Emerging evidences for the opposite ruolo dell’apolipoproteina C3 e dell’apolipoproteina A5 nel metabolismo dei lipidi e nella malattia coronarica

L’apolipoproteina C3 (apoC3) e l’apolipoproteina A5 (apoA5) sono codificate dai gruppi di geni APOA1/C3/A4/A5. Prove da studi genetici, epidemiologici ed esperimenti di base hanno costantemente dimostrato che apoC3 e apoA5 sono modulatori critici del metabolismo dei trigliceridi (TG) nel plasma. La carenza di apoC3 o apoA5 ha portato ad una significativa diminuzione o aumento del livello di TG nel plasma nell’uomo e nei topi. Studi meccanicistici approfonditi hanno rivelato che l’apoC3 ha inibito l’idrolisi dei TG nel plasma, l’assorbimento delle lipoproteine residue e ha promosso la secrezione epatica dei TG, mentre l’apoA5 ha regolato il metabolismo dei TG nel plasma in modo completamente opposto. Studi recenti hanno ulteriormente rivelato il ruolo aggiuntivo di apoC3 e apoA5 nel colesterolo residuo (RC), lipoproteine ad alta densità (HDL) e il metabolismo epatico TG. Inoltre, studi genetici di popolazione su larga scala hanno indicato che la perdita di mutazioni di funzione nel gene APOC3 e APOA5 ha conferito un rischio ridotto e aumentato di malattia coronarica (CAD), rispettivamente. Così, apoC3 e apoA5 emergono come potenziali nuovi obiettivi per ridurre il rischio cardiovascolare. Questo manoscritto ha esaminato principalmente le evidenze esistenti che suggeriscono il ruolo opposto di apoC3 e apoA5 nel metabolismo lipidico e il rischio CAD, e ha discusso la potenziale correlazione tra queste due apolipoproteine.

Struttura genica e regolazione dell’espressione

I cluster genici APOA1/C3/A4/A5 umani si trovano sul cromosoma 11q23, dove il gene APOC3 è circa 35 kbp a monte del gene APOA5. Le loro sequenze sono evolutivamente conservate. Le regioni di regolazione del gene APOC3 umano contengono un insieme di promotore prossimale con quattro elementi (- 283/+ 24) e un enhancer distale con sei elementi (- 890/- 500). Precedenti studi su animali e colture cellulari hanno stabilito che l’enhancer APOC3 ha agito come una sequenza di regolazione comune per dirigere l’espressione dei geni APOA1, APOC3 e APOA4 epatici e intestinali. Tuttavia, una sufficiente espressione del gene APOA5 specifica per il fegato è stata ottenuta in vivo con un frammento di 26 kb di DNA XhoI contenente solo il gene APOA5 e quindi privo dell’enhancer APOC3. Gao et al. hanno ulteriormente confermato che l’enhancer APOC3 non ha influenzato l’espressione di APOA5 nei topi transgenici. In realtà, due elementi nella regione del promotore di APOA5 sono stati trovati critici per dirigere la sua espressione nelle linee cellulari epatiche umane.

L’iniziazione dell’espressione genica è eseguita dal legame specifico dei fattori di trascrizione agli elementi di regolazione del gene, e le molecole che influenzano questo processo possono regolare l’espressione del gene corrispondente. La struttura concreta e i meccanismi di regolazione dell’espressione genica di APOC3 e APOA5 sono stati rivisti altrove, e qui ci concentreremo sui regolatori che sono condivisi da APOC3 e APOA5. Infatti, diverse molecole sono state implicate nella stessa direzione di regolazione dell’espressione di APOC3 e APOA5, tra cui l’upregolazione con il fattore nucleare epatocitario 4-α (HNF4-α) e il glucosio, e la downregulation con AMP-activated protein kinase, insulina e tumor necrosis factor-α (TNF-α). Notevolmente, queste sostanze, tranne il TNF-α, sono tutti componenti importanti direttamente coinvolti nel metabolismo del glucosio, suggerendo APOC3 e APOA5 disregolazione può contribuire alla dislipidemia diabetica. Regolazione di direzione opposta è stato trovato anche in che peroxisome proliferator-activated receptor-α (PPAR-α) e farnesoid X-activated receptor (FXR) promosso APOA5 mentre inibito APOC3 espressione. A differenza di APOA5, il promotore del gene APOC3 umano non contiene elementi di risposta positiva PPAR-α e FXR. In realtà, questi due recettori nucleari hanno agito indirettamente interferendo il legame di altri fattori trascrizionali, come HNF4-α, agli elementi specifici di APOC3, inibendo ulteriormente la trascrizione del gene APOC3. Così, l’effetto di abbassamento del TG plasmatico dei fibrati, un tipo di agonisti PPAR-α, può essere in parte mediato dall’aumento della concentrazione circolante di apoA5 e/o dalla diminuzione dei livelli di apoC3. Infatti, studi recenti hanno mostrato che sia i fenofibrati che la terapia con acidi grassi polinsaturi omega-3 hanno diminuito significativamente i livelli plasmatici di apoC3 nell’uomo.

Metabolismo lipidico plasmatico

Distribuzione delle lipoproteine

L’apoC3 e l’apoA5 circolanti erano principalmente associati alle proteine ricche di trigliceridi (TRL) e alle HDL. Gli studi hanno mostrato che sia l’apoC3 che l’apoA5 erano scambiabili tra TRL e HDL. Nello stato di normolipidemia dei soggetti umani, la maggior parte del plasma apoC3 era legata alle HDL. Al contrario, nei soggetti con ipertrigliceridemia (HTG), l’apoC3 si trovava principalmente sulle lipoproteine a densità molto bassa (VLDL). Con l’aumento della concentrazione di TG nelle emulsioni artificiali di TG, una frazione maggiore di apoC3 si è spostata dalle lipoproteine plasmatiche native alle emulsioni artificiali. Glangeaud et al. trovato durante l’idrolisi mediata lipoproteina lipasi (LPL) di VLDL, apoC3 ridistribuito da VLDL a HDL in studio in vitro, con la quantità che era proporzionale alla grandezza di idrolisi TG in VLDL, e apoC3 è stato successivamente trasferito di nuovo a nuove particelle VLDL sintetizzato TG arricchito. Analogamente, Nelbach et al. hanno dimostrato che l’apoA5 era prevalentemente associata alle HDL nei topi transgenici APOA5, che avevano VLDL ricche di TG, ma era rapidamente ed efficientemente ridistribuita alle VLDL ricche di TG isolate dai topi APOA5 knockout dopo l’incubazione. Shu et al. hanno anche riferito che l’iniezione endovenosa di HDL ricostituite contenenti apoA5 in topi APOA5 knockout ha mostrato lo stesso modello di scambio di apoA5 tra HDL ricostituite e VLDL, e apoA5 è rimasto ancora associato al VLDL ricco di TG a causa dell’interruzione dell’idrolisi VLDL.

Questi risultati hanno suggerito che le distribuzioni lipoproteiche di apoC3 e apoA5 erano strettamente associate al contenuto di TG nel TRL. La maggior parte di apoC3 e apoA5 erano in HDL quando c’erano bassi livelli di TG nel TRL. Una grande porzione di apoC3 e apoA5 si ridistribuiva dall’HDL alle particelle TRL quando le quantità di TG aumentavano nel TRL, e gradualmente tornavano all’HDL con l’elaborazione dell’idrolisi del TRL. Tuttavia, la funzione biologica e il meccanismo di regolazione del processo di scambio non sono stati ben chiariti.

TG plasmatici

ApoC3 e apoA5 sono determinanti critici della concentrazione plasmatica di TG come evidenziato da osservazioni genetiche negli esseri umani. Mutazioni di perdita di funzione nel gene APOC3 umano hanno conferito un basso profilo di TG nel plasma, mentre i pazienti con mutazione di deficit APOA5 avevano livelli di TG nel plasma estremamente elevati. Anomalie in apoC3 e apoA5 sono stati associati a diverse forme di HTG, come iperchilomicronemia familiare, iperlipidemia combinata familiare, e disbetalipoproteniemia familiare. È interessante notare che studi recenti hanno mostrato l’esistenza di un singolo sito di glicosilazione alla treonina 74 della proteina apoC3, dando origine a quattro principali proteoforme nel plasma. La forma wild-type che non contiene una catena di glicani è comunemente indicata come apoC30a. Le altre tre hanno tutte una catena glicanica centrale costituita da un disaccaride O-linked galattosio legato alla N-acetilgalattosamina. ApoC30b è la proteoforma che contiene solo il nucleo del glicano, mentre apoC31 e apoC32 contengono ulteriori uno e due residui di acido sialico, rispettivamente. Inoltre, quattro principali proteoforme di apoC3 differentemente correlati ai livelli di TG a digiuno. È stato trovato che, utilizzando la misura immunoassay spettrometrico di massa, plasma apoC30a, apoC30b, e apoC31 aveva positivo, mentre apoC32 aveva relazione negativa con digiuno TG plasma, suggerendo che l’analisi delle singole isoforme di apoC3 potrebbe fornire informazioni più complete di concentrazione totale di plasma apoC3 solo.

Consistentemente, i topi knockout APOC3 avevano diminuito la concentrazione di TG (- 30%) rispetto ai compagni selvatici, mentre i topi transgenici APOC3 hanno mostrato un aumento del livello di TG nel siero (+ 200% al 2000%). D’altra parte, i knockout APOA5 avevano un aumento (+ 400%) dei livelli di TG, mentre i topi transgenici APOA5 mostravano una riduzione significativa (- 70%) di questo parametro lipidico.

Studi meccanicistici approfonditi hanno rivelato che apoC3 e apoA5 regolavano i livelli di TG nel plasma attraverso molteplici vie. ApoC3 ha inibito l’idrolisi del TRL mediata dalla LPL, la clearance dei residui di TRL circolanti e ha promosso la secrezione epatica di TG. È interessante notare che l’apoA5 ha regolato il metabolismo dei TG nel plasma in modo completamente opposto. Vale a dire, apoA5 ha accelerato l’idrolisi del TRL, l’assorbimento dei residui di TRL da parte del fegato mentre ha inibito la secrezione epatica di TG (Fig. 1).

Plasma RC

RC è definito come il contenuto di colesterolo totale del TRL, comprese le VLDL e le lipoproteine a densità intermedia (IDL) nello stato di digiuno, e VLDL, IDL, e resti di chilomicroni nello stato non digiuno. Prove crescenti hanno indicato che RC è un fattore di rischio causale indipendente di cardiopatia ischemica. Inoltre, elevati livelli di RC sono stati associati a un aumento della mortalità per tutte le cause nei pazienti con cardiopatia ischemica.

Poiché apoC3 e apoA5 regolano i metabolismi TRL, non è inaspettato trovare che le varianti del gene APOC3 e APOA5 sono state associate ai livelli di RC. In una meta-analisi di 137.895 individui, RC era 43% più basso in APOC3 perdita di funzione eterozigoti rispetto ai non portatori. Al contrario, combinazioni di genotipi di varianti comuni di APOA5 (c.-1131 T > C, S19 W, e c.*31C > T) associate ad aumenti di RC fino al 56%. Quindi, il targeting apoC3 o apoA5 sembra essere un potenziale approccio per ridurre i livelli plasmatici di RC, che potrebbe essere testimoniato in studi futuri.

HDL

HDL esercita varie proprietà atero-protettive, tra cui la mediazione dell’efflusso del colesterolo, la protezione dell’endotelio vascolare, effetti antinfiammatori e anti-apoptotici . Le HDL con carenze in queste proprietà sono definite HDL disfunzionali, che a loro volta contribuiscono alla progressione della CAD. Gli studi di osservazione umana hanno indicato che queste proprietà sono difettose in condizioni patologiche. Per esempio, una ridotta capacità di efflusso del colesterolo è stata trovata nelle HDL di pazienti uremici. Riwanto et al. hanno scoperto che l’HDL dei pazienti CAD non attiva le vie anti-apoptotiche endoteliali, ma piuttosto stimola potenziali vie pro-apoptotiche endoteliali. Con la spettrometria e le analisi biochimiche, gli studi hanno ulteriormente indicato che la compromissione della funzione HDL è strettamente correlata all’alterazione della sua composizione proteomica, tra cui i cambiamenti di apoC3 e apoA5 hanno guadagnato molte attenzioni.

Riwanto et al. hanno trovato che c’erano apoC3 significativamente più elevati nelle particelle HDL dei pazienti CAD rispetto ai controlli sani. Inoltre, usando l’anticorpo che neutralizza l’apoC3 in queste HDL ha migliorato la funzione di apoptosi anti-endoteliale mediata dalle HDL. Cho KH ha mostrato che l’aumento del contenuto di apoC3 nelle HDL artificiali ricostituite ha ridotto la sua capacità di attivazione della lecitina colesterolo aciltransferasi (LCAT). È interessante notare che Luo M et al. hanno dimostrato che il contenuto di ApoC3 nelle HDL è stato associato negativamente alla capacità di efflusso del colesterolo mediata dalle HDL, tuttavia, il meccanismo sottostante è sconosciuto. Al contrario, la sovraespressione mediata da adenovirus di APOA5 nei topi ha portato ad un aumento di apoA5 nelle HDL, associato ad una maggiore capacità di efflusso del colesterolo. Le HDL ricostituite sintetizzate con più apoA5 avevano una dimensione delle particelle più grande, più contenuto lipidico e una migliore capacità antiossidante contro le LDL in vitro.

Il ruolo definito di apoC3 e apoA5 nella funzione HDL deve essere ulteriormente esaminato. È stato riportato che l’apoC3 nelle HDL può legarsi al recettore scavenger B1 (SR-B1), con un dominio di struttura non caratterizzato. SR-B1 è noto come un elemento importante nel trasporto inverso del colesterolo in parte per facilitare l’assorbimento selettivo di esteri di colesterolo da HDL da parte del fegato. Se questa interazione di apoC3 con SR-B1 possa influenzare il trasporto inverso del colesterolo è indeterminato.

Secrezione epatica di VLDL

Una delle principali funzioni del fegato è quella di sintetizzare e secernere VLDL. Le VLDL sono composte da un nucleo di lipidi neutri, soprattutto TG, e da diverse apolipoproteine. Di queste, l’apolipoproteina B100 (apoB100) è la più importante e fornisce stabilità strutturale alla particella VLDL. Ci sono due fasi per la biogenesi delle VLDL. Inizialmente, la formazione delle VLDL inizia con la sintesi dell’apoB100 nel reticolo endoplasmatico (ER). L’apoB100 nascente viene poi parzialmente lapidato per formare una particella VLDL primordiale povera di lipidi, che è facilitata dalla proteina di trasferimento dei trigliceridi microsomiale (MTP). Nella seconda fase della formazione delle VLDL, la particella VLDL primordiale si fonde con particelle ricche di trigliceridi per formare VLDL mature ricche di TG. Evidenze crescenti hanno indicato che apoC3 e apoA5 regolano la lipidazione delle VLDL e influenzano il contenuto epatico di TG (Fig. 1).

Dati da colture cellulari, esperimenti su animali e studi umani hanno confermato che apoA5 inibisce la secrezione di VLDL-TG e promuove l’immagazzinamento di TG nella goccia lipidica citosolica. Le cellule McA-RH7777 trasfettate in modo stabile con APOA5 umana secernono VLDL che erano più piccole di quelle delle cellule di controllo, ma avevano un maggiore livello di TG cellulare e goccioline lipidiche più grandi. Al contrario, Ress et al. hanno riferito che il knockdown di APOA5 nelle cellule HepG2 ha portato a una diminuzione del contenuto di TG cellulare. I fegati dei topi transgenici APOA5 avevano un aumento del livello epatico di TG rispetto ai compagni di cucciolata selvatici. Qin et al. hanno trovato pazienti con malattia non alcolica del fegato grasso (NAFLD) hanno un’elevata espressione di APOA5 rispetto ai controlli sani. Tuttavia, ci sono ancora alcuni enigmi necessari per essere ulteriormente chiariti. In primo luogo, come fa una porzione di apoA5 sfuggire via di secrezione nel sangue e diventare associato con goccioline lipidiche citosolico? Inoltre, come fa l’apoA5 a promuovere lo stoccaggio epatico dei TG nelle gocce lipidiche (LD) invece della secrezione sotto forma di VLDL.

Inversamente, studi in vivo e in vitro hanno dimostrato che l’apoC3 ha un effetto stimolante sulla lipidazione delle VLDL. Nutrire i topi knockout APOC3 con una dieta ad alto contenuto di grassi per due settimane non è riuscito a stimolare la produzione di VLDL-TG, mentre la ricostituzione dell’espressione APOC3 utilizzando adenovirus che codifica l’apoC3 umano ha portato ad una robusta produzione di VLDL-TG. L’effetto stimolatorio dell’apoC3 umana sulla lipidazione della VLDL è stato ricapitolato nelle cellule McA-RH7777 in condizioni ricche di lipidi. Inoltre, la mutazione diretta dei residui nel dominio di legame dei lipidi (K58E) di apoC3 ha abolito questo effetto stimolatorio. Questi risultati sono stati sostenuti negli esseri umani dalle osservazioni che due SNPs di APOC3 (C-482 T, T-455C), che portano alla diminuzione dell’espressione APOC3, sono stati correlati con un aumento del livello di TG epatico e una maggiore prevalenza di NAFLD nella popolazione asiatica indiana.

La posizione subcellulare di apoA5 e apoC3 che regola la lipidazione VLDL sono proposti per essere il compartimento ER. Gao et al. hanno ipotizzato che apoA5 può facilitare le LD ER-luminali che gemmano verso l’esterno per formare LD citosolico e quindi ridurre il TG assemblato nelle particelle VLDL. Qin et al. hanno trovato apoC3 promosso la fusione di ER-luminale LD con particelle VLDL durante la lipidazione VLDL. Sono necessari studi approfonditi che si concentrino sulle basi molecolari alla base dell’effetto di apoA5 e apoC3 sulla lipidazione VLDL e sul metabolismo LD, il che fornirà una nuova comprensione dell’omeostasi epatica dei TG.

Associazione con CAD

CAD è diventata una delle principali cause di morte in tutto il mondo. Il colesterolo delle lipoproteine a bassa densità (LDL-C) è ben noto come un ruolo cruciale nella patogenesi della CAD, e l’abbassamento del plasma LDL-C si traduce in una significativa riduzione della morbilità e della mortalità della CAD. Tuttavia, è stato riferito che molti individui soffrono ancora di CAD nonostante il raggiungimento dell’obiettivo terapeutico per i livelli di LDL-C. Pertanto, gli sforzi sono in corso per identificare altri fattori di rischio modificabili per ridurre ulteriormente il rischio di CAD. I dati genetici della popolazione sono privi di confondimento e di causalità inversa, e sono quindi riconosciuti come un modo importante per identificare nuovi potenziali fattori di rischio di CAD.

Interessante, è stato dimostrato che i livelli plasmatici di apoC3 geneticamente ridotti sono stati associati a un minor rischio di CAD nell’uomo. Una mutazione senza senso del gene APOC3, R19X, è stata associata a una riduzione del 50% dei livelli di apoC3 circolanti. Ancora più importante, i portatori della rara variante R19X avevano una minore incidenza di calcificazione delle arterie coronariche e un minore rischio di CAD a 10 anni di Framingham. L’effetto cardioprotettivo di R19X e altre tre varianti rare, due mutazioni del sito di splice (IVS2 + 1G → A; IVS3 + 1G → T) e una mutazione missenso (A43T) nel gene APOC3, è stato recentemente confermato in due studi su larga scala. In uno studio come parte dell’Exome Sequencing Project del National Heart, Lung, and Blood Institute, circa 1 su 150 partecipanti era un portatore eterozigote di almeno una di queste quattro mutazioni, e i livelli circolanti di APOC3 nei portatori erano 46% inferiori ai livelli nei non portatori. Il rischio di CAD tra 498 portatori di qualsiasi mutazione APOC3 rara era 40% inferiore al rischio tra 110, 472 non portatori. Coerentemente, in una coorte di 75.725 partecipanti, le incidenze cumulative della malattia vascolare ischemica e della cardiopatia ischemica sono state ridotte negli eterozigoti per mutazioni di perdita di funzione in APOC3 (R19X o A43T o IVS2 + 1G → A) rispetto ai non portatori, con riduzioni di rischio corrispondenti di 41% e 36%. Notevolmente, è stato segnalato che c’era anche una tendenza per meno eventi avversi principali di malattia cardiovascolare nei pazienti con più alta proteoforma apoC32, mentre queste associazioni non sono state rilevate per le altre proteoforme apoC3, suggerendo apoC32 è più simile a una proteoforma di perdita di funzione.

Contrariamente, varianti APOA5 che portano a livelli di apoA5 diminuiti sono stati associati con un aumento del rischio CAD. L’associazione tra il polimorfismo promotore -1131 T > C del gene APOA5 e il rischio di CAD è stato dimostrato in una grande meta-analisi. L’odds ratio per CAD era 1,18 per allele C vs. T. Inoltre, diversi studi indipendenti hanno costantemente indicato che le varianti APOA5 erano significativamente associate al rischio di infarto miocardico (MI). Raffaele De Caterina et al. hanno trovato una forte associazione tra la variante del gene APOA5 -1131 T > C e l’insorgenza precoce del MI acuto. Jorgensen AB et al. hanno inoltre mostrato una variazione genetica nel gene APOA5 (c.-1131 T. C, S19 W, e c.*31C. T) associata ad un aumento del 87% del rischio di MI. Do R et al. hanno sequenziato gli esoni di APOA5 in 6721 soggetti con MI e 6711 controlli. Sono state identificate 46 varianti uniche non sinonime o splice-site a singolo nucleotide o frameshift indel con frequenza allelica < 1%. Inoltre, i portatori di queste mutazioni rare nel gene APOA5 (1.4% dei casi contro 0.6% dei controlli) erano a 2.2 volte aumentato rischio per MI rispetto ai controlli.

Inoltre, è stato suggerito gli effetti di apoC3 e apoA5 sul rischio CAD sono parzialmente mediati da cambiamenti nei livelli di RC plasma. Wulff AB et al. hanno trovato RC mediato il 37% del rischio inferiore osservato 41% di malattia vascolare ischemica e il 54% del rischio inferiore osservato 36% di cardiopatia ischemica in APOC3 perdita di funzione eterozigoti rispetto ai non portatori. Tuttavia, le varianti del gene APOA5 (c.-1131 T. C, S19 W, e c.*31C. T) che portano a RC geneticamente aumentato associato ad un aumentato rischio di MI . D’altra parte, le varianti del gene APOA5 (c.-1131 T. C, S19 W, e c.*31C. T) associate ad aumenti di RC fino al 56%, e con un corrispondente odds ratio per MI di 1.87 .

Correlazione potenziale tra apoC3 e apoA5

Siccome apoC3 e apoA5 regolano il metabolismo dei lipidi e si associano al rischio CAD in modo opposto, è ragionevole chiedersi se funzionano indipendentemente o in modo cooperativo. Alcuni risultati da topi genetici hanno suggerito una stretta relazione tra queste due proteine anche se non ci sono prove attuali che mostrano l’interazione diretta tra di loro. Pennacchio et al. hanno dimostrato che i topi transgenici e knockout APOA5 hanno ovviamente diminuito e aumentato il livello di proteina apoC3 epatica, rispettivamente, mentre non sono stati trovati cambiamenti significativi nell’abbondanza di mRNA apoC3. Infatti, le quantità di proteina apoC3 nel fegato sono state aumentate del 90% nei topi knockout APOA5 e diminuite del 40% nei transgenici APOA5 rispetto ai compagni di latta di tipo selvatico. Allo stesso modo, il livello di apoC3 nel siero è diminuito dopo la sovraespressione mediata da adenovirus di APOA5 umana nei topi. Questi risultati implicano che apoC3 può influenzare apoA5 a livello trascrizionale, e viceversa. Tuttavia, i meccanismi sottostanti sono sconosciuti.