con 1 mg di acefato in 1 mL di BWW, che è equivalente al dosaggio di campo raccomandato (1 g di acefato in 1 L di acqua) di acefato. I campioni preparati sono stati successivamente diluiti con BWW per ottenere diverse concentrazioni di acefato. Le sospensioni di sperma (fissate a 50 × 106 spermatozoi/mL) sono state poste in provette Eppendorf ed è stato aggiunto il volume desiderato di BWW o di soluzione di prova (il volume finale della provetta è pari a 1 mL). I campioni sono stati accuratamente mescolati e poi incubati per 1 ora in un incubatore umidificato (Sanyo Electric Co. Ltd., Tokyo, Giappone) a 37°C con 5% di CO2. Dopo l’incubazione, la percentuale di motilità degli spermatozoi è stata determinata ad ogni concentrazione da due osservatori indipendenti al microscopio Olympus con ottica a contrasto di fase (X 400; Olympus Corporation, Giappone). Sulla base di questa indagine pilota per determinare le indicazioni delle dosi tossiche per i campioni di sperma, è stato rivelato che il valore LD50 per l’acefato è 200 μg/mL. Quindi, nel presente studio sono state utilizzate concentrazioni subletali inferiori a LD50, compreso il valore LD50.

Di seguito sono riportati i livelli di dose selezionati per il presente studio: Dose alta: 200 μg/mL (equivalente al valore LD50). Dose media: 100 μg/mL. Dose bassa: 50 μg/mL.Inoltre, abbiamo deciso di estendere i punti di tempo da 1 h a 2 h e 3 h per determinare gli effetti prolungati di esposizione acefato.

2.4. Incubazione dei pesticidi

I campioni di sperma fresco () sono stati diluiti con BWW per ottenere una concentrazione finale di spermatozoi di 40 × 106 spermatozoi/mL. Successivamente i campioni sono stati incubati con pesticidi a concentrazioni di 50, 100 e 200 μg/mL o con BWW. Le incubazioni sono state condotte in 1 mL di volume finale per 1, 2 e 3 ore a 37°C in un incubatore (Sanyo Electric Co. Ltd., Tokyo, Giappone) in atmosfera di 5% CO2 e 95% O2.

2.5. Determinazione della motilità dello sperma

Sono stati stimati gli spermatozoi mobili totali (circa 100 cellule) da due osservatori indipendenti sotto un’ottica a contrasto di fase (X 400; Olympus Corporation, Giappone). La percentuale di motilità in avanti è stata calcolata.

2.6. Saggio di citotossicità

La vitalità degli spermatozoi è stata valutata utilizzando la tecnica di colorazione Eosin Y e sono stati calcolati gli spermatozoi morti e vivi. Percentuale di vitalità = (numero totale di cellule – numero colorato/numero totale di cellule) × 100. Numero totale di cellule = 100.

2.7. Determinazione dell’integrità funzionale della membrana plasmatica dello sperma

L’integrità funzionale della membrana plasmatica dello sperma è stata valutata utilizzando il test Hypoosmotic Swelling (HOS) descritto da Jeyendran et al. Sono stati contati almeno 100 spermatozoi per preparazione.

2.8. Determinazione della capacitazione

Un’aliquota di 150 μL di terreno BWW è stata posta in un piatto di coltura preriscaldato (35 × 10 mm, Corning, New York, USA) e coperta con un coprioggetti preriscaldato da 22 × 22 mm. Un’aliquota di 20 μL di campione di sperma è stata aggiunta ad un angolo del vetrino. Il piatto di coltura è stato posto in un microscopio invertito (Diaphot, Nikon, Londra, Regno Unito) dotato di un armadio riscaldato ad aria controllato termostaticamente (Nikon, Londra, Regno Unito) equilibrato a 37°C. Lo stato di capacitazione dello sperma è stato valutato in base all’iperattivazione con il metodo fotografico oggettivo utilizzando un microscopio a contrasto di fase Olympus IX71. Poiché l’iperattivazione è un fenomeno dei flagelli, è possibile valutare visivamente l’iperattivazione in base alla motilità dello sperma; i modelli di movimento dei flagelli sono stati valutati per l’enumerazione degli spermatozoi non iperattivati e iperattivati. Gli esperimenti sono stati eseguiti in duplicato e ripetuti indipendentemente quattro volte.

2.9. Determinazione del danno al DNA negli spermatozoi

Gli strisci di sperma sono stati preparati su vetrini microscopici puliti e la percentuale di spermatozoi con DNA normale è stata determinata contando 500 spermatozoi al microscopio a fluorescenza (BH-2, Olympus Ltd., Giappone) con eccitazione di 490 nm. Il periodo di osservazione per un singolo campo ha richiesto meno di 40-50 secondi. Gli spermatozoi che mostravano un colore dal giallo al rosso sono stati segnati come DNA denaturato e gli spermatozoi che mostravano un colore verde sono stati segnati come DNA normale.

2.10. Analisi statistica

I conteggi degli spermatozoi dei maschi adulti erano normalmente distribuiti e sono stati confrontati tra i gruppi con l’analisi della varianza a due vie (ANOVA) utilizzando il pacchetto software Minitab (Minitab Co., USA) per l’effetto principale dei pesticidi. Dove è stato trovato un effetto significativo del trattamento, le differenze tra le medie dei singoli gruppi sono state testate con “Tukey 95%”. I dati sono espressi come media ± Standard Error Mean (SEM). valore è stato impostato su .

3. Risultati

3.1. Motilità dello sperma

Rispetto al controllo, la motilità percentuale è stata significativamente () diminuita (Tabella 1) alla dose media (100 μg/mL) del 16% dopo 3 ore di incubazione. Al contrario, una riduzione altamente significativa () è stata registrata in 200 μg/mL dopo 1 h, 2 h e 3 h di incubazione rispetto ai controlli. Inoltre, la riduzione della motilità è chiara in ogni dosaggio con l’aumento del tempo di incubazione.

3.2. Citotossicità

La vitalità percentuale è stata diminuita (Tabella 1) in tutti i gruppi di trattamento con il tempo, ma una riduzione significativa (del 20%; ) è stata registrata in 200 μg/mL (dose elevata) dopo 2 ore di incubazione rispetto ai controlli. Altamente significativo () riduzione è stata registrata in alta dose dopo 3 h di incubazione ed è stato diminuito del 31% rispetto al controllo.

3.3. Integrità funzionale della membrana plasmatica dello sperma

La tabella 1 mostra i risultati dell’integrità funzionale delle cellule spermatiche dopo 1 h, 2 h e 3 h di incubazione. Significative riduzioni () dell’integrità funzionale sono state registrate nella dose media di 13.5% dopo 3 h e anche in alto dosaggio del 26% dopo 2 h di incubazione rispetto ai loro controlli. Una riduzione altamente significativa () è stata registrata in alto dosaggio (del 35%) dopo 3 ore di incubazione.

3.4. Capacitazione dello sperma

La riduzione degli spermatozoi capacitati è stata osservata in tutti i gruppi di trattamento (tabella 1). La percentuale di spermatozoi capacitati è stata significativamente ridotta () nella dose 100 μg/mL del 18% dopo 3 ore di incubazione e ad alto dosaggio del 32%, 36% e 38%, rispettivamente, dopo 1 h, 2 h e 3 h di incubazione.

3.5. Danni al DNA negli spermatozoi

La percentuale di spermatozoi danneggiati dal DNA è aumentata con l’aumento del dosaggio e del tempo di incubazione. Ma un aumento significativo () del danno al DNA è stato registrato solo ad alto dosaggio (del 33%) dopo 3 ore di incubazione. I risultati sono riassunti nella tabella 1.

4. Discussione

Gli insetticidi OP sono ampiamente utilizzati in Sri Lanka con poca o nessuna protezione da parte degli utenti e gli individui sono quindi ad alto rischio di esposizione. Inoltre, questi agricoltori nella loro prima età riproduttiva sono inevitabilmente esposti per un lungo periodo di tempo. Il presente studio è stato progettato per dimostrare l’associazione tra l’acefato, un OP con la qualità dello sperma, e i danni al DNA nello sperma in diversi punti di incubazione. I risultati ottenuti dal presente studio hanno indicato che l’acefato compromette la motilità dello sperma, la vitalità degli spermatozoi, l’integrità della membrana e la capacitazione degli spermatozoi e induce danni al DNA in vitro. Risultati simili sono stati ottenuti con idrocarburi clorurati, organofosfati, e metaboliti del benzene.

La significativa riduzione della motilità degli spermatozoi osservata in entrambe le dosi medie (100 μg/mL) e alte (200 μg/mL) di acefato potrebbe risultare in una compromissione della capacità di fecondazione dello sperma. Dopo 3 ore di esposizione alla dose più alta, la percentuale di motilità degli spermatozoi è stata ridotta al di sotto dei valori raccomandati dall’OMS. La motilità degli spermatozoi è considerata uno dei rivelatori più sensibili degli effetti citotossici dello sperma e della riduzione della capacità di fecondazione dello sperma. I cambiamenti nel potenziale di membrana mitocondriale da diversi pesticidi potrebbero portare alla riduzione della motilità degli spermatozoi. La motilità degli spermatozoi dipende anche dall’intensa trasformazione e dal dispendio di energia prodotta attraverso le vie ossidative dei mitocondri e i pesticidi potrebbero interferire con le vie ossidative producendo un ritardo nella motilità degli spermatozoi, portando infine alla morte cellulare. Inoltre, i metaboliti dei pesticidi potrebbero interferire con le reazioni ossidative mitocondriali portando alla produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) in eccesso, diminuendo la produzione di ATP con conseguenti problemi di motilità. Lo stress ossidativo è stato segnalato per essere il meccanismo primario di organofosfato compresa la tossicità acefato. La perdita di integrità può portare ad un aumento della permeabilità della membrana e alla perdita della capacità di regolare le concentrazioni intracellulari di ioni coinvolti nel controllo del movimento dello sperma. L’effetto complessivo del danno alla membrana potrebbe essere responsabile della continua diminuzione della motilità e della vitalità degli spermatozoi dopo l’eiaculazione.

La vitalità è la proporzione di spermatozoi vivi determinata dalla valutazione dell’integrità cellulare e/o della membrana. Il test di colorazione eosina ha fornito informazioni sull’integrità strutturale della membrana spermatica, mentre il test HOS ha fornito informazioni sull’integrità funzionale della membrana spermatica. La vitalità degli spermatozoi è associata a membrane plasmatiche intatte, funzionali e semipermeabili. I pesticidi potrebbero indurre l’aumento di ioni calcio causando danni alle membrane spermatiche, influenzando così la vitalità degli spermatozoi molto prima che raggiungano l’ovocita. I cambiamenti nella membrana plasmatica osservati nel presente studio potrebbe comportare una riduzione della motilità degli spermatozoi, la vitalità e l’integrità della membrana.

Hyperactivation è in un’indicazione di completamento dello sperma di capacitazione ed è essenziale per la penetrazione attraverso la massa cumulo e zona pellucida. Nel presente studio è stato dimostrato che gli spermatozoi iperattivati sono diminuiti in alta concentrazione e sono diminuiti con l’aumento del tempo di incubazione, indicando una compromissione della capacitazione dello sperma. La membrana dello sperma e i mitocondri sono essenziali per alimentare l’iperattivazione e qualsiasi danno alla membrana dello sperma e ai mitocondri dello sperma può portare alla riduzione degli spermatozoi capacitati. OP è noto per compromettere la capacitazione attraverso l’inibizione di AchE quando incubato con lo sperma in vitro. Tuttavia, con l’aggiunta di quantità sufficienti di AchE o AchE enzimi mimici al mezzo, l’effetto è stato invertito, indicando così l’importanza dell’attività di AchE della membrana spermatica per avviare la capacitazione.

Il presente studio rivela un danno significativo al DNA a doppio filamento al massimo dosaggio (200 μg/mL) dopo 3 ore di incubazione. L’integrità del DNA dello sperma è vitale per trasmettere le informazioni genetiche durante la riproduzione e qualsiasi danno al DNA potrebbe provocare infertilità. Le basi del DNA e le ossa fosfodiestere sono particolarmente suscettibili ai danni indotti dallo stress ossidativo perché le loro membrane plasmatiche contengono grandi quantità di acidi grassi polinsaturi e il loro citoplasma contiene basse concentrazioni di enzimi spazzini. Quindi, alti livelli di ROS potrebbero portare a rotture del DNA a doppio filamento comunemente osservate negli spermatozoi di uomini infertili. È stato registrato che l’acefato aumenta significativamente le specie reattive dell’ossigeno cellulare (ROS) con conseguenti modifiche del DNA formando errori di coppia di base e rotture del filamento. Gli spermatozoi frammentati nel DNA sono meno mobili e meno suscettibili al rigonfiamento ipoosmotico che indica una minore integrità funzionale della membrana spermatica, portando così alla riduzione della funzione spermatica con l’aumento del danno al DNA. I pesticidi che inducono danni al DNA nei leucociti potrebbero anche portare a danni al DNA negli spermatozoi.

5. Conclusioni

Il presente studio è suggestivo della possibile compromissione della funzione dello sperma con l’esposizione all’acefato. L’alta concentrazione di acefato (200 μg/mL, che è equivalente a LD50) testata in questo studio ha alterato la motilità degli spermatozoi umani, la vitalità, l’integrità funzionale della membrana plasmatica e la capacitazione dello sperma e ha indotto danni al DNA in vitro. Dopo aver considerato i risultati e le risposte biologiche umane naturali come la degradazione e l’eliminazione delle sostanze chimiche, si potrebbe raccomandare che il dosaggio più alto testato (200 μg/mL) e oltre può causare un rischio per la salute umana.

Abbreviazioni

BWW:	Biggers Whitten Whittingham
HOS:	soluzione ipoosmotica
NaCl:	Cloruro di sodio
OP:	Pesticida Organofosfato
ROS:	Specie di ossigeno reattivo.

Approvazione etica

L’approvazione etica è stata ottenuta dal comitato di revisione etica, Facoltà di Scienze Mediche, Università di Sri Jayewardenepura, Nugegoda, Sri Lanka. Il numero di autorizzazione etica è 712/13.

Conflitti di interesse

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interesse riguardo alla pubblicazione di questo articolo.

Riconoscimenti

La preziosa assistenza fornita dalla professoressa Neelika Malavige, Dipartimento di Microbiologia, Facoltà di Medicina, Università di Sri Jayewardenepura, per aver fornito l’incubatrice di biossido di carbonio e il Dipartimento di Zoologia, Facoltà di Scienze, Università di Colombo, per aver fornito i prodotti chimici per il progetto è altamente apprezzata.