Frontiers in Bioengineeringand Biotechnology

Introduzione

Le albumine del siero sono proteine comunemente usate nella bio-diagnostica e come modello nella ricerca sulle bio-interfacce (Rosi e Mirkin, 2005; Singh et al, 2005; Arcot et al., 2015). Tra questi, la sieroalbumina bovina (BSA) è la più economica e una proteina ampiamente utilizzata come agente bloccante nei test ELISA (Maingonnat et al., 1999). Nella diagnostica su carta, la BSA (Huang et al., 2018) aumenta selettivamente l’idrofobicità della carta per migliorare i biofluidi e il flusso di eluizione diminuendo l’assorbimento dei liquidi. La BSA protegge e aumenta la durata delle biomolecole funzionali essiccate sulla carta. La funzionalità e la longevità dell’immunoglobina G e dell’immunoglobina M essiccate su superfici trattate con BSA possono aumentare di un ordine di grandezza (van Remoortere et al., 2001). La BSA impedisce anche l’adsorbimento aspecifico delle proteine degli analiti per l’analisi quantitativa.

Molti articoli hanno ampiamente riportato il fenomeno di assorbimento delle molecole di BSA su diverse interfacce come l’oro (Dennison et al., 2017), la mica (Fitzpatrick et al., 1992), il silicio (Jachimska et al., 2016; Givens et al., 2017), e la cellulosa (Mohan et al., 2014; Lombardo et al., 2017). La conformazione della molecola di BSA adsorbita e la topologia dello strato formato sono fortemente influenzate da pH, forza ionica e temperatura. Le molecole di BSA mantengono la loro struttura nativa tra pH 4,0 e 8,0. Al di sotto di pH 4.0 e al di sopra di 8.0, le molecole di BSA cambiano la loro conformazione di ripiegamento che differisce dalla loro struttura nativa (Su et al., 1998a; Barbosa et al., 2010; Phan et al., 2015). Il punto isoelettrico della BSA è a pH 4,5. A questo pH, la carica superficiale netta diventa zero e le molecole di BSA si aggregano. L’aumento del pH aumenta la carica della BSA e la repulsione elettrostatica dominante stabilizza le molecole di BSA e impedisce l’aggregazione (Li et al., 2008).

Nonostante sia tra le proteine più studiate, rimangono molteplici domande sull’effetto che il pH e la forza ionica hanno sulla conformazione della BSA all’adsorbimento. In questo contesto, il concetto di copertura superficiale, definito unicamente dalla frazione di superficie o dalla densità di peso, manca di chiarezza. C’è la necessità di comprendere meglio le variabili che definiscono l’interfaccia solido-liquido della BSA per progettare robusti dispositivi bio-diagnostici.

Le molecole di albumina di siero bovino si adsorbono su un’interfaccia formando uno strato con uno spessore nella scala dei nanometri. Alcuni metodi di caratterizzazione come la riflettività (Su et al., 1998b, 2016; Raghuwanshi et al., 2017a, b), l’ellissometro, il microscopio a forza atomica (AFM), la risonanza plasmonica di superficie (SPR) e la microbilancia a cristallo di quarzo con dissipazione (QCM-D) possono misurare lo spessore dello strato proteico adsorbito alla scala nanometrica richiesta. In particolare, QCM-D può monitorare cineticamente il processo di assorbimento delle biomolecole misurando la massa proteica adsorbita ad un’interfaccia in nanogrammi (Kristensen et al., 2013; Luan et al., 2017). QCM-D permette il controllo della temperatura, della forza ionica e del pH dell’ambiente. La modalità di dissipazione di QCM rivela la rigidità degli strati proteici adsorbiti.

In questo studio, un comportamento reversibile pH responsive di molecole BSA adsorbiti all’interfaccia oro-salina è descritto. Lo strato di BSA adsorbito si comporta come una spugna sensibile al pH dove le molecole d’acqua adsorbono e desorbono a seconda del pH circostante tra 4 e 8. Questo lavoro monitora e quantifica il fenomeno di assorbimento dell’acqua nello strato di spugna BSA e chiarisce i meccanismi coinvolti a diversi pH e forza ionica. Il nostro obiettivo è descrivere la copertura della BSA all’interfaccia solido-liquido in termini di numero di molecole e peso/spessore dello strato. Questo per chiarire il concetto di copertura superficiale delle biomolecole e per chiarire il comportamento dinamico delle molecole di BSA adsorbite nel contesto della bio-diagnostica.

Materiali ed esperimenti

Materiali

L’albumina di siero bovino in polvere liofilizzata (97%) e il sale di cloruro di sodio (NaCl) (99,5%) sono stati acquistati da Sigma Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia). L’acido cloridrico (HCl) e l’idrossido di sodio (NaOH) sono stati acquistati da Merck Ltd. Tutte le sostanze chimiche sono di grado analitico e utilizzati senza alcuna purificazione.

QCM-D Misure

Microbalance a cristallo di quarzo con misure di dissipazione sono stati eseguiti su un E4-QCM-D strumento da Biolin Scientific Ltd. I sensori a cristallo di quarzo rivestiti d’oro sono stati utilizzati dopo la pulizia in una soluzione H2O2:NH3:H2O (1:5:5) per 15 minuti e seguita dalla pulizia UV-Ozone per 10 minuti.

I sensori d’oro sono stati posti in moduli di celle liquide. 1 mg/mL di BSA è stato sciolto nella soluzione salina (0,9% NaCl) e il pH della soluzione è stato impostato a pH 7,0 e 4,5. Separatamente, il pH della soluzione salina è stato regolato a 7.0 e 4.5. Le soluzioni preparate sono state fatte passare attraverso i moduli della cella liquida da una pompa peristaltica. I cambiamenti nella frequenza di risonanza del sensore al quarzo (F) e la dissipazione (D) rispetto alla frequenza fondamentale di 5 MHz e sei diversi overtones dispari (1, 3, 5, 7, 9, e 13) sono stati monitorati simultaneamente.

Prima una soluzione salina è stata pompata nella cella liquida e ha permesso di equilibrare per generare una linea di base stabile. In seguito, il BSA in soluzione salina è stato fatto passare attraverso la cella, e permettere alle molecole di BSA di adsorbire all’interfaccia dell’oro. La soluzione salina è stata poi pompata per rimuovere le molecole di BSA non attaccate. I cicli di risciacquo delle soluzioni saline a diversi pH e dell’acqua sono stati come segue:

Le variazioni ottenute nella frequenza di risonanza ΔF e la dissipazione ΔD sono state adattate dal modello Sauerbrey utilizzando il software Dfind.

Misurazioni DLS

La dispersione dinamica della luce (DLS) sulla BSA dispersa nella soluzione salina a diversi pH (4,5 e 7,0) è stata misurata su un analizzatore di particelle DLS (Brookhaven Nanobrook Omni). È stata utilizzata una sorgente di 40 mW (640 nm) di laser a semiconduttore rosso a temperatura controllata. Le misurazioni sono state eseguite tre volte e hanno fatto la media. Tutte le misurazioni sono state condotte a temperatura ambiente (22°C).

Misurazioni dell’angolo di contatto

L’angolo di contatto su oro e BSA adsorbito a diversi pH su un’interfaccia d’oro è stato misurato utilizzando un setup OCA 35 DataPhysics Instruments GmbH, Germania. Le misurazioni sono state condotte direttamente sulla superficie del sensore tolto dal setup QCM dopo la misurazione. Tutte le misurazioni sono state effettuate a temperatura ambiente (22°C). Un minimo di cinque misurazioni dell’angolo di contatto sono state eseguite sulla superficie del sensore e la media.

Microscopio a forza atomica (AFM)

Misurazioni di microscopia a forza atomica sono state condotte in modalità tapping con un JPK Nanowizard III AFM. I cantilever (AC160TS-R3) selezionati per l’imaging avevano una frequenza nominale di 300 kHz e una costante di molla di 26 N/m. L’imaging è stato eseguito sull’interfaccia d’oro nuda e sullo strato di BSA adsorbito a pH 4,5 sull’interfaccia d’oro. Le immagini sono state prese direttamente sulla superficie del sensore tolto dalla configurazione QCM dopo la misurazione. Tutte le misurazioni sono state eseguite a temperatura ambiente (22°C).

Risultati

Un fenomeno reversibile di assorbimento dell’acqua sensibile al pH delle molecole di BSA adsorbite all’interfaccia solido-liquido è stato studiato mediante QCM-D con cicli di risciacquo della soluzione salina a pH 7,0 e 4,5. L’oro è stato selezionato come interfaccia solida come la sua idrofobicità dirige l’adsorbimento di BSA (Lori e Hanawa, 2004; Phan et al., 2015; Ozboyaci et al., 2016). Gli strati di BSA adsorbiti a diversi valori di pH sono risciacquati con cicli alternati di soluzioni saline a pH 4,5 e 7,0. Inoltre, il risciacquo con acqua pura Milli-Q è stato condotto per valutare l’effetto della forza ionica ha sullo strato BSA adsorbito.

Figura 1 (in alto) mostra il cambiamento di frequenza (F5 e F7) per le molecole BSA adsorbite a 7,0 pH dalla soluzione BSA/salina seguita dal risciacquo con la soluzione salina originale (pH 7). Il successivo ciclo di risciacquo è stato eseguito con la soluzione salina a pH 4,5. Seguono poi cicli alternati di soluzioni saline a pH 4,5 e 7.

Nella Figura 1, dopo una linea di base iniziale stabile, è stata osservata una diminuzione improvvisa di F che indica l’adsorbimento delle molecole di BSA all’interfaccia oro-liquido. La F è diminuita fino a ΔF = -35,5 e si è stabilizzata. Dopo il risciacquo con soluzione salina (pH 7), la F è aumentata da ΔF = -35,5 a ΔF = -34,0 che mostra la rimozione delle molecole di BSA non adsorbite dalla superficie. Dopo il risciacquo con soluzione salina (pH 4,5), la F è ulteriormente aumentata a ΔF = -30,0, rivelando un ulteriore decadimento della massa dalla superficie del sensore. Sorprendentemente, i successivi cicli di risciacquo con soluzione salina (pH 7,0) diminuiscono F a ΔF = -34,0, il che significa un aumento della massa sulla superficie del sensore dovuto all’assorbimento delle molecole d’acqua nello strato di BSA. I successivi cicli di risciacquo salini seguono lo stesso cambiamento ciclico di massa all’interfaccia dell’oro.

Nel secondo esperimento, simile al primo, l’adsorbimento delle molecole di BSA a pH 4,5 è stato seguito da cicli di risciacquo salini a diversi pH (Figura 1: in basso). Le molecole di BSA adsorbite corrispondono alla diminuzione di F a ΔF = -38,5. Il risciacquo con soluzione salina (pH 4,5) rimuove la BSA non adsorbita (ΔF = -38,0).

Seguendo il risciacquo con soluzione salina (pH 7,0) aumenta ulteriormente la massa dello strato sulla superficie dell’oro che corrisponde alla diminuzione di F a ΔF = -43. L’aumento della massa è dovuto all’assorbimento delle molecole d’acqua nello strato di BSA. In seguito, il risciacquo con soluzione salina (pH 4,5) desorbe le molecole d’acqua e riporta il valore F a ΔF = -37. Ogni ciclo di risciacquo adsorbe e desorbe la stessa quantità di molecole d’acqua.

Nello stesso esperimento, l’effetto della forza ionica sullo strato di BSA adsorbito è stato studiato risciando lo strato con acqua pura. La figura 1 mostra l’adsorbimento di BSA a pH 7.0 e 4.5 seguito da cicli di risciacquo con soluzione salina a diversi pH e con acqua pura Milli-Q.

In entrambi i casi, il risciacquo con acqua aumenta il valore in ΔF = -29.2 (BSA adsorbita a pH 4.5) e -26.5 (BSA adsorbita a pH 7.0). Questo indica che il risciacquo con acqua diminuisce ulteriormente la massa che corrisponde a un ulteriore desorbimento delle molecole d’acqua dall’interfaccia. Ogni ciclo di risciacquo mantiene lo stesso comportamento nel cambiamento di massa che è dovuto all’assorbimento dell’acqua nello strato di BSA.

Interessante, in tutti gli esperimenti, i cicli alternati di risciacquo salino a pH 4,5 e 7,0 mostrano l’assorbimento reversibile delle molecole d’acqua nello strato di BSA adsorbito. Il risciacquo dello strato di BSA con soluzione salina a pH 7,0 adsorbe le molecole d’acqua all’interno della struttura dello strato di BSA che aumenta la massa dell’interfaccia solido-liquido. Al contrario, il risciacquo dello strato di BSA con soluzione salina a pH 4,5 desorbe le molecole d’acqua dallo strato di BSA, riducendo così la massa dell’interfaccia. L’assorbimento dell’acqua completamente reversibile misurato indica che le molecole di BSA non desorbire durante il risciacquo e la loro copertura superficiale rimane identica, solo il numero di molecole d’acqua nella interfase varia.

Il fenomeno di assorbimento dell’acqua su risciacquo salina (a pH diverso) si verifica solo a causa di strato BSA adsorbito ed è confermato da un esperimento separato risciacquo salina sul sensore oro nudo (materiale supplementare S1). Una linea di base stabile sulla frequenza del sensore d’oro nudo è mantenuta dalla soluzione salina (a pH 4,5). Successivamente, l’interfaccia d’oro è stato risciacquato con ciclo di risciacquo salina alternativa di pH 7,0 e 4,5 (materiale supplementare S1). I risultati mostrano chiaramente che il risciacquo salino alternativo a diversi pH non ha alcun effetto sulla frequenza del sensore d’oro. Pertanto, solo lo strato adsorbito BSA su oro mostra il cambiamento di frequenza su cicli di risciacquo salina a diversi valori di pH.

La massa adsorbita, la copertura superficiale e lo spessore dello strato adsorbito BSA sono estratti adattando il modello Sauerbrey ai dati QCM. Il modello viene utilizzato per adattare uno strato rigido in cui il valore di dissipazione è inferiore a 2, come osservato in tutti i nostri esperimenti (materiale supplementare S2). L’equazione di Sauerbrey è data da Δm = CΔfn, dove, C = 17,7 ng / Hz.cm2 è costante per il cristallo di quarzo rivestito in oro 5 MHz, n è il sovratono, Δm è la massa adsorbita e Δf è la variazione di frequenza.

Le molecole di BSA adsorbito fino ad una copertura di massa di 6,3 mg/m2 (spessore 5,6 nm) a pH 7,0 (Figura 2A). Il risciacquo dello strato di BSA pre-adsorbito con soluzione salina (pH 4,5) ha diminuito la copertura di massa a 5,6 mg/m2 e il suo spessore a 4,9 nm (Tabella 1), il che è dovuto al rilascio di molecole d’acqua dalla struttura dello strato di BSA adsorbito. Un ulteriore risciacquo con soluzione salina (a pH 7.0) ri-adsorbe le molecole d’acqua nella stessa quantità. La differenza di cambiamento di massa è Δm = 0,7 mg/m2.

Similmente nella Figura 2B, il risciacquo dello strato di BSA pre-adsorbito a pH 4.5 con soluzione salina (a pH 7.0) aumenta la massa adsorbita da 6.4 mg/m2 a 7.4 mg/m2 e lo spessore da 6.2 a 6.9 nm; ciò è dovuto all’assorbimento delle molecole d’acqua nello strato di BSA. Il ciclo di risciacquo della soluzione salina a diversi valori di pH ha mantenuto la differenza di cambiamento di massa di Δm = 1,0 mg/m2 che è 1,4 volte superiore al cambiamento di massa a pH 7,0 (0,7 mg/m2).

Il numero medio di molecole di acqua adsorbite/desorbite nello strato di BSA durante il ciclo di risciacquo della soluzione salina è calcolato dalla differenza di massa adsorbita a diversi pH (materiale supplementare S3). Lo strato di BSA adsorbito a pH 4,5 adsorbe/desorbe 3,3 × 1019 molecole d’acqua durante i cicli di risciacquo, che rappresenta 570 molecole d’acqua/molecola BSA (Tabella 1). Tuttavia, lo strato di BSA adsorbito a pH 7,0, adsorbe/desorbe 2,3 × 1019 molecole d’acqua, o 450 molecole d’acqua/molecola di BSA, durante il ciclo reversibile di risciacquo salino.

Le misurazioni di DLS (Dynamic Light Scattering) chiariscono lo stato aggregato e non aggregato della BSA in soluzione fisiologica a pH 4.5 e pH 7.0 (Figura 3). A pH 4,5, la DLS rivela che le molecole di BSA si aggregano e mostra distribuzioni di dimensioni multiple: 5 nm, 10 nm, 20 nm e 50 nm. Tuttavia, a pH 7.0, le molecole di BSA non si aggregano, a causa delle repulsioni elettrostatiche, e hanno distribuzioni dimensionali di 5 e 10 nm. Le dimensioni di 5 e 10 nm della BSA idratata sono paragonabili alle dimensioni e alla forma delle singole molecole di BSA (14 nm × 4 nm × 4 nm) (Anderegg et al., 1955; Wright e Thompson, 1975).

Le immagini del microscopio a forza atomica confermano l’adsorbimento della molecola BSA all’interfaccia dell’oro (Figura 4). Queste immagini dimostrano le differenze nella morfologia superficiale dell’oro nudo (Figure 4a,b) e la BSA adsorbita all’interfaccia dell’oro a pH 4.5 (Figure 4c,d). Confrontando le immagini ingrandite dell’oro nudo (Figura 4b) e della superficie assorbita dal BSA (Figura 4d) si notano le differenze tra le superfici. Anche se entrambe le superfici hanno particelle che le formano, la definizione e quindi il materiale ripreso è diverso. Le particelle della superficie d’oro nuda sono più definite (ad esempio, confini più netti tra le forme), il che indica un materiale più duro rispetto alla superficie rivestita di BSA. L’oro rivestito di BSA mostra la presenza di ulteriori aggregati di molecole di BSA. L’immagine AFM ingrandita dell’oro rivestito di BSA (Figura 4d) mostra che la dimensione laterale delle molecole di BSA aggregate varia tra 30 e 100 nm con un’altezza compresa tra 5-15 nm.

L’angolo di contatto formato da gocce d’acqua su due superfici: oro e BSA adsorbito su oro è stato misurato per chiarire la bagnabilità (Figura 5). Il sensore d’oro è idrofilo con un angolo di contatto di 66°. Tuttavia, lo strato di BSA adsorbito a pH 4,5 diventa più idrofilo quando l’angolo di contatto con l’acqua diminuisce a 60°, che diminuisce ulteriormente a 55° per lo strato di BSA adsorbito a pH 7,0. Un’osservazione simile è stata riportata per gli strati di BSA adsorbiti su una superficie di silicio quando l’angolo di contatto con l’acqua è diminuito da 57° (a pH 4,5) a 54° (a pH 7,0) (Jachimska et al., 2016). Il cambiamento dell’angolo di contatto e dello spessore dello strato per la BSA adsorbita a diversi pH indica differenze strutturali e topografiche durante il processo di adsorbimento all’interfaccia dell’oro.

Discussione

Il punto isoelettrico della BSA è tra pH 4.5-4.8; è il pH in cui la carica netta della molecola diventa zero. Vicino al punto isoelettrico, le molecole di BSA hanno meno repulsione elettrostatica intermolecolare. L’alta forza ionica della soluzione salina (0,15 M) gioca anche un ruolo nello schermare le cariche e nell’ostacolare le interazioni elettrostatiche. Pertanto, le molecole di BSA aggregano nella sospensione BSA/salina. Le misurazioni DLS (Figura 3A) confermano la presenza di aggregati di BSA di dimensioni fino a 60 nm nella sospensione BSA/salina a pH 4.5.

Durante l’adsorbimento del BSA (a pH 4.5) all’interfaccia dell’oro, non ci si aspetta un’attrazione elettrostatica del BSA verso l’interfaccia dell’oro. Tuttavia, una debole carica positiva della proteina globulare BSA può fornire una deriva sufficiente per l’adsorbimento ad un’interfaccia (Su et al., 1998a; Jachimska et al., 2016). Diversi articoli hanno precedentemente riportato che l’adsorbimento di BSA e proteine simili vicino al punto isoelettrico è guidato da interazioni idrofobiche che superano le interazioni elettrostatiche (Uyen et al., 1990; Tilton et al., 1991; Figueira e Jones, 2008; Norde, 2008; Jeyachandran et al., 2009; Rabe et al., 2011; Huang et al., 2017; Xu et al., 2018; Attwood et al., 2019). Le misurazioni dell’angolo di contatto (Figura 5) mostrano che l’interfaccia d’oro nuda è meno idrofoba, e l’albumina si lega con l’oro tramite interazioni idrofobiche (Norde e Giacomelli, 2000; Figueira e Jones, 2008). Dal momento che le repulsioni inter-BSA molecole sono schermati, le molecole idratate BSA adsorbire in grandi quantità (6,4 mg/m2) come aggregati e con più punti di contatto sull’interfaccia d’oro (Figura 6A). L’immagine AFM (Figure 4c,d) conferma l’adsorbimento e l’aggregazione delle molecole di BSA sull’interfaccia dell’oro. Le immagini AFM rivelano la dimensione laterale degli aggregati varia tra 30 e 100 nm con l’altezza distribuita tra 5 e 15 nm. Questo conferma che le molecole di BSA adsorbite sono una combinazione di conformazioni sia in piedi che piatte.

A pH 7,0, le molecole di BSA sono caricate negativamente. Questo crea una repulsione elettrostatica tra le molecole di BSA che ostacola l’agglomerazione di BSA in soluzione. Le misurazioni DLS mostrano la distribuzione di molecole di BSA non agglomerate di dimensioni 5 e 10 nm (Figura 3B). Queste dimensioni sono paragonabili a quelle delle singole molecole di BSA (14 nm × 4 nm × 4 nm) (Anderegg et al., 1955; Wright e Thompson, 1975). Durante l’adsorbimento della BSA sull’oro, una combinazione di repulsione elettrostatica e di interazioni idrofobiche forma uno strato di BSA all’interfaccia. La forte repulsione laterale intermolecolare tra le molecole di BSA adsorbite riduce la capacità di adsorbimento della BSA (5,6 mg/m2) all’interfaccia. Pertanto, le molecole BSA adsorbire come singole molecole (non aggregati) e formare un monostrato all’interfaccia oro (Figura 6A).

Negli esperimenti QCM-D (Figura 1), pre-idratati molecole BSA sono adsorbiti all’interfaccia. Dopo il risciacquo alternativo salino a diversi pH, lo strato di BSA adsorbe/desorbe ulteriormente le molecole di acqua. La BSA adsorbita a pH 4,5 intrappola e rilascia più molecole d’acqua (1,0 mg/m2) rispetto alle molecole di BSA adsorbite a pH 7,0 (0,7 mg/m2). La ragione è la quantità di BSA adsorbita a pH 4,5 (6,4 mg/m2) è maggiore di quella a pH 7,0 (5,6 mg/m2).

La massa secca calcolata (non idratata) delle molecole di BSA adsorbite per la copertura completa della superficie del sensore d’oro è di circa 2 mg/m2 (materiale supplementare S3). La massa secca calcolata è comparabile con la letteratura riportata (Jachimska et al., 2016). Quando una molecola di BSA secca è idratata, i suoi gruppi idrofili legati con l’acqua rapidamente. Il legame è dovuto alla struttura dipolare dell’acqua che interagisce con i gruppi polari nella BSA. Nella BSA idratata, alcune molecole d’acqua sono legate saldamente, mentre altre molecole d’acqua sono legate in modo lasco o sono semplicemente intrappolate tra la struttura ad anello della BSA. La quantità di acqua che idrata lo strato di BSA aumenta la frazione di massa adsorbita all’interfaccia. Nel ciclo di risciacquo salino a diversi valori di pH si verifica una ridistribuzione delle cariche sullo strato di BSA adsorbito. Questa ridistribuzione delle cariche crea un gradiente tra lo strato adsorbito di BSA e la soluzione bulk. Il gradiente agisce come forza motrice per intrappolare e rilasciare le molecole d’acqua vagamente legate dallo strato di BSA.

Lo spessore dello strato di BSA è valutato adattando il modello di Sauerbrey ai dati QCM-D (Figura 2). Lo strato di BSA idratato adsorbito a pH 4,5 e risciacquato con soluzione salina (pH 7,0) dà lo spessore maggiore di 6,9 nm (Figura 6B). La grande quantità di molecole di BSA adsorbite (6,4 mg/m2) intrappola molte molecole d’acqua che gonfiano lo strato di BSA. Risciacquando lo stesso strato con la soluzione salina (pH 4,5) si riduce lo spessore dello strato a 6,4 nm, il che è dovuto al rilascio di molecole d’acqua dallo strato. Un fenomeno simile si osserva per le molecole di BSA adsorbite a pH 7.0. Tuttavia, lo spessore dello strato di BSA è più sottile di quello dello strato di BSA adsorbito a pH 4,5 (Figura 6B).

Inoltre, lo strato di BSA adsorbito a entrambi i valori di pH rimane rigido e irreversibilmente attaccato durante i cicli di risciacquo salino. Solo l’assorbimento delle molecole d’acqua avviene durante la variazione del pH. La rigidità e l’irreversibilità della BSA adsorbita sono dovute alle grandi dimensioni e all’alto peso molecolare della BSA. La molecola di BSA forma una moltitudine di punti di contatto all’interfaccia oro-liquido tramite interazioni elettrostatiche e idrofobiche che impediscono il desorbimento delle molecole di BSA dall’interfaccia.

Lo strato di BSA non si stacca dall’interfaccia dell’oro anche con cambiamenti nella forza ionica della soluzione (risciacquo con acqua deionizzata). Il risciacquo con acqua non fa altro che desorbire più molecole d’acqua dallo strato di BSA e la massa sulla superficie del sensore diminuisce ulteriormente (Figura 2). Cambiando la forza ionica del BSA idratato con acqua pura si liberano più molecole d’acqua dallo strato. Lo strato di BSA si riduce ad uno spessore 4,8 nm (quando adsorbito a pH 4,5) e 4,3 nm (quando adsorbito a pH 7,0) come mostrato Figura 6B. Continuare i cicli di risciacquo salini produce lo stesso fenomeno reversibile di assorbimento dell’acqua.

Conclusione

L’albumina di siero bovino in soluzione salina (0.9% NaCl) è stata adsorbita all’interfaccia oro-liquido a pH 7.0 e 4.5. Il processo dinamico è stato misurato da QCM-D e confermato da AFM, DLS e misure di angolo di contatto. Un fenomeno di assorbimento dell’acqua reversibile, veloce e dipendente dal pH è stato osservato per lo strato di BSA adsorbito eseguendo cicli di risciacquo con soluzione salina a pH 4.5 e 7.0. Le molecole d’acqua idratano lo strato di BSA a pH 7.0 e lo disidratano a pH 4.5. Lo strato di BSA adsorbito a pH 4,5 è idratato da 1,4 volte più molecole d’acqua rispetto allo strato di BSA adsorbito a pH 7,0. Questo fenomeno è spiegato dalle diverse conformazioni adottate dalle molecole di BSA adsorbite a diversi pH. Vicino al punto isoelettrico a pH 4,5, le molecole di BSA si neutralizzano e adsorbono come aggregati in grandi quantità: 6,4 mg/m2. A pH 7,0, le molecole di BSA si caricano (repulsione elettrostatica) e adsorbono come strato di singole molecole a 5,6 mg/m2. Lo strato di molecole di BSA aggregate (a pH 4,5) adsorbite all’interfaccia dell’oro trattiene più molecole d’acqua (570 molecole d’acqua/BSA) rispetto allo strato di molecole individuali di BSA (a pH 7,0), che trattengono 450 molecole d’acqua/BSA. Cambiare la forza ionica risciacquando lo strato di BSA con acqua pura non fa che desorbire più acqua dalla struttura dello strato adsorbito. In tutti i casi, lo strato di BSA è rigido e irreversibilmente adsorbito sull’interfaccia dell’oro e solo le molecole d’acqua adsorbono/desorbono durante il ciclo di risciacquo. Il fenomeno osservato è importante per la comprensione fondamentale e per progettare nuovi dispositivi bio-diagnostici e sensori robusti.

Data Availability Statement

I dati grezzi che supportano le conclusioni di questo articolo saranno resi disponibili dagli autori, senza indebite riserve, a qualsiasi ricercatore qualificato.

Author Contributions

VR, CB, e BY hanno condotto gli esperimenti. VR e GG hanno eseguito l’analisi dei dati e scritto il manoscritto.

Finanziamento

Questo lavoro è stato sostenuto dall’Australian Research Council (ARC), Australian paper, Norske Skog, Orora e Visy attraverso l’Industry Transformation Research Hub grant IH170100020.

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Materiale supplementare