Effetti delle statine sull’angiogenesi e sulla vasculogenesi | Revista Española de Cardiología

Fig. 1. Statine, segnalazione Akt e angiogenesi/vasculogenesi. L’angiopoietina 1 (Ang-1), il VEGF e il fattore di crescita dei fibroblasti (FGF), quando sono legati ai loro recettori di membrana, inducono la conversione del fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato (PIP2) in fosfatidilinositolo 3,4,5-trifosfato (PIP3) tramite la fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K). La formazione di PIP3 è necessaria per la fosforilazione della proteina chinasi Akt da parte della chinasi PDK-1. Il trattamento con statine aumenta la fosforilazione di Akt, mentre la wortmanina (un inibitore di PI3K) la previene. Il mevalonato, il prodotto della HMG-CoA reduttasi, inibisce anche PI3K e la conseguente fosforilazione di Akt. Pertanto, le statine, inibendo la HMG-CoA reduttasi e la produzione di mevalonato, aumentano la fosforilazione di Akt e, allo stesso tempo, la fosforilazione e l’attivazione dell’ossido nitrico sintasi endoteliale (eNOS), la sintesi di ossido nitrico (NO), e una varietà di effetti fisiologici indotti nell’angiogenesi e nella vasculogenesi. Akt previene anche l’apoptosi delle cellule endoteliali.

E’ stato dimostrato recentemente che le statine stimolano anche la via di segnalazione intracellulare della protein chinasi Akt/PKB25-27 nelle cellule endoteliali25 e nelle cellule progenitrici endoteliali (EPC) del midollo osseo,26,27 inducendo così sia l’angiogenesi25 che la vasculogenesi.26 Gli effetti delle statine sulla cinetica delle EPC sono stati dimostrati anche nell’uomo da Vasa et al.28 Questo articolo esamina l’effetto delle statine sull’induzione dell’angiogenesi25 e della vasculogenesi26 attraverso meccanismi legati all’attivazione di Akt.25-27

ANGIOGENESI E VASCULOGENESI

Angiogenesi e vasculogenesi sono responsabili dello sviluppo del sistema vascolare nell’embrione.29-32 La vasculogenesi è il processo di formazione dei vasi sanguigni dalle cellule progenitrici endoteliali (angioblasti) che migrano e si fondono con altre cellule progenitrici endoteliali e si differenziano in cellule endoteliali formando nuovi vasi sanguigni. Al contrario, l’angiogenesi è il processo di estensione dei vasi sanguigni che si sono formati gemmando nuovi capillari attraverso la migrazione e la proliferazione di cellule endoteliali precedentemente differenziate (Figura 2).

Fig. 2. Rappresentazione schematica di angiogenesi e vasculogenesi. (A) La vasculogenesi è l’aggregazione di angioblasti o cellule progenitrici endoteliali per formare vasi sanguigni. Gli angioblasti si aggregano in situ o migrano per formare vasi sanguigni in siti lontani. (B) L’angiogenesi è la formazione di nuovi vasi sanguigni da vasi preesistenti attraverso la proliferazione e la migrazione di cellule endoteliali differenziate. (C) L’angiogenesi e la vasculogenesi possono avvenire anche contemporaneamente. (Tratto da Cleaver et al.29)

Inizialmente si pensava che il processo vasculogenico fosse limitato allo sviluppo embrionale, mentre l’angiogenesi (che avviene anche nell’embrione) era l’unico processo coinvolto nella neovascolarizzazione negli adulti. Tuttavia, il paradigma della neovascolarizzazione postnatale è stato rivisto di recente e si è scoperto che le cellule progenitrici endoteliali circolanti nel sangue periferico,33 sono incorporate dai focolai di neovascolarizzazione negli animali adulti,34 aumentano di numero in risposta all’ischemia dei tessuti,35 e promuovono lo sviluppo di vasi sanguigni collaterali dopo la loro espansione in vitro e il successivo trapianto.36 Questi studi hanno stabilito che sia l’angiogenesi che la vasculogenesi sono responsabili della neovascolarizzazione negli adulti.

Un terzo meccanismo che probabilmente contribuisce allo sviluppo dei vasi collaterali è l’aumento delle dimensioni e del calibro delle connessioni collaterali arteriolari preesistenti, un processo chiamato arteriogenesi.37 La presenza e il numero di questi vasi collaterali nativi variano ampiamente tra individui e specie. Quando un vaso si occlude, si verifica un aumento della velocità del flusso sanguigno attraverso i vasi collaterali preesistenti e un aumento dello stress di taglio luminale, fattori che contribuiscono alla maturazione dei vasi collaterali, in particolare quelli di dimensioni intermedie.

Metodi di studio in vitro

Lo sviluppo di tecniche di coltura di cellule endoteliali ha permesso di comprendere i processi coinvolti nell’angiogenesi.38 Le cellule endoteliali in coltura conservano la capacità di rispondere a fattori che stimolano o inibiscono l’angiogenesi, nonché la capacità di formare tubi endoteliali in vitro. I saggi di proliferazione cellulare permettono di analizzare l’effetto di una certa sostanza sulla proliferazione delle cellule endoteliali. La migrazione delle cellule endoteliali verso una soluzione contenente una certa sostanza, separate da una membrana permeabile, può essere esaminata in una camera di Boyden. I meccanismi di formazione dell’endotelio tubulare e l’effetto di una certa sostanza sui tubuli possono essere studiati usando saggi bidimensionali o tridimensionali. Con queste tecniche, si analizzano i processi di formazione del lume endoteliale e l’influenza della matrice extracellulare sullo sviluppo dei capillari.38 Infine, le colture di cellule endoteliali permettono lo studio delle vie molecolari coinvolte nei processi di angiogenesi.

Di recente, utilizzando tecniche di selezione cellulare e mezzi di coltura speciali, le tecniche sviluppate per studiare le cellule endoteliali differenziate sono state utilizzate per studiare le cellule progenitrici endoteliali.33-36

Metodi di studio in vivo

Anche se le tecniche in vitro permettono di fare un’analisi preliminare dell’angiogenesi e della vasculogenesi, sono molti i fattori che possono influenzare o modulare questi processi in vivo.38 Per studiare i meccanismi di formazione dei vasi sanguigni in vivo, sono stati sviluppati diversi sistemi biologici per quantificare o dimostrare l’effetto di una certa sostanza: modelli di cornea di topo, membrana corioalantoidea di embrione di pollo, o impianti spugnosi.38 Questi sistemi richiedono il sacrificio dell’animale quindi catturano solo l’effetto in un momento specifico. Per studiare l’evoluzione temporale degli eventi in un singolo tessuto, sono state sviluppate tecniche di microscopia intravitale per la pelle del dorso o del cranio del topo.39 Infine, lo sviluppo delle tecniche di ingegneria genetica ha permesso di studiare l’effetto della soppressione (knock-out) o dell’aggiunta (knock-in) di un gene ai processi di vasculogenesi e angiogenesi.

Lo studio della vasculogenesi postnatale e l’effetto di certe sostanze sui processi di vasculogenesi è stato possibile grazie all’uso di tecniche di citometria a flusso, di selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS), di tecniche speciali per la coltura di cellule progenitrici endoteliali (EPC) dal sangue periferico e di modelli di trapianto di midollo osseo murino.33-36 La FACS è usata per rilevare e quantificare le EPC nel sangue periferico usando anticorpi contro gli antigeni di superficie di queste cellule. L’influenza dei farmaci o dei fattori di crescita sul numero di queste cellule nel sangue periferico può essere analizzata in questo modo. Le tecniche speciali di selezione e coltura delle cellule sviluppate dal nostro gruppo hanno anche permesso di rilevare e quantificare le EPC. Nel modello murino di trapianto di midollo osseo, le cellule di midollo osseo di un donatore di topo sono trapiantate in un recettore di topo con un gene che codifica l’elaborazione di una sostanza che permette di rilevarla in seguito (Figura 3). Nel nostro caso il gene codificava l’elaborazione della beta-galattosidasi da parte delle cellule endoteliali. L’espressione selettiva si ottiene perché questo gene è regolato da un promotore specifico delle cellule endoteliali, Tie-2, nel donatore del topo. Pertanto, solo le cellule endoteliali del midollo osseo del donatore animale esprimeranno la beta-galattosidasi che può essere rilevata nel recettore animale. Se gli esperimenti biologici sopra descritti vengono eseguiti dopo il trapianto di midollo osseo nel recettore animale, possiamo analizzare l’influenza di una certa sostanza sulla vasculogenesi quantificando il numero di cellule progenitrici endoteliali derivate dal midollo osseo.

Fig. 3. Modello murino di trapianto di midollo osseo per lo studio della vasculogenesi. I donatori di midollo osseo utilizzati sono topi transgenici che esprimono costitutivamente il gene LacZ (che codifica la beta-galattosidasi) regolato da un promotore endoteliale specifico, Tie-2. Il midollo osseo viene estratto e trapiantato in un topo recettore il cui midollo osseo è stato irradiato subletalmente. Dopo un periodo di 4 settimane per ottenere la ricostituzione del midollo osseo trapiantato, uno o più interventi sono fatti nel recettore del topo (il caso mostrato è un modello corneale) per stimolare la neovascolarizzazione. Dopo questi interventi, gli animali vengono sacrificati e viene fatto uno studio istologico per rilevare l’espressione della beta-galattosidasi. Con la colorazione X-GAL, le cellule che esprimono la beta-galattosidasi acquisiscono un colore bluastro. L’uso di un promotore specifico per le cellule endoteliali permette di identificare le cellule blu che sono state incorporate nei focolai di neovascolarizzazione come cellule di stirpe endoteliale.

EFFETTO DELLE STATINE SULL’INDUZIONE DELL’ANGIOGENESI E DELLA VASCOLOGENESI

Indagini fatte nel nostro laboratorio e altrove hanno dimostrato che le statine stimolano la via di segnalazione intracellulare della protein chinasi Akt/PKB,25-27 che promuove sia l’angiogenesi25 che la vasculogenesi.26 Inoltre, Vasa et al sono stati in grado di dimostrare nell’uomo gli effetti delle statine sulla cinetica delle EPC.28

Effetti in vitro delle statine

Le statine attivano rapidamente la protein chinasi Akt/PKB nelle cellule endoteliali25 e nelle EPC,26,27 aumentando così la fosforilazione di eNOS e la conseguente produzione di NO. L’attivazione di Akt da parte delle statine promuove la proliferazione, la migrazione e la sopravvivenza cellulare delle cellule endoteliali e delle EPC, nonché la formazione della struttura vascolare. Inoltre, l’inibizione di Akt mediante l’uso di adenovirus che codificano forme dominanti negative di Akt causa l’inibizione degli effetti indotti dalle statine. Il potenziale delle statine nei processi di rigenerazione dei tessuti è stato dimostrato in precedenza negli osteoblasti. In queste cellule, le statine hanno aumentato la proliferazione e il livello di attività, aumentando di conseguenza la formazione dell’osso.40

Anche se i meccanismi di attivazione di Akt da parte delle statine non sono noti con precisione, è probabile che sia coinvolta la segnalazione della fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K) perché questo processo è bloccato da wortmanin e LY294002, due inibitori dell’enzima (Figura 1). Inoltre, l’inibizione della HMG-CoA reduttasi è necessaria, poiché l’attivazione di Akt da parte della simvastatina è stata inibita dall’aggiunta di mevalonato all’incubazione (Figura 1). Il mevalonato è necessario, non solo per la biosintesi del colesterolo, ma anche nella produzione di ubichinone, dolichols e isoprenoidi, che sono essenziali in diversi processi cellulari. Anche se le statine stabilizzano l’RNA messaggero (mRNA) dell’eNOS modificando la sintesi degli isoprenoidi,41 non abbiamo osservato cambiamenti nei valori della proteina sintasi eNOS. In questo senso, è importante sottolineare che l’aumento della concentrazione di mRNA era più tardi (24 h) rispetto all’attivazione della fosforilazione di eNOS da parte di Akt (15 min). Questo tempo di attivazione più breve è coerente con i cambiamenti indotti dalle statine nella produzione di NO e nella vasodilatazione osservata negli anulari aortici ex vivo.42

Effetti in vivo delle statine

Le statine e l’attivazione della segnalazione intracellulare di Akt promuovono l’angiogenesi in modelli di ischemia periferica sviluppati in conigli normocolesterolemici.25 Negli animali che hanno ricevuto statine, sono state osservate pressioni di perfusione più elevate, un maggior numero di vasi collaterali e una maggiore densità capillare (Figura 4). D’altra parte, le statine aumentano il numero di cellule progenitrici endoteliali nel sangue periferico sia nei topi26,27 che nell’uomo.28 Inoltre, le statine aumentano la neovascolarizzazione corneale nei topi normocolesterolemici, in parte grazie alla vasculogenesi dalle EPC ottenute dal midollo osseo (Figure 3 e 5).26 Utilizzando il modello murino di trapianto di midollo osseo, è stato possibile dimostrare un numero maggiore di EPC dal midollo osseo nelle cornee dei topi trattati con statine. Pertanto, le statine hanno un effetto importante sulla cinetica delle EPC, come era stato dimostrato in precedenza con VEGF o fattore stimolante le colonie di granulociti e monociti (GM-CSF),35 e la mobilitazione indotta dalle statine di queste cellule potrebbe aumentare la neovascolarizzazione postnatale.

Fig. 4. Aumento indotto dalla statina della neovascolarizzazione nella gamba di un coniglio in risposta alla resezione unilaterale dell’arteria femorale. a) L’arteria femorale e i suoi rami sono sezionati. Il trasferimento genetico all’endotelio è fatto con l’infusione di adenovirus che codificano la beta-galattosidasi (Ad-βgal) o Akt (Ad-myrAkt) nell’arteria femorale distale e l’incubazione durante 15 minuti mentre si chiude temporaneamente la vena femorale. b) Il terzo giorno, il muscolo gastrocnemio viene estratto e viene fatta la colorazione X-GAL per determinare la distribuzione transgenica in preparati istologici colorati con ematossilina-eosina. c) L’angiografia attraverso l’iliaco interno viene eseguita per analizzare la formazione di vasi collaterali in diversi gruppi di trattamento. Nelle angiografie fatte a 40 giorni, un aumento nella formazione di vasi collaterali è visibile negli animali che hanno ricevuto 0.1 mg/kg di simvastatina per iniezione intraperitoneale rispetto agli animali che sono stati intervenuti ma hanno ricevuto solo l’iniezione di soluzione salina. L’analisi quantitativa dei vasi collaterali è stata fatta nel gruppo di controllo, nel gruppo trattato con simvastatina e nel gruppo di animali che hanno ricevuto un’iniezione intramuscolare di Ad-VEGF. Il punteggio angiografico è stato analizzato nei gruppi sperimentali che hanno ricevuto un’infusione di soluzione salina, Ad-βgal e Ad-myrAkt 31 giorni dopo l’intervento. d) La colorazione per la fosfatasi alcalina nel muscolo adduttore della gamba ischemica ha rivelato una maggiore densità capillare nel gruppo di animali trattati con simvastatina rispetto al gruppo di controllo 40 giorni dopo la chirurgia. I dati di ogni esperimento sono presentati come media±SD (n=6 conigli in ogni gruppo di trattamento, *P25)

Fig. 5. Aumento della neovascolarizzazione corneale per vasculogenesi indotta dalla statina. a) Fotografie rappresentative che mostrano la neovascolarizzazione corneale (sinistra, veicolo; destra, simvastatina). b) Colorazione X-gal di cornee intere. I punti bluastri sono cellule che esprimono la beta-galattosidasi (sinistra, veicolo; destra, simvastatina). c) Microfotografie rappresentative dello studio istochimico della fluorescenza in cornee inserite in paraffina da topi Tie2/LacZ/BMT (sinistra, veicolo; destra, simvastatina). La presenza di cellule doppiamente positive è la prova che le cellule progenitrici endoteliali (EPC) ottenute dal midollo osseo sono state incorporate dai focolai di neovascolarizzazione (vasculogenesi). Il colore rosso in questo caso indica la beta-galattosidasi e il colore verde mostra il marcatore endoteliale specifico isolectina B4. Le cellule doppiamente positive (colore giallo) sono EPC ottenute dal midollo osseo che sono state incorporate dai nuovi vasi. d) Microfotografie rappresentative dello studio istochimico della fluorescenza in cornee intere da topi Tie2/LacZ/BMT (sinistra, veicolo; destra, simvastatina). Il colore rosso mostra la beta-galattosidasi e il colore verde mostra la lectina specifica marcatore endoteliale BS-1. e) Quantificazione delle EPC derivate dal trapianto incorporate nella neovasculatura. Espresso come il rapporto tra il numero di EPC e il numero totale di cellule endoteliali che formano i nuovi vasi. *P26)

CONCLUSIONI

Le statine promuovono la proliferazione, la migrazione e la sopravvivenza cellulare delle cellule endoteliali e delle EPC ottenute dal midollo osseo attraverso meccanismi legati all’attivazione della serina/treonina protein chinasi Akt o PKB. In modo simile al VEGF, le statine promuovono l’angiogenesi e la vasculogenesi. Pertanto, l’attivazione di Akt può essere responsabile di alcuni degli effetti benefici delle statine, tra cui la neovascolarizzazione postnatale.