EMBL – European Molecular Biology Laboratory

Informazioni sulla forma e la conformazione di una proteina così come l’interazione tra macromolecole possono essere ottenute dai coefficienti di sedimentazione e diffusione ottenuti da un esperimento di velocità di sedimentazione. I coefficienti di sedimentazione sono particolarmente utili per monitorare i cambiamenti di conformazione di una proteina. Il modello risultante per la forma complessiva della proteina o del complesso proteico può essere confrontato con le immagini ottenute dalla microscopia elettronica per valutare quanto quelle immagini siano applicabili al comportamento di queste particelle in soluzione.

Associazione

A differenza di altri metodi per lo studio dei processi di legame, il metodo dell’equilibrio di sedimentazione è particolarmente sensibile per lo studio di associazioni relativamente deboli con costanti di associazione (Ka) nell’ordine di 10-100 M-1. Tuttavia, possono essere studiati anche processi di legame con valori Ka significativamente maggiori di 107 M-1.

Lo strumento

L’ultracentrifuga analitica che abbiamo all’EMBL è una Beckman Optima XL-A. Lo strumento fa girare il campione di proteine sotto vuoto a una velocità e una temperatura controllate, mentre a tempi prestabiliti registra la distribuzione della concentrazione. A seconda del rotore, la velocità può raggiungere i 60.000 giri al minuto (che equivale a 250.000 x g). Per le misurazioni si usano celle speciali per resistere all’alto campo gravitazionale e che permettono il passaggio della luce attraverso il campione. Il campione vero e proprio è posto in una cavità a forma di settore inserita tra due finestre di quarzo (vedi Fig. 1). Questa cavità si trova in un centro di lega di alluminio o epossidico rinforzato. Le celle a doppio settore sono utilizzate anche per essere in grado di correggere l’assorbanza del solvente del campione. Queste celle permettono anche la misurazione delle differenze del coefficiente di sedimentazione e dei coefficienti di diffusione. I settori centrali hanno una lunghezza di percorso da 3 a 12 mm che, combinata con le lunghezze d’onda selezionabili, permette l’esame di una vasta gamma di concentrazioni di campioni. Per sapere come assemblare una cella, vai al protocollo di assemblaggio.