Frontiers in Endocrinologia

Introduzione

La malattia cardiovascolare (CVD) è la complicazione più comune e grave del diabete, portando a morte sostanziale, e disabilità tra i pazienti con diabete mellito di tipo 2. I pazienti con T2DM hanno un rischio da due a tre volte superiore di CVD rispetto a quelli senza T2DM (3, 4). Rispetto ai fattori tradizionali come la pressione sanguigna, lipidi e indice di massa corporea, composti endogeni di piccole molecole rilevate da approcci metabolomici sono più probabilità di riflettere lo stato cellulare relativo agli effetti congiunti di nutrizione cellulare, farmaci, inquinanti ambientali e altri fattori esterni (7). I metaboliti dell’acilcarnitina sono un gruppo di sostanze estere formate dalla combinazione di carnitina libera e acil-coenzima A (acil-CoA) prodotto dagli acidi grassi (8). Uno studio di coorte ha trovato che le concentrazioni plasmatiche di alcune acilcarnitine erano più alte nei pazienti T2DM rispetto alla popolazione non-T2DM (9). Inoltre, la concentrazione di acilcarnitine e mitocondriale 4-hydroxynonenal nel tessuto cardiaco di topi alimentati con fruttosio era superiore a quella del gruppo di controllo (10). Poiché il 4-idrossinenale è prodotto dalla perossidazione lipidica, l’aumento del 4-idrossinenale può suggerire un elevato stress ossidativo (11). Tuttavia, solo pochi studi clinici hanno indagato le associazioni tra acilcarnitine e CVD in T2DM. Infatti, rimane inconcludente se ci sono associazioni tra acilcarnitine e CVD in T2DM.

Pertanto, abbiamo condotto un’indagine trasversale basata su ospedale per stimare l’associazione tra metaboliti acilcarnitina e CVD in pazienti cinesi con T2DM.

Materiali e metodi

Metodo di studio e popolazione

Questo studio ha utilizzato un disegno di studio trasversale per esplorare l’associazione tra acilcarnitine e CVD nel T2DM. Abbiamo recuperato le cartelle cliniche elettroniche di 2.554 pazienti ricoverati con dati disponibili sui metaboliti dal principale database elettronico del Liaoning Medical University First Affiliated Hospital (LMUFAH), Jinzhou, Cina, che sono stati ammessi in ospedale da maggio 2015 ad agosto 2016 (12).

I criteri di inclusione sono stati stabiliti come segue: (1) età ≥ 18 anni; (2) diagnosi di T2DM; e (3) i metaboliti dell’acilcarnitina erano disponibili: acetilcarnitina (C2), propionilcarnitina (C3), butirrilcarnitina (C4), idrossibutirrilcarnitina (C4-OH), succinilcarnitina (C4DC), isovalerilcarnitina (C5), 3-idrossiisovalerilcarnitina (C5-OH), glutarilcarnitina (C5DC), tiglylcarnitina (C5:1), esanoilcarnitina (C6), ottanoilcarnitina (C8), decanoilcarnitina (C10), lauroilcarnitina (C12), miristoilcarnitina (C14), 3-idrossil-tetradecanoilcarnitina (C14-OH), tetradecanoildiacilcarnitina (C14DC), tetradecenoilcarnitina (C14:1), palmitoilcarnitina (C16), 3-idrossipalmitoilcarnitina (C16-OH), 3-idrossipalmitoleilcarnitina (C16:1-OH), ottadecanoilcarnitina (C18), carnitina arachidica (C20), carnitina behenica (C22), carnitina tetracosanoica (C24), carnitina esacosanoica (C26). I criteri di esclusione erano: (1) diagnosi di diabete di tipo 1; (2) gravidanza. Un totale di 741 pazienti T2DM che soddisfacevano l’inclusione e non avevano i criteri di esclusione sono stati inclusi nell’analisi.

L’approvazione etica dello studio è stata ottenuta dal Comitato etico per la ricerca clinica di LMUFAH e il consenso informato è stato rinunciato dal Comitato etico per la ricerca clinica di LMUFAH a causa della natura retrospettiva dello studio cross-sectional.

Raccolta dei dati e definizione clinica

I dati demografici e clinici sono stati recuperati dal principale database elettronico dell’ospedale, tra cui età, sesso, durata del diabete, complicazioni del diabete, uso di farmaci (farmaci antidiabetici, farmaci antipertensivi e farmaci per la riduzione dei lipidi), BMI, pressione sanguigna sistolica (SBP), pressione sanguigna diastolica (DBP), emoglobina glicata (HbA1c), trigliceridi (TG), colesterolo lipoproteico a bassa densità (LDL-C) e colesterolo lipoproteico ad alta densità (HDL-C).

CVD è stato definito come avere una precedente malattia coronarica (CAD), insufficienza cardiaca (HF) o ictus. Il BMI è stato calcolato come peso corporeo in chilogrammi diviso per il quadrato dell’altezza corporea in metri, espresso in kg/m2. Il sovrappeso è stato definito come BMI ≥ 24,0 kg/m2 ma <28,0 kg/m2, e l’obesità definita come BMI ≥ 28,0 kg/m2 come raccomandato dalla Chinese Diabetes Association per l’uso in cinese (13). Lo sfigmomanometro a mercurio calibrato è stato utilizzato per misurare SBP e DBP dopo che i pazienti si sono riposati per 5-10 minuti. Il sangue a digiuno notturno (almeno 8 ore di digiuno) è stato prelevato dai pazienti T2DM. Le misurazioni di HbA1c, TG, HDL-C e LDL-C sono state effettuate nel laboratorio biochimico del LMUFAH. In base al numero di atomi di carbonio nella catena del gruppo acilico, le acilcarnitine sono state classificate in tre gruppi: acilcarnitine a catena corta tra cui C2, C3, C4, C4-OH, C5, C5-OH, C5DC, C5:1, e C6; acilcarnitine a catena media compresi C8, C10, C12, C14, C14-OH, C14DC, e C14:1; acilcarnitine a catena lunga compresi C16, C16-OH, C16:1-OH, C18, C20, C22, C24, e C26 (14).

Quantificazione dell’acilcarnitina

Il metodo di dosaggio metabolomico era stato descritto in studi precedenti (15). Brevemente, campioni di macchie di sangue secco raccolti da puntura del dito dopo 8 ore di digiuno sono stati utilizzati il saggio metabolomics. Il metabolomics in macchie di sangue secco sono stati misurati utilizzando la tecnologia di spettrometria di massa (MS). L’analisi metabolomica MS è stata condotta utilizzando un sistema AB Sciex 4000 QTrap (AB Sciex, Framingham, MA, USA). La sorgente di ionizzazione Electrospray era fonte di ioni. La tensione dello spray ionico era di 4,5 kV. La modalità positiva è stata eseguita per la scansione degli analiti. La fase mobile che portava il componente da analizzare era una soluzione acquosa di acetonitrile all’80%. Per la quantificazione assoluta sono stati utilizzati standard interni di acilcarnitina marcati con isotopi da Cambridge Isotope Laboratories (Tewksbury, MA, USA).

Analisi statistica

L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando il sistema di analisi statistica Release 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Un P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. I dati categorici tra due gruppi sono stati confrontati con il test Chi-quadrato o il test esatto di Fisher, se del caso, ed espressi come quantità e percentuale. Il diagramma P-P o il diagramma Q-Q è stato usato per i test di normalità quando la variabile di analisi era una variabile continua. Le variabili continue conformi alla distribuzione normale sono state presentate come media ± deviazione standard (SD) e confrontate con il test t di Student, o come mediana con intervallo interquartile (IQR) altrimenti e confrontate con il Wilcoxon Signed Rank Test.

Per far fronte a confronti multipli, l’analisi dei fattori è stata utilizzata per ridurre un gran numero di acilcarnitine correlate a un numero minore di fattori non correlati. I test di Kaiser-Meyer-Olkin (KMO) e di sfericità Bartlett sono stati utilizzati per valutare l’idoneità all’analisi dei fattori (16). Un coefficiente KMO < 0,5 è considerato inaccettabile mentre valori intorno a 0,8 sono stati considerati meritevoli. L’analisi delle componenti principali è stata utilizzata per estrarre i fattori e per ottenere la matrice di caricamento dei fattori corrispondente. La rotazione Varimax ha ruotato la matrice iniziale di carico dei fattori per ottenere una soluzione più concisa e più facile da interpretare rispetto all’estrazione iniziale dei fattori (17). Le singole acilcarnitine che avevano il massimo carico per un fattore sono state utilizzate come componenti rilevanti del fattore. Lo scree plot è un grafico lineare degli autovalori dei fattori nell’analisi dei fattori (18). L’asse orizzontale dello scree plot è il numero di fattori e l’asse verticale è l’autovalore dei fattori. Il numero di fattori di acilcarnitina è stato determinato da autovalore, comunalità e scree plot: autovalore > 1, comunalità ≥ 50%, numero di fattori situati sul pendio ripido dello scree plot.

La regressione logistica binaria multivariabile è stata utilizzata per stimare gli odds ratio (OR) e i loro intervalli di confidenza al 95% (CI) dei fattori di acilcarnitina estratti per CVD in T2DM. Uno schema di aggiustamento strutturato è stato applicato per controllare gli effetti confondenti delle variabili demografiche e cliniche. In particolare, il modello 1 era un modello univariabile; il modello 2 è stato aggiustato per qualsiasi altro fattore di acilcarnitina; il modello 3 è stato ulteriormente aggiustato per età, sesso, BMI, durata del diabete, HbA1c, SBP, DBP, TG, LDL-C, HDL-C; e il modello 4 ulteriormente aggiustato per l’uso di farmaci, compresi i farmaci antidiabetici, farmaci antidiabetici e farmaci per abbassare i lipidi in aggiunta alle variabili aggiustate nel modello 3.

Risultato

Descrizione dei soggetti dello studio

L’età media dei pazienti dello studio era di 57,9 (SD: 14,1) anni, e la durata mediana del diabete era di 5 (IQR: 0-10) anni. Di loro, 391 (52,8%) erano maschi e 288 (38,9%) avevano CVD (87 con CAD solo, 109 con ictus solo, 6 con HF solo, 51 con entrambi CAD e ictus, 53 con entrambi CAD e HF, 18 con entrambi ictus e HF, e 18 con tutti) (Tabella 1, Foglio dati 1).

Rispetto al gruppo non-CVD, i pazienti T2DM con CVD avevano maggiori probabilità di essere più anziani e avevano una maggiore durata del diabete, più alta SBP, più basso HbA1c, e meno probabilità di utilizzare l’insulina. Questi pazienti tendevano ad avere LDL-C più bassi, tassi più bassi di uso di farmaci antidiabetici, tassi più alti di uso di farmaci per abbassare i lipidi e farmaci antipertensivi. Non c’erano differenze significative nel sesso, BMI, DBP, HDL-C e TG tra i due gruppi. C2, C4, C6, C8, C10, C12, C14, C14-OH e C14:1 erano più alti mentre C5-OH e C24 erano più bassi nei pazienti con CVD rispetto alle loro controparti senza. Altre acilcarnitine erano simili nei due gruppi (tabella 2).

Fattori estratti di acilcarnitine

I risultati dell’analisi dei fattori erano accettabili come suggerito da un alto coefficiente KMO di 0,898 e un valore P altamente significativo del test di sfericità di Bartlett di <0,0001. I fattori 1-5 avevano autovalori superiori a 1 e si trovavano sulla ripida pendenza dello scree plot (Figura 1). Quindi, abbiamo estratto cinque fattori e i caricamenti delle acilcarnitine sui cinque fattori dopo la rotazione varimax sono elencati nella tabella 3. Il fattore 1 comprendeva C2, C4, C4-OH, C5DC, C6, C8 e C14DC; il fattore 2 comprendeva C10, C12, C14, C14-OH, C14:1 e C16-OH; il fattore 3 comprendeva C16, C16:1-OH, C18, C20 e C3; il fattore 4 comprendeva C22, C24 e C26; il fattore 5 comprendeva C4DC, C5, C5-OH e C5:1. I cinque fattori hanno spiegato il 65,9% della varianza totale.

Associazioni tra fattori estratti e rischio CVD in T2DM

Fattori 1, 2 e 4 erano tutti positivamente associati con rischio CVD in T2DM in analisi univariata. Dopo l’aggiustamento per altri fattori, queste associazioni positive erano ancora significative (Modello 2). Tuttavia, solo il fattore 1 (OR: 1,42, 95% CI: 1,03-1,95) e il fattore 2 (OR: 1,24, 95% CI: 1,03-1,49) erano ancora positivamente associati al rischio di CVD dopo ulteriori aggiustamenti per età, sesso, BMI, durata del diabete, HbA1c, SBP, DBP, TG, LDL-C e HDL-C. Dopo l’aggiustamento finale per l’uso di farmaci, la dimensione dell’effetto del fattore 1 (OR: 1.45, 95% CI: 1.03-2.03) e fattore 2 (OR: 1.23, 95% CI: 1.02-1.50) erano in gran parte invariati (Tabella 4).

Analisi di sensibilità

Dopo l’imputazione media e l’imputazione multipla dei valori mancanti in HbA1c (n = 200), le dimensioni degli effetti dei fattori 1 e 2 per il rischio CVD nel T2DM sono rimasti stabili e significativi nelle analisi uni- e multivariabili (Tabella S1).

Discussione

Questo studio ha dimostrato che alcune acilcarnitine, cioè, C2, C4, C4-OH, C5DC, C6, C8, e C14DC nel fattore 1, e C10, C12, C14:1, C14, C14-OH, e C16-OH nel fattore 2, sono stati associati con il rischio di CVD in T2DM e le associazioni erano indipendenti da altri fattori acilcarnitine e tradizionali fattori di rischio CVD. Questi metaboliti di acilcarnitina estratti nel fattore 1 e 2 erano principalmente acil-carnitine a catena corta e media.

La via di approvvigionamento energetico dell’ossidazione degli acidi grassi a catena lunga nell’uomo è la seguente. Nelle cellule, l’acido grasso a catena lunga (FA) si combina con il coenzima A (COA) per formare l’acil-coenzima A a catena lunga (acil-COA) (19). La carnitina si combina con il gruppo acile dell’acil-COA a catena lunga per formare l’acilcarnitina a catena lunga tramite la carnitina palmitoiltransferasi 1 situata nella membrana mitocondriale esterna (20). Le acilcarnitine sono trasportate nei mitocondri tramite la carnitina acilcarnitina translocasi (CATC) (21). L’acilcarnitina a catena lunga viene decomposta in acil-CoA a catena lunga e carnitina dalla carnitina palmitoiltransferasi 2 nella membrana mitocondriale interna (22). L’acil-CoA a catena lunga è deidrogenato sotto l’azione dell’acil-CoA deidrogenasi a catena molto lunga per formare enoil-CoA (23). L’enoil-COA produce il 3-idrossiacil-CoA attraverso l’idratazione sotto la regolazione dell’enoil-CoA idratasi (23). Il 3-idrossi-acil-CoA è deidrogenato dalla 3-Idrossi-acil-CoA-Deidrogenasi a catena lunga per formare il 3-chetoacil-CoA (24). Il 3-chetoacil-CoA subisce la tiolisi da parte della letoacil-CoA tiolasi a catena lunga per produrre un acetil-CoA e un acil-CoA accorciato a due catene di carbonio (25). Il COA accorciato rientra in questo ciclo metabolico fino a che entra nella via di ossidazione degli acidi grassi a catena corta. Rispetto agli acidi grassi a catena lunga, gli acidi grassi a catena media e corta possono entrare direttamente nei mitocondri senza l’assistenza del CACT. Simile agli acidi grassi a catena lunga, gli acidi grassi a catena media e corta producono accorciato-COA rispetto e acetil-CoA sotto la catalisi combinata di alcuni enzimi simili. L’accorciato-COA rientra nel ciclo degli acidi grassi a catena corta fino a essere convertito in acetil-CoA. Infine, l’acetil-CoA prodotto nell’ossidazione dell’acido grasso fornisce energia partecipando al ciclo dell’acido tricarbossilico (Figura 2A).

Diversi studi hanno riportato una diminuzione dei tassi di ossidazione del glucosio, un aumento dei tassi di ossidazione di FA e del consumo di ossigeno del miocardio nei topi ob/ob e db/db (26, 27). Un team di ricerca americano ha tratto una conclusione simile misurando ripetutamente sopra i topi a diverse settimane di età (28). Il team sospettava, attraverso un ulteriore esperimento di PCR, che l’espressione genica coinvolta nell’assorbimento e nell’ossidazione del FA fosse fuori equilibrio, il che portava il FA a entrare nei cardiomiociti superando la capacità ossidativa mitocondriale. Inoltre, alcuni altri studi hanno trovato che i cardiomiociti dei ratti Zucker non erano significativamente aumentati in ossidazione rispetto all’aumento di FA a catena lunga nei cardiomiociti (29, 30). Uno studio ha determinato i livelli di FA nell’uomo e ha scoperto che anche se il tasso di ossidazione di FA è aumentato, la percentuale di quantità di ossidazione degli acidi grassi era inferiore a causa dell’aumento dell’assunzione (31). Inoltre, l’acil-CoA può accumularsi nel citoplasma se viene imposto un sovraccarico di FA (32). Coerentemente, l’analisi metabolomica ha trovato che rispetto ai pazienti non-T2DM, l’ossidazione degli acidi grassi a catena lunga nei pazienti T2DM erano incompleti, portando a livelli plasmatici significativamente aumentati di C6, C8, C10, C12 e C14 (33). Alcuni ricercatori hanno dimostrato che la percentuale di grasso corporeo era correlata positivamente ai livelli sierici di C2, C3, C4, C5, C6, C8:1 e C16:1 (34). Era probabile che il grasso corporeo più elevato fosse correlato a una beta ossidazione incompleta degli acidi grassi, che portava prevalentemente a maggiori quantità di acilcarnitina a catena corta o media. Hanno anche trovato che i livelli sierici di C2, C6, C8, C10, C12, C14, C14:1 e C14-OH erano aumentati nello stato prediabetico (34).

Perciò, sospettiamo che un tasso di ossidazione degli acidi grassi leggermente elevato dei cardiomiociti in pazienti con T2DM non può adeguatamente ossidare i FA liberi a catena lunga, accumulati nei cardiomiociti. I FA liberi accumulati inducono cardiotossicità. D’altra parte, la via di ossidazione degli acidi grassi a catena media e corta può essere inibita a causa dell’aumentato tasso di ossidazione degli acidi grassi a catena lunga. A causa di questa inibizione, il coenzima A a catena media e corta non viene sufficientemente convertito in acetil-CoA. Infine, l’acil-CoA cumulativo che lega la carnitina porta a un aumento delle acilcarnitine a catena media e corta (Figura 2B).

Ci sono state diverse limitazioni nel nostro studio. In primo luogo, il nostro studio era uno studio trasversale e non poteva stabilire relazioni causali tra le acilcarnitine e CVD in T2DM. In secondo luogo, i nostri soggetti erano ricoverati. Il loro T2DM erano più gravi rispetto ai pazienti con T2DM in generale. Pertanto, i nostri risultati non possono essere estrapolati alla popolazione generale di pazienti con T2DM. In terzo luogo, il nostro studio non ha raccolto fattori dietetici e l’abitudine alla dieta può essere uno dei principali confonditori nella nostra analisi (35). Tuttavia, avevamo accuratamente aggiustato per gli effetti potenzialmente confondenti di altri metaboliti dell’acilcarnitina e dei fattori demografici e clinici, inclusi, ma non limitati a, età, BMI, BP, HbA1c e profilo lipidico. Come “risultati” della dieta, l’aggiustamento per quei metaboliti dell’acilcarnitina e i fattori clinici può aver parzialmente rimosso gli effetti confondenti dell’abitudine alimentare. Tuttavia, abbiamo riconosciuto che, nonostante l’attento aggiustamento per questi fattori di confondimento, non possiamo escludere che ci fossero effetti di confondimento non aggiustati. Pertanto, i nostri risultati devono essere interpretati con cautela. In quarto luogo, non abbiamo determinato i livelli di resistenza all’insulina e di acil-CoA. Infine, mancavano 200 casi di HbA1c nei nostri soggetti. Tuttavia, queste associazioni sono rimaste stabili dopo imputazione media e imputazioni multiple, suggerendo che un bias importante è improbabile.

La nostra ricerca ha avuto importanti implicazioni di salute pubblica. CVD è una complicazione comune e grave in T2DM, che è significativamente associato con la morte prematura in T2DM. Anche se la gestione intensiva di iperglicemia, ipertensione e lipidi anomali sono in grado di ridurre il rischio di CVD in T2DM, il rischio residuo di CVD rimane sostanzialmente elevato (36). È importante capire meglio i meccanismi di CVD in T2DM. Il nostro studio fornisce una nuova visione circa i percorsi da disturbi metabolici in T2DM a CVD.

In conclusione, il nostro studio ha trovato che elevati livelli plasmatici di alcuni metaboliti acilcarnitina estratti in fattori 1 e 2, cioè, C2, C4, C6, C8, C10, C12, C14, C14OH, e C14:1, sono stati associati con rischio di CVD in pazienti cinesi con T2DM. Come la natura dello studio trasversale, studi di coorte prospettici sono necessari per replicare i nostri risultati in futuro.

Data Availability Statement

I set di dati generati per questo studio possono essere trovati in Metabolights, con l’identificatore unico MTBLS1427, accessibile tramite http://www.ebi.ac.uk/metabolights/MTBLS1427.

Dichiarazione etica

Gli studi che hanno coinvolto partecipanti umani sono stati esaminati e approvati dal comitato etico per la ricerca clinica dell’ospedale Liaoning Medical University First Affiliated. Il consenso informato scritto per la partecipazione non è stato richiesto per questo studio in conformità con la legislazione nazionale e i requisiti istituzionali.

Contributi degli autori

Z-ZF, SZ e XY hanno progettato lo studio. SZ e X-FF hanno analizzato i dati e scritto la bozza. H-HL e MG hanno raccolto i dati. JL, Y-FC e X-YS hanno fornito commenti critici e hanno contribuito alla stesura di questo manoscritto. SZ, TH, J-XC, JZ e DS hanno partecipato alla revisione di questo manoscritto.

Finanziamento

Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto per il Programma nazionale di ricerca e sviluppo chiave (2019YFA0802300), Liaoning Province Natural Science Foundation (20170540364), Progetto generale di ricerca scientifica del Liaoning Provincial Department of Education (L2015326), Liaoning Province Key Research and Development Program (2019JH8/10300036), il tredicesimo piano quinquennale e il progetto di talento TMU (11601501/2016KJ0313), la diagnosi individualizzata e il trattamento del cancro colorettale (LNCCC-B05-2015), la Fondazione del Comitato per la scienza e la tecnologia di Tianjin (15JCYBJC54700), la China Postdoctoral Science Foundation (2016M590210), Tianjin Health Bureau Science Foundation Key Project (16KG154), e Tianjin Project of Thousand Youth Talents.

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano tutti i medici, gli infermieri e il personale di ricerca del LMUFAH di Jinzhou, per la loro partecipazione a questo studio.

Materiale supplementare

Il materiale supplementare per questo articolo può essere trovato online su: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fendo.2020.00212/full#supplementary-material