Frontiers in Pharmacology

Introduzione

I peptidi biologicamente attivi sono il termine generale per diversi peptidi che costituiscono diverse composizioni e disposizioni di aminoacidi naturali. Sono noti per possedere una varietà di funzioni biologiche come attività antiossidanti, immunopromotrici, ormono-modulanti, antibatteriche, antitrombotiche, antivirali e antipertensive grazie a composti multifunzionali derivati da proteine animali o vegetali (Wang et al., 2017). Inoltre, hanno un’elevata sicurezza alimentare e un’alta biodisponibilità che li rendono potenziali candidati per lo sviluppo di farmaci peptidici funzionali e additivi alimentari funzionali (Sarmadia e Ismaila, 2010).

Come da stima dell’Organizzazione Mondiale della Sanità, i CVD rappresentano la mortalità di oltre 17,5 milioni di persone ogni anno. Tra le caratteristiche importanti di CVD, l’ipertensione è un obiettivo essenziale per la prevenzione e il trattamento di CVD (Celermajer et al., 2012). I farmaci attualmente utilizzati per abbassare la pressione sanguigna come captopril ed enalapril sono limitati nel loro uso a causa di reazioni avverse come tosse, eruzione cutanea e mal di testa (Yu et al., 2018). Tuttavia, le incidenze sempre crescenti di CVD richiedono alcune alternative nuove e sicure come i peptidi attivi di derivazione alimentare. Ultimamente, sono stati fatti progressi significativi nell’identificazione e nello screening di componenti alimentari che influenzano positivamente la salute cardiovascolare (Martinez-Maqueda et al., 2012; Liu et al., 2018). Tra questi composti, i peptidi hanno guadagnato un’attenzione speciale a causa del loro effetto anti-ipertensivo. In precedenza, l’attività ipotensiva in vitro dei peptidi è stata determinata principalmente misurando l’attività inibitoria dell’enzima di conversione dell’angiotensina (ACE) che è una dipeptidil carbossipeptidasi situata sulla membrana cellulare e può causare danni elevati interrompendo l’equilibrio tra i due sistemi ormonali che regolano la pressione sanguigna e l’equilibrio dei liquidi (Clayton et al., 2015; Gebre et al., 2018). Inoltre, è stato confermato che i peptidi anti-ipertensivi di derivazione alimentare esercitano un effetto ipotensivo sui pazienti ipertesi senza alcuna tossicità o effetti collaterali (Martinez-Maqueda et al., 2012). La separazione e la purificazione dei peptidi anti-ipertensivi dalle proteine alimentari fornirebbe una nuova direzione per lo sviluppo di farmaci naturali anti-ipertensivi.

Le risorse dei semi di Ginkgo biloba sono state ampiamente studiate in tutto il mondo per la loro notevole attività biologica e azione farmacologica. Il seme di Ginkgo, come medicina tradizionale cinese, ha una storia di più di 600 anni, ma poco si sa sui suoi principali componenti attivi. Solo pochi studi hanno riportato gli effetti antiossidanti, anti-fatica e batteriostatici dell’isolato proteico dei semi di G. biloba (Lena e Philip, 2002; Huang et al., 2010). Wu et al. (2013) hanno idrolizzato il peptide di Ginkgo con alcalasi e pepsina per ottenere due peptidi antiossidanti con una capacità di spazzare i radicali liberi e inibire la perossidazione lipidica. Tuttavia, i peptidi ipotensivi di Ginkgo devono essere esplorati ulteriormente per svelare i loro meccanismi sottostanti per un’azione superiore.

In questo caso, abbiamo usato quattro tipi di proteasi per idrolizzare GPI, al fine di scegliere uno degli idrolizzati con alta attività ACE inibitoria ed eseguire l’ultrafiltrazione per ottenere componenti con diversi MWs. Sono stati studiati gli effetti dei MWs sull’attività ACE inibitoria dei GPHs. Inoltre, è stata stabilita la relazione tra la composizione aminoacidica e l’attività del peptide. I peptidi ACE inibitori appena estratti sono stati purificati, identificati e sintetizzati; i loro valori IC50 sono stati testati e sono stati esplorati i modelli di inibizione dei peptidi tramite i diagrammi Lineweaver-Burk. Abbiamo anche chiarito il meccanismo di inibizione dell’ACE usando l’analisi di docking molecolare.

Materiali e metodi

Materiali

I semi di G. biloba L. sono stati acquistati dalla città di Linyi della provincia di Shandong, Cina. I semi sono stati sgusciati, decorticati e utilizzati per ulteriori esperimenti. L’enzima di conversione dell’angiotensina I e l’ippuril-l-istidil-L-leucina (HHL), acido ippurico sono stati acquistati da Sigma (St. Louis, MO, Stati Uniti) e Yuanye Bio-Technology (Shanghai, Cina), rispettivamente. Il captopril è stato acquistato da MedChem Express (NJ, Stati Uniti).

Preparazione di GPI

I semi di G. biloba L. sono stati essiccati a 45°C, poi schiacciati in polvere e setacciati attraverso 80 mesh. La polvere è stata liofilizzata dopo un trattamento di defenolizzazione e sgrassatura. La polvere di semi di G. biloba risultante è stata sciolta in DW (1:20, w/v; pH 10.0). La sospensione di cui sopra è stata agitata ed estratta per 12 ore seguita da centrifugazione a 10.000 g per 30 minuti. Il surnatante ottenuto è stato impostato al punto isoelettrico della proteina di ginkgo pH 4.62 e incubato per 60 min seguito da ulteriore centrifugazione a 10.000 g per 30 min. Il precipitato ottenuto è stato risospeso utilizzando acqua distillata, e la soluzione è stata regolata a pH 7. Successivamente, le GPI ottenute sono state liofilizzate fino al prossimo utilizzo.

Preparazione di idrolizzati proteici di Ginkgo (GPHs)

Per questo, è stata preparata una soluzione di GPI al 4% e idrolizzata separatamente con quattro proteasi alle loro condizioni di idrolisi ottimale per 5 ore. I dosaggi degli enzimi erano di 2.000 U. Dopo l’idrolisi, gli enzimi sono stati inattivati a 90°C per 10 min e la soluzione è stata centrifugata a 3.000 g per 30 min per ottenere i surnatanti individuali ottenuti da quattro enzimi.

Grado di idrolisi

Il grado di idrolisi (DH) è stato calcolato facendo riferimento al metodo di Kimatu et al. (2017) come segue:

dove, B rappresentava la quantità (mL) di NaOH aggiunta per mantenere costante il pH durante il processo di idrolisi; Nb era la concentrazione molare della soluzione NaOH; MP era la massa (g) della proteina; α designava il grado medio di dissociazione nei substrati proteici durante l’idrolisi; htot era il numero totale di legami peptidici nella proteina.

Isolamento e purificazione del peptide inibitore dell’ACE

L’ultrafiltrazione del campione è stata effettuata utilizzando un ultrafiltro a tazza MSC300 (MoSu, Shanghai, Cina). Il campione è stato aggiunto dalla porta di alimentazione e la bottiglia di azoto è stata collegata al raccordo del tubo della tazza di ultrafiltrazione. Poi dopo, la tazza ultrafiltrata è stata posta e imballata sull’agitatore magnetico collegato alla bombola di azoto con una pressione non superiore a 0,22 MPa. I campioni sono stati passati in sequenza attraverso le membrane di ultrafiltrazione da 1, 3, 5 e 10 kDa e sono stati ottenuti quattro componenti (<1, 1-3, 3-5 e 5-10 kDa). Le quattro frazioni sono state raccolte, liofilizzate e quindi utilizzate per testare l’attività ACE inibitoria. I componenti con maggiore attività ACE sono stati selezionati per un’ulteriore purificazione secondo la procedura indicata da Zheng et al. (2017). L’idrolizzato liofilizzato (200 mg) ottenuto dopo l’ultrafiltrazione è stato risospeso in acqua purificata per ottenere una concentrazione finale di 50 mg/mL e sottoposto a ulteriore purificazione mediante colonna di filtrazione su gel Sephadex G-15 (1,5 cm × 60 cm). I campioni sono stati filtrati con una membrana di microfiltrazione e l’eluizione è stata eseguita con acqua distillata ad una velocità di flusso di 1 mL/min. Il campione è stato monitorato e separato ad una lunghezza d’onda di 220 nm utilizzando P270 HPLC semi-preparativo (Aixin, Guangzhou, Cina). Le frazioni (7,5 mL ciascuna) sono state raccolte e liofilizzate.

Determinazione dell’attività ACE inibitoria

Questo test è stato eseguito secondo le descrizioni sono date dal precedente rapporto di O’Loughlin et al. (2014) con alcune modifiche. Brevemente, il substrato ippuril-istidil-leucina (HHL, 5 mM) e i campioni sono stati mescolati in 0,1 M Na2 (pH 8,3) con 0,3 M cloruro di sodio. Poi dopo, 50 μL di campione e 150 μL del substrato sono stati aggiunti in una provetta da centrifuga, mescolati e lasciati riposare in acqua a 37°C per 5 min. Successivamente, la soluzione ACE (50 mU/mL) è stata aggiunta e incubata a 37°C per 45 min. La reazione è stata terminata aggiungendo 250 μL di HCl 1M e la soluzione è stata filtrata attraverso un filtro a siringa di nylon da 0,45 μM prima di essere analizzata mediante RP-HPLC (Waters, Milford, MA, Stati Uniti) su un Inertsil ODS-3 (250 × 4,6 mm, dimensione delle particelle 5 μm). La fase mobile comprendeva acqua distillata: acetonitrile = 75:25 (V/V, con 0,1% TFA) con una velocità di flusso di 0,5 mL/min e rilevamento a 228 nm. Il captopril è stato usato come controllo e l’attività inibitoria (%) è stata determinata come segue:

dove A era l’area del picco dell’acido ippurico con il campione, B era senza il campione.

AnalisiLC-MS/MS e identificazione delle sequenze peptidiche purificate

I campioni purificati sono stati analizzati da Q Exactive (Thermo Fisher Scientific, MA, Stati Uniti) utilizzando un Easy-nLC 1000 (Thermo Fisher Scientific, MA, Stati Uniti). Il campione è stato desalinizzato e liofilizzato, ricostituito in una soluzione di 0,1% FA e conservato a -20°C fino al prossimo utilizzo. Le due fasi mobili erano le seguenti: la fase mobile A costituiva una soluzione acquosa di acido formico allo 0,1% e la fase mobile B era una soluzione acquosa di acido formico allo 0,1% di acetonitrile (l’acetonitrile era all’84%). Dopo l’equilibrio della colonna con il 95% della soluzione A, il campione è stato caricato dall’autocampionatore alla colonna Trap. Il rapporto massa-carica dei frammenti dei peptidi è stato raccolto come segue: un totale di 20 modelli di frammenti sono stati acquisiti dopo ogni scansione completa. Il file grezzo di test di spettrometria di massa è stato cercato utilizzando il software Mascot 2.2 per il database corrispondente.

Sintesi dei peptidi

Peptidi potenziali ACE inibitori identificati da LC-MS/MS sono stati sintetizzati in GL Biochem (Shanghai, Cina). La purezza dei peptidi sintetici è stata ulteriormente confermata da HPLC che era superiore al 95%.

Kinetics of ACE Inhibition

Il modello di inibizione cinetica del peptide G. biloba è stato testato utilizzando il metodo di Lin et al. (2017). Brevemente, diverse concentrazioni di substrato HHL (0,5, 1, 2 e 5 mM) sono state lasciate reagire con ACE. La trama di Lineweaver-Burk era basata sul reciproco della velocità di reazione (1/v) e la concentrazione del substrato (1/). Le intercette sugli assi X e Y rappresentavano i reciproci di Km e Vmax, rispettivamente.

Analisi di Docking

Per questo, il file della struttura tridimensionale della proteina ACE (PDB ID: 1O8A) da RCSB Protein Data Bank (PDB1) è stato scaricato. La struttura tridimensionale dei peptidi di G. biloba è stata disegnata utilizzando il software di simulazione molecolare Discovery Studio 3.5. L’elaborazione idro è stata eseguita e l’energia è stata minimizzata dal programma CHARMM. Inoltre, Zn2+ è stato mantenuto nel modello ACE. Il software DS 3.5 ha segnato il risultato del docking secondo la propria funzione di punteggio, basata sui punteggi e sull’energia libera combinata di ogni risultato. Tra tutti i risultati, è stato selezionato un risultato di corrispondenza migliore.

Analisi statistica

L’ANOVA a una via, seguita dai test di Duncan a intervalli multipli utilizzando SPSS Statistics 20.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL, Stati Uniti) è stato utilizzato per l’analisi dei dati con una differenza di significatività (P ≤ 0,05).

Risultati

DH e attività inibitoria ACE di GPHs

Come si può vedere dalla Figura 1A, il DH è stato prolungato nel tempo durante l’intero processo di idrolisi. DH è aumentato rapidamente prima dell’intervallo di 2 ore, poi dopo, il tasso di aumento è gradualmente rallentato con il tempo. In generale, il tasso di idrolisi era alto per 1 h iniziale, che è stato ridotto o è diventato costante dopo. Tra le quattro proteasi, l’alcalasi ha avuto il più alto DH che ha raggiunto il 14,7% dopo 5 ore, seguito dalla tripsina (8,91%) e dalla dispasi (6,91%). Il DH più basso è stato osservato per flavourzyme, che era solo il 3,23% a 5 ore. Questi risultati implicano che GPI è stato scisso dalle proteasi in diversi siti che hanno portato a idrolizzati proteici con diverse composizioni peptidiche.

Per quanto riguarda l’attività ACE inibitoria dei quattro idrolizzati di proteasi, l’attività è aumentata con DH nel corso del tempo. Come mostrato nella Figura 1B, le attività inibitorie di alcalasi, tripsina, dispasi e flavourzyme a 5 ore erano rispettivamente 62,70, 39,81, 48,39 e 25,95%. A causa dei loro diversi siti di scissione, sono stati ottenuti diversi peptidi con diverse attività ACE inibitorie. Tra di loro, l’attività dell’idrolizzato alcalino era relativamente più forte che ha indicato che la proteasi alcalina può effettivamente produrre un idrolizzato con maggiore effetto ACE inibitorio.

Attività inibitoria ACE di GPHs e frazione di membrana

L’attività inibitoria ACE del GPHs e le frazioni risultanti era significativamente dipendente da MW come mostrato nelle figure 1C,D. A concentrazioni di campione di 1 mg/mL, l’attività inibitoria dell’ACE aumentava gradualmente con la diminuzione della MW dei componenti. L’attività di inibizione a 3-5 e 5-10 kDa erano 44,94% (IC50 = 1,257 mg/mL), 44,04% (IC50 = 1,765 mg/mL), rispettivamente. Successivamente, l’attività aumentava gradualmente con il MW inferiore e raggiungeva il livello più alto (69,86%; IC50 = 0,224 mg/mL) a <1 kDa.

Purificazione dei peptidi di Ginkgo

L’alcalasi è spesso usata per la preparazione di peptidi attivi grazie alla sua ampia specificità e alla forte capacità di degradare le proteine. Dal trattamento di ultrafiltrazione, è stato rivelato che l’attività inibitoria dell’ACE migliorava con la diminuzione del MW del polipeptide. Pertanto, il peptide della frazione <1 kDa è stato ulteriormente purificato utilizzando la colonna Sephadex G-15. Si può vedere dalla figura 2A, Sephadex G-15 è stato diviso in tre componenti (A1, A2 e A3). I tre componenti sono stati raccolti e liofilizzati, e sono state misurate le loro attività ACE inibitorie. I risultati sono mostrati nella Figura 2B. Le attività ACE inibitorie dei tre componenti (1 mg/mL) erano 64,08, 58,55 e 74,96%, rispettivamente. Pertanto, il componente A3 più attivo è stato selezionato per l’identificazione strutturale del passo successivo.

Identificazione dei peptidi di Ginkgo e sintesi dei peptidi

Al fine di identificare il potenziale peptide ACE inibitorio, il componente A3 più attivo è stato analizzato mediante LC-MS/MS (tabella S1 supplementare). Sulla base di questo, tre peptidi sono stati selezionati dal componente A3 e le loro sequenze di aminoacidi erano Thr-Asn-Leu-Asp-Trp-Tyr (TNLDWY), Arg-Ala-Asp-Phe-Tyr (RADFY), e Arg-Val-Phe-Asp-Gly-Ala-Val (RVFDGAV) (Figura 3). Le sequenze identificate di questi peptidi erano composte da 5-7 residui aminoacidici. Per identificare l’attività ACE inibitoria di queste tre frazioni peptidiche, i peptidi sono stati sintetizzati chimicamente. I peptidi sintetizzati ottenuti sono stati identificati con la spettrometria di massa (Figure 4A-C). I risultati hanno mostrato che i valori IC50 di TNLDWY, RADFY e RVFDGAV erano 1,932, 1,35 e 1,006 mM, rispettivamente (Figura 4D).

Meccanismo inibitorio dei peptidi di Ginkgo

La modalità di inibizione del peptide di G. biloba è stata analizzata secondo il grafico Lineweaver-Burk. Come si può vedere dalla Figura 5, quando è stato aggiunto il peptide di Ginkgo TNLDWY, sia Vmax che Km sono cambiati, Vmax è aumentato con l’aumentare della concentrazione del peptide; mentre Km non è cambiato significativamente con la concentrazione del peptide, il che indica che il suo modello di inibizione può essere una modalità di inibizione non competitiva. Per RADFY e RVFDGAV, Vmax non è cambiato significativamente con la concentrazione; mentre, Km è aumentato con l’aumento della concentrazione del peptide, indicando che entrambi i peptidi sono inibitori competitivi, che possono legarsi ai siti attivi di ACE, bloccando così il legame di ACE al substrato e inibendo l’attività di ACE.

Simulazione di docking molecolare tra peptidi e ACE

In questo studio, è stata valutata l’interazione di tre peptidi con ACE. I risultati hanno mostrato che tutti i peptidi potrebbero legarsi bene all’ACE e formare un complesso stabile, indicando il loro uso come potenziale inibitore dell’ACE. Il punteggio di – Cdocker Interaction Energy è stato mostrato nella tabella 1. I punteggi delle frazioni TNLDWY, RADFY e RVFDGAV erano rispettivamente 102,995, 105,335 e 117,706. I risultati del docking molecolare sono stati mostrati nella Figura 6 e nella Tabella 2. La posizione ottimale di docking di TNLDWY può formare sei legami a idrogeno, tra cui ha formato legami a idrogeno con Ala 354, Tyr523 in S1 tasca attiva, His353, His513 in S2 tasca attiva, e Zn2 + residui ed è stato trovato stabilmente legato con tutti loro. Questo può essere legato alla forte attività ACE inibitoria del peptide. È stato osservato dalla Figura 6B che RADFY può formare sette legami a idrogeno con residui di aminoacidi, e legami a idrogeno intermolecolari con i residui Gln281, His353, His513, e Tyr520 nella tasca attiva S2. La formazione di questi legami a idrogeno ha notevolmente stabilizzato il complesso enzima-peptide. Inoltre, RADFY ha formato un legame ionico con Zn2+, forze coniugate con Val380, His383, Glu384, His387, Glu411, Lys511, e Tyr523 così come la forza di van der Waals con il residuo aminoacido Trp356. Queste interazioni possono provocare la deformazione del ligando Zn2+ e l’inattivazione di ACE. Rispetto a TNLDWY e RADFY, RVFDGAV può formare quattro legami a idrogeno con i residui di aminoacido, che era collegato stabilmente a ALA354, TYR523 nella tasca attiva S1, e Glu162 nella tasca attiva S1′. Tuttavia, RVFDGAV potrebbe formare legami ionici con Zn2+, che ha portato direttamente alla disattivazione delle molecole ACE. Inoltre, ha formato un coniugato con i residui di aminoacidi come Glu162, His353, Glu376, Val379, His387, Phe391, His410, Phe457, e Phe527 (Figura 6C).

Discussione

Negli ultimi anni, i peptidi ACE inibitori derivati dal cibo dalle proteine vegetali hanno attirato sempre più attenzione grazie ai loro minori effetti collaterali. In questo studio, alcalasi, dispasi, tripsina e flavourzyme sono stati utilizzati per idrolizzare la proteina Ginkgo. La DH e l’attività inibitoria dell’ACE dell’idrolizzato proteico di Ginkgo ottenuto dall’idrolisi dell’alcalasi sono state riportate come le più alte. Il processo di idrolisi ha avuto luogo rapidamente durante la fase iniziale che ha portato all’idrolisi di molti legami peptidici, poi dopo, il tasso di idrolisi è stato rallentato a causa della graduale riduzione della disponibilità dei substrati per l’idrolisi (Ketnawa et al., 2017; Hu et al., 2018; Wei et al., 2018). Questi risultati erano coerenti con il precedente rapporto di idrolizzati di proteine di colza con efficace azione inibitoria dell’ACE quando idrolizzati con alcalasi (He et al., 2013).

L’enzima di conversione dell’angiotensina è una dipeptidasi extracellulare multifunzionale presente in diversi tessuti. L’attività inibitoria dell’ACE abbassa la pressione sanguigna riducendo la produzione di angiotensina II e riducendo la distruzione delle chinine (Zheng et al., 2017). L’attività ACE inibitoria dell’idrolizzato era legata alla distribuzione del peso molecolare. L’ultrafiltrazione è stata utilizzata per separare l’idrolizzato di Ginkgo in cinque componenti. Al peso molecolare <1 kDa, l’attività ACE inibitoria dell’idrolizzato di Ginkgo è stata riportata la più alta. Questa osservazione era in accordo con studi precedenti che riportavano la maggiore attività ACE di polipeptidi a basso MW (Wang et al., 2015; Ola et al., 2017). Inoltre, Silvestre et al. (2012) hanno confermato che il trattamento di ultrafiltrazione può trattenere i peptidi (AAA) in posizione C-terminale per promuovere l’attività ACE inibitoria.

Al fine di purificare ulteriormente il peptide ACE inibitorio altamente attivo, il componente Ginkgo (<1 kDa) è stato separato mediante cromatografia di filtrazione su gel, e la sequenza di aminoacidi è stata identificata utilizzando LC-MS/MS. Sono stati così ottenuti tre nuovi peptidi ACE inibitori: TNLDWY (1,932 mM), RADFY (1,35 mM), e RVFDGAV (1,006 mM) che hanno mostrato una forte attività ACE inibitoria. Secondo il rapporto di Hernández-Ledesma et al. (2011), la maggior parte dei peptidi inibitori dell’ACE erano brevi sequenze composte da 2-12 aminoacidi. Inoltre, l’attività del peptide ACE-inibitore era fortemente legata alla presenza del suo aminoacido C-terminale, dell’aminoacido aromatico e dell’aminoacido idrofobico. Per esempio, la presenza dell’aminoacido aromatico (Tyr, Phe e Trp) ha aumentato significativamente l’attività del peptide ACE-inibitore. Inoltre, anche l’Arg è noto per svolgere un ruolo importante nel peptide inibitorio. Toopcham et al. (2017) hanno dimostrato che l’attività inibitoria del polipeptide era significativamente ridotta dopo la rimozione di Arg. Inoltre, Liu et al. (2018) hanno dimostrato che l’amminoacido come Leu nel peptide ha influenzato significativamente l’attività inibitoria dell’ACE indipendentemente dalla sua posizione al C-terminale o all’N-terminale. Risultati simili sono stati riportati anche da Lee e Hur (2017). Questi studi hanno riportato i peptidi KPLL, VLAQYK e DLP da diversi materiali proteici con un’apprezzabile attività ACE inibitoria in presenza di aminoacido idrofobo (Leu). Nel nostro studio, Tyr era situato al C-terminale di TNLDWY e RADFY. Inoltre, i due peptidi di RADFY e RVFDGAV contenevano Arg al N-terminale, e il contenuto di aminoacidi idrofobici nei tre peptidi era più alto. Soprattutto, i frammenti peptidici corrispondevano alle caratteristiche strutturali dei peptidi ACE-inibitori.

La modalità di inibizione dei peptidi ACE-inibitori è stata osservata generalmente non competitiva, competitiva e mista. Per i peptidi brevi (2-12 aminoacidi), la maggior parte di essi erano inibitori competitivi e si attaccavano all’enzima ACE per impedire il legame del substrato HHL. Uno studio simile di Lin et al. (2017) ha dimostrato che i peptidi KYIPIQ e LPLPLL della caseina Qula hanno mostrato una modalità di inibizione competitiva. Tuttavia, per gli inibitori non competitivi, essi si legano a siti diversi dal sito di legame del substrato dell’enzima e alla fine influenzano il legame del substrato all’enzima. Modelli simili sono stati osservati nel caso di peptidi inibitori di origine alimentare come PFPGPIPN dalla caseina Qula, e il peptide della nocciola YLVR (Lin et al., 2017; Liu et al., 2018). In questa modalità competitiva, ACE, substrato e peptide formavano un complesso enzima-substrato-inibitore, che impediva l’ulteriore rilascio del prodotto e determinava una diminuzione della Vmax (Barbana e Boye, 2011).

Studiare il meccanismo di interazione molecolare tra ACE e peptidi inibitori è utile per lo screening e la progettazione di nuovi peptidi ACE inibitori. Tuttavia, sono disponibili informazioni inadeguate sulle interazioni molecolari dei peptidi inibitori. Il docking molecolare si basa sul “principio della serratura e della chiave” di ligandi e recettori, simulando l’interazione tra ligandi di piccole molecole e biomacromolecole recettoriali. La modalità di legame e l’affinità tra loro permette lo screening virtuale dei farmaci. ACE è un enzima carbossidipeptidico Zn2+-dipendente, in cui Zn2+ è una parte importante del centro attivo di ACE (Pina e Roque, 2009). Secondo i dati precedentemente riportati (Pan et al., 2012), i principali residui di interazione sul sito attivo di ACE sono stati suddivisi in tre tasche attive (S1, S2 e S1′). S1 (Ala354, Glu384 e Tyr523); S2 (Gln281, His353, Lys511, His513 e Tyr520); e S1′ (residuo Glu162). Nel sito attivo dell’ACE, due istidine (His383 e His387) insieme a Glu 411 hanno costituito un ligando Zn2+. È stato riportato che l’inibizione dell’attività dell’ACE indotta dai peptidi può essere ottenuta dalla combinazione di complessi enzima-peptide stabili al legame a idrogeno (Fu et al., 2017). Inoltre, la formazione di forze di van der Waals con residui aminoacidici come His353, Ala 354, Ser355, Glu384, His513 e Pro519, l’interazione coniugata con Tyr360 e le interazioni non covalenti con Glu384, Arg522 possono anche contribuire alla stabilità dei complessi peptidici enzimatici. La presenza di queste forze renderà la struttura del complesso enzima-peptide più stabile, più favorevole all’inibizione dell’attività dell’ACE, che può essere la ragione della forte attività ACE inibitoria di TNLDWY, RADFY e RVFDGAV.

Conclusione

In questo studio, i semi di G. biloba sono stati usati per preparare potenziali peptidi ACE inibitori. I GPH preparati da diverse proteasi hanno mostrato un’attività ACE inibitoria diversa in vitro. Le più alte attività DH e ACE in vitro sono state osservate nei GPH preparati dall’alcalasi. I componenti ottenuti per ultrafiltrazione con alcalasi hanno mostrato che i peptidi di MW più piccoli conferivano la più forte attività ACE inibitoria. Tre potenziali peptidi ACE inibitori (TNLDWY, RADFY e RVFDGAV) sono stati ottenuti dalla frazione peptidica (<1 kDa) mediante LC-MS/MS. RVFDGAV ha mostrato la più alta attività ACE inibitoria con un valore IC50 di 1,006 mM ed è apparso come un inibitore competitivo. I risultati del docking molecolare hanno indicato che i peptidi potevano legarsi saldamente all’ACE e interagire ulteriormente con i residui di aminoacidi nel sito attivo dell’ACE. I nostri risultati hanno indicato che i peptidi ottenuti dall’idrolisi enzimatica dell’alcalasi hanno esibito un’efficace attività inibitoria dell’ACE in vitro, il che li rende potenziali candidati per lo sviluppo di alimenti funzionali o farmaci anti-ipertensivi in futuro.

Contributi degli autori

F-FM, HW, C-KW, e KT sono stati coinvolti nel disegno del progetto, hanno eseguito la maggior parte degli esperimenti e hanno redatto il manoscritto. Z-JW e LJ hanno contribuito al disegno sperimentale, alla preparazione del manoscritto e alla presentazione. Tutti gli autori hanno partecipato alla stesura del manoscritto e/o lo hanno rivisto criticamente per importanti contenuti intellettuali.

Finanziamento

Questo studio è stato sostenuto dai Grandi Progetti di Scienza e Tecnologia della Provincia di Anhui (17030701024, 17030701058, e 17030701028) e dal Progetto Chiave di Ricerca e Sviluppo della Provincia di Anhui (1704g07020110 e 1804b06020347).

Dichiarazione di conflitto di interessi

HW era impiegato presso Anhui Habopharmqnceutical Co, Ltd. Z-JW era dipendente di Anhui Qiangwang Seasoning Food Co., Ltd.

I restanti autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Materiale supplementare

Il materiale supplementare per questo articolo può essere trovato online su: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2018.01579/full#supplementary-material

Footnotes

1. ^ http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do