Frontiers in Plant Science

Introduzione

Gli stress biotici riducono drasticamente i rendimenti delle colture, causando enormi perdite economiche e una minaccia alla sicurezza alimentare (Boyer, 1982; Bray et al., 2000; Cramer et al., 2011), un problema che probabilmente sarà aggravato dal cambiamento climatico (Mittler e Blumwald, 2010; Lobell et al., 2011; Lesk et al., 2016). Allo stesso tempo, la popolazione umana mondiale è in continua crescita; da 7 miliardi alla fine del 2011, si prevede che superi i 9 miliardi di persone entro il 2050 (Nazioni Unite, Dipartimento degli affari economici e sociali, Population Division, 2011). Di conseguenza, la domanda per la produzione globale di colture dovrebbe raddoppiare entro il 2050 (Tilman et al., 2011). Tuttavia, la maggior parte delle nuove terre con il potenziale per l’agricoltura si trova in ambienti difficili come le terre aride e i deserti, che coprono circa il 41% delle aree terrestri mondiali (Millennium Ecosystem Assessment, 2005). Pertanto, il miglioramento dei rendimenti delle colture sotto stress multipli è vitale per evitare perdite dove le colture sono attualmente coltivate e per coltivarle su terreni più marginali.

La pianta modello, Arabidopsis thaliana ha fornito molta della nostra comprensione delle risposte molecolari delle piante allo stress. Tuttavia, l’Arabidopsis è una pianta sensibile allo stress e quindi la ricerca di nuovi meccanismi e geni di tolleranza allo stress ha portato a un crescente interesse per le piante naturalmente tolleranti allo stress native di ambienti estremi – le cosiddette “estremofite” (John e Spangenberg, 2005; Amtmann, 2009; Dassanayake et al., 2009; Smaoui et al., 2011; Gechev et al., 2012; Oh et al., 2012; Bressan et al., 2013; Cheeseman, 2014; Flowers et al., 2015; Zhu et al., 2015). Una strategia di successo è stata quella di studiare i parenti estremofiti Arabidopsis (Brassicaceae) come il metallo iperaccumulatore Arabidopsis halleri (Hanikenne et al, 2008), e gli alofiti, Schrenkiella parvula (precedentemente Thellungiella parvula) e Eutrema salsugineum (precedentemente Thellungiella salsuginea o Thellungiella halophila) (Volkov et al., 2003; Inan et al., 2004; Orsini et al., 2010; Koch e German, 2013). Oltre ad essere tollerante al sale (ad esempio, Inan et al., 2004; Taji et al., 2004; Kant et al., 2006), E. salsugineum è anche tollerante a bassi livelli di azoto del suolo (Kant et al., 2008), alti livelli di boro (Lamdan et al, 2012), bassi livelli di fosfato (Velasco et al., 2016), stress da calore (Higashi et al., 2013), e mostra una tolleranza allo stress da freddo e gelo simile a quella dell’Arabidopsis (Griffith et al., 2007; Lee et al., 2012). Un certo numero di fattori contribuiscono alla tolleranza allo stress dell’E. salsugineum, tra cui la costitutiva up- e down-regulation dei geni di tolleranza allo stress e dei metaboliti che suggeriscono che l’E. salsugineum è “innescato” per lo stress, l’espansione del numero di copie di geni legati al trasporto degli ioni, la sub-funzionalizzazione e neo-funzionalizzazione dei geni duplicati, l’uso distorto dei codoni che facilita una traduzione più efficiente delle proteine legate al trasporto degli ioni, e il possibile coinvolgimento di geni specifici del lignaggio (Taji et al., 2004; Gong et al., 2005; Kant et al., 2006, 2008; Lugan et al., 2010; Oh et al., 2010, 2012, 2014; Sun et al., 2010; Dassanayake et al., 2011; Wu et al., 2012; Champigny et al., 2013; Kazachkova et al., 2013; Yang et al., 2013). Quindi, per ottenere una comprensione completa di come le piante affrontano gli stress multipli, è vitale studiare le estremofite da una serie di habitat diversi. Il deserto del Negev nel sud di Israele, parte della fascia dei deserti del Sahara e dell’Arabia, è caratterizzato da una combinazione di temperature estreme, bassa disponibilità di acqua e nutrienti, e alti livelli di salinità e radiazione, ed è considerato una zona “arida” con una piovosità annuale compresa tra 25 e 200 mm che è imprevedibile con un’alta variazione spaziale e temporale (Gutterman, 2002; Ward, 2009). Le temperature possono variare sia giornalmente che stagionalmente tra un massimo e un minimo giornaliero assoluto di 46,8 e -3,6°C, rispettivamente1. Queste condizioni estreme, insieme alle “isole di salinità del suolo”, hanno portato a speciali adattamenti morfologici, fisiologici e genetici che permettono alle piante di prosperare. Così, il deserto del Negev è un probabile scrigno biogenetico di geni che sono legati agli adattamenti allo stress abiotico.

Abbiamo esaminato diverse delle 25 specie di Brassicaceae estremofite che abitano il Negev per la tolleranza a molteplici stress abiotici. Una di queste è Anastatica hierochuntica (vera rosa di Gerico), una specie di pianta annuale invernale del deserto sahariano-arabo descritta per la prima volta da Linnaei (1753) che colonizza le zone più alte e più secche dei wadies o dei runnels (Friedman e Stein, 1980; Friedman et al., 1981). A. hierochuntica è nota per il suo meccanismo di dispersione dei semi igroscopico per cui la pianta muore, si secca e la riduzione della pressione di turgore fa arricciare i rami proteggendo così i semi e impedendone la dispersione (Friedman et al., 1978; Hegazy et al., 2006). Una volta che si verifica un grave evento piovoso che causa la bagnatura della pianta morta, i rami si aprono e le capsule dei semi (siliculae) si aprono. I semi vengono poi dispersi dalle gocce di pioggia che colpiscono le silicule aperte (Gutterman, 2002; Hegazy et al., 2006). Così, anche se morta, A. hierochuntica è stata spesso scambiata per una pianta di resurrezione.

Qui, esaminiamo se A. hierochuntica esibisce la tolleranza al calore, ai bassi nitrati e agli stress salini associati al suo habitat desertico. Prendendo lo stress salino come caso di studio, determiniamo se A. hierochuntica possiede meccanismi fisiologici di tolleranza al sale che sono simili al suo parente alofita, E. salsugineum, e se queste due estremofite da ambienti molto diversi hanno evoluto strategie metaboliche comuni e/o specie-specifiche per far fronte allo stress salino.

Materiali e metodi

Materiale vegetale e condizioni di crescita

I semi di Anastatica hierochuntica sono stati originariamente raccolti nel deserto del Negev (455881′ N e 200751′ E), Israele. I semi originali sono stati raccolti nei campi sperimentali dell’Università Ben-Gurion a Midreshet Ben-Gurion, e i semi di questa collezione sono stati ulteriormente propagati in condizioni di camera di crescita (16 ore di luce (150 μmol m-2 s-1)/8 ore di buio; 22°C). I semi della generazione F4 sono stati utilizzati per gli esperimenti presentati nella presente relazione. A. thaliana (Col-0), A. hierochuntica e E. salsugineum (ecotipo Shandong) semi sono stati sterilizzati in superficie con 50% candeggina commerciale per 5 min, e poi sciacquati quattro volte con acqua sterile. I semi di A. hierochuntica sono stati seminati su piastre di agar nutriente contenenti MS (Murashige e Skoog, 1962) medium, pH 5.7, 0.5 g L-1 MES, 2% (w/v) saccarosio e 0.8% (w/v) agar (Duchefa Biochemie), mentre i semi di Arabidopsis ed E. salsugineum sono stati sospesi in 0.12% agarosio prima di essere seminati sulle piastre. I semi sono stati stratificati a 4°C (Arabidopsis, 4 giorni; E. salsugineum, 7 giorni; A. hierochuntica, 1 giorno) e le piastre sono state incubate nella stanza di crescita. La semina dei semi delle tre specie è stata scaglionata in modo che la germinazione avvenisse approssimativamente allo stesso tempo. Per gli esperimenti sul suolo, le piantine con cotiledoni completamente espansi sono state trasferite dalle piastre a vasi di 7 cm × 7 cm × 8 cm contenenti terreno Arabidopsis (Weizmann Institute of Science; 70% torba fine, 30% perlite 4) e irrigate fino alla capacità del campo con 1 g L-1 di soluzione 20-20-20 NPK + micronutrienti (prodotti chimici Haifa). Gli appartamenti contenenti i vasi sono stati coperti con cupole di plastica e collocati nella stanza di crescita. Dopo 2 giorni, le cupole sono state gradualmente rimosse per permettere l’indurimento delle piantine. Ogni giorno, i piatti o i vasi sono stati mescolati per eliminare gli effetti della posizione del ripiano. Anche se ai fini degli studi comparativi con Arabidopsis e E. salsugineum, le condizioni di luce nella stanza di crescita erano al di sotto di quelli solitamente incontrati da A. hierochuntica, Figura supplementare S1 mostra che A. hierochuntica tassi di crescita rimangono sempre inferiori a Arabidopsis anche a intensità di luce più elevate. Questo suggerisce che la crescita più lenta di A. hierochuntica rispetto a Arabidopsis e E. salsugineum non era un effetto delle condizioni di luce della stanza di crescita.

Saggi di stress antibiotico

Per le analisi in vitro su piastra, lo stress termico (45°C) è stato applicato per vari periodi e le piastre trasferite di nuovo alla stanza di crescita per altre 48 ore. Per lo stress salino, basso NO3- e stress ossidativo, le piantine sono state prima seminate su piastre MS di controllo. A causa dei diversi tassi di crescita delle radici, le piantine di A. hierochuntica e Arabidopsis sono state trasferite su piastre di trattamento dello stress, 1 e 5 giorni dopo la stratificazione, rispettivamente. Per il saggio di allungamento delle radici, 10 piantine uniformi sono state trasferite in piastre quadrate verticali MS contenenti varie concentrazioni di NaCl. Per prevenire qualsiasi effetto osmotico dovuto all’assorbimento del saccarosio nei tessuti aerei (MacGregor et al., 2008), la parte superiore dell’agar è stata tagliata via prima del trasferimento delle piantine per garantire che i germogli non fossero in contatto con il mezzo. Per il basso NO3- e saggi di stress ossidativo, uniforme Arabidopsis o A. hierochuntica piantine sono stati trasferiti per 5 giorni a piastre quadrate verticali contenenti MS macroelementi (meno nitrato di ammonio per esperimenti a basso N) e microelementi, pH 5.7 (regolata con KOH), 0,5 g L-1 MES, 2% (w / v) saccarosio, 0.8% (w/v) agar (Duchefa Biochemie), e varie concentrazioni di KNO3- o methyl viologen (MV; Sigma, M-2254).

Per gli esperimenti sul suolo, i trattamenti salini sono stati applicati a piante con quattro foglie vere (Arabidopsis e E. salsugineum) o due foglie vere (A. hierochuntica). I vasi sono stati irrigati con 1 g L-1 di soluzione 20-20-20 NPK + micronutrienti integrata con varie concentrazioni di NaCl. I trattamenti con il sale sono iniziati con il 50% della concentrazione di sale finale, e una settimana dopo è stato applicato il 100% di ogni livello di sale. Le piante sono state raccolte dopo un’ulteriore settimana.

Misurazioni di crescita, pigmenti, ioni e fluorescenza della clorofilla

I pesi secchi dei germogli sono stati ottenuti essiccando i campioni a 75°C per 3 giorni. Per i saggi di allungamento delle radici, la lunghezza delle radici è stata misurata ogni 24 ore per 4 giorni, e il tasso di crescita relativa delle radici è stato calcolato per ogni giorno consecutivo secondo Hunt (1990). Per gli esperimenti di stress ossidativo, l’allungamento delle radici è stato calcolato usando la formula (L4-L0)/L4 dove L0 e L4 sono le lunghezze delle radici al giorno 1 o 4, rispettivamente, dopo il trasferimento alle piastre MV. Per valutare l’area fogliare totale, le foglie sono state staccate, poste tra due pellicole trasparenti (Graphic Vision Media) e scansionate. Area fogliare è stato calcolato con ImageJ 1.43 software2. Il contenuto di antociani è stato analizzato secondo Kant et al. (2006). Gli ioni Na+ e K+ sono stati estratti come descritto da Kant et al. (2006) e il contenuto di ioni è stato determinato mediante fotometria a fiamma (Modello 410 Flame photometer, Sherwood Scientific, Ltd, UK). La clorofilla e i carotenoidi sono stati estratti in metanolo al 100% in un rapporto 1:10 tra tessuto e solvente, mantenuti per una notte a 4°C al buio, e misurati secondo Lichtenthaler (1987). La fluorescenza della clorofilla è stata misurata con un dispositivo Mini-PAM (Walz, Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germania) applicando una curva di luce rapida (White e Critchley, 1999). Il quenching non fotochimico (NPQ) e l’ETR del PSII sono stati calcolati secondo Bilger e Björkman (1990) e Krall e Edwards (1992), rispettivamente.

Numero di cromosomi e contenuto di DNA

L’analisi del numero di cromosomi è stata eseguita su giovani protoplasti del meristema del germoglio usando una tecnica drop-spread seguita da colorazione DAPI e microscopia a campo chiaro secondo Anamthawat-Jonsson (2003). Per l’analisi di citometria a flusso del contenuto di DNA 2C, sospensioni nucleari sono stati preparati sminuzzando 60-100 mg di tessuto giovane punta di germoglio in 1 ml di ghiaccio buffer di isolamento dei nuclei (NIB; Dolezel et al., 1989) con l’aggiunta del 5% polivinilpirrolidone PVP-40. Dopo l’aggiunta di altri 2 ml di NIB, i campioni sono stati agitati per 1 ora seguita da filtrazione attraverso una rete di nylon da 50 μm e centrifugazione a 1.900 rpm per 8 min. Il pellet contenente i nuclei è stato risospeso in 1 ml di NIB ghiacciato integrato con 50 μg m-1 di DNase-free RNase A e 2 μg ml-1 ioduro di propidio (Sigma-Aldrich Chemical, Co., USA), vortexato delicatamente per alcuni secondi e poi incubato in ghiaccio per 10 min. I campioni sono stati filtrati attraverso 35 micron di maglia ed eseguito su un Becton Dickinson FACSVantage SE dotato di un 640-nm dicroico filtro passa lungo, un 585 / 42-nm filtro passa-banda, e un raffreddato ad aria argon-ion laser sintonizzato a 15 mW e funzionante a 488 nm. Per ogni campione, 10.000 nuclei sono stati registrati per calcolare la posizione media del picco G1 nell’istogramma. Il rapporto della fluorescenza relativa dalle posizioni dei picchi G0/G1 per ogni campione è stato confrontato con lo standard interno Raphanus sativus cv. Saxa come riferimento per le dimensioni del genoma (2C = 1,11 pg di DNA). Il guadagno del citometro è stato regolato in modo che il picco G0/G1 di R. sativus fosse posizionato sul canale 1500.

Il contenuto di DNA 2C è stato calcolato come segue:

Campione 2C = (posizione media del picco G1 del campione/posizione media del picco G1 di riferimento) × riferimento 2C DNA.

Profilo metabolico

Le piante sono state coltivate nel terreno e sottoposte a stress salino come descritto sopra. Il quinto e il sesto fogliame delle piante di Arabidopsis e di E. salsugineum, e il terzo e il quarto fogliame di A. hierochuntica sono stati raccolti, raggruppati, congelati in azoto liquido e conservati a -80°C. Quattro repliche biologiche sono state analizzate per ogni trattamento e sono stati eseguiti due esperimenti indipendenti. L’estrazione dei metaboliti è stata eseguita secondo Lisec et al. (2006) con piccole modifiche (Kazachkova et al., 2013).

La derivatizzazione è stata eseguita secondo Lisec et al. (2006) mentre la separazione, la valutazione dei cromatogrammi e l’identificazione/annotazione dei metaboliti sono state eseguite secondo Kazachkova et al. (2013). L’abbondanza relativa dei metaboliti è stata determinata normalizzando l’intensità del picco di ciascun metabolita allo standard di ribitolo, ottenendo valori di “risposta”. Questi valori sono stati normalizzati utilizzando la trasformazione log10 e analizzati statisticamente utilizzando il software MultiExperiment Viewer versione 3.1 (Saeed et al., 2003). Test ANOVA a due vie sono stati eseguiti tra tutte le specie e le specie accoppiate. Per individuare i metaboliti che sono stati significativamente influenzati dal trattamento del sale all’interno di ogni specie (Figura 8), un ANOVA a senso unico (Tabella supplementare S3) seguita da un test di Dunnett è stato eseguito. Per l’analisi delle componenti principali (PCA), i dati di risposta trasformati log10 sono stati utilizzati mentre il clustering gerarchico è stato eseguito sui valori di risposta lineare diviso per l’abbondanza mediana di ogni metabolita.

Risultati

A. hierochuntica Morfologia, organizzazione del genoma e contenuto di DNA

In natura, le piante di A. hierochuntica mostrano una grande variazione nella velocità di sviluppo e nelle dimensioni del corpo che vanno da pochi mm a 15-20 cm di altezza, a seconda della disponibilità di umidità del suolo. La figura 1 mostra i vari stadi di sviluppo di A. hierochuntica nelle nostre condizioni di laboratorio. Nelle prime fasi di crescita, le piante sono molto uniformi e producono due cotiledoni seguiti da due coppie opposte di foglie vere obovate e densamente irsute (Figure 1A-C). La biforcazione del germoglio inizia con la terza e la quarta foglia che si separano in rami individuali. Un’infiorescenza ascellare viene prodotta nel punto del ramo e forma un denso grappolo di fiori bianchi sub-sessili con quattro petali (Figure 1D,G,H). La biforcazione ripetuta procede tra le coppie successive di foglie più lanceolate, dentate e irsute, dando luogo a una struttura di germogli multipli e simpodiali che può variare notevolmente nell’architettura tridimensionale complessiva (Figure 1E,F). I frutti sono silicule pelose, a due ali, contenenti ciascuna quattro semi (Figure 1I-K).

E’ stato riportato utilizzando la colorazione con carminio acido che il genoma di A. hierochuntica è organizzato in 11 cromosomi (aploidi) (Lifante et al., 1992). Per confermare questa scoperta, abbiamo visualizzato i cromosomi di A. hierochuntica usando un protocollo di gocciolamento dei protoplasti (Anamthawat-Jonsson, 2003). Analisi di 4′, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) colorazione chiaramente mostrato la presenza di 22 cromosomi (diploide) (Figura 2A). La citometria a flusso ha rivelato che il genoma di A. hierochuntica è circa 4,5 volte più grande del genoma di Arabidopsis (Figure 2B,C). Per convalidare i nostri risultati, abbiamo anche eseguito la citometria a flusso con E. salsugineum e abbiamo dimostrato che il genoma di questa specie è circa il doppio del genoma dell’Arabidopsis come precedentemente riportato da Inan et al. Quindi, A. hierochuntica ha un genoma di circa 607 Mbp.

A. hierochuntica mostra tolleranza agli stress abiotici associati al suo habitat desertico

Le piante di Anastatica hierochuntica possono sperimentare temperature giornaliere superiori a 40°C. Inoltre, il deserto del Negev è caratterizzato da pozze di azoto del suolo frammentarie (Zaady, 2005). Per esempio, abbiamo misurato i livelli di NO3- del suolo che vanno da 0,4 a 4 mM (dati non mostrati). Abbiamo quindi testato se A. hierochuntica mostra una maggiore tolleranza allo stress termico e bassi livelli di NO3- nel terreno di crescita, rispetto all’Arabidopsis. Piantine coltivate in vitro (fase di due cotiledoni) di entrambe le specie sono sopravvissuti 1 h di stress termico (45 ° C) con una riduzione del 25% circa in peso fresco (FW) per entrambe le specie, ma nessun effetto sulla clorofilla o contenuto di carotenoidi (figure 3A-D; Figura supplementare S2). Due ore di stress termico hanno gravemente colpito le piantine di Arabidopsis lasciandole pallide o sbiancate (Figura 3A). Questo effetto si è riflesso in una riduzione del 67% in FW, e una riduzione del 45 e 54% del contenuto di clorofilla e carotenoidi, rispettivamente, rispetto alle piantine di controllo. D’altra parte, non c’è stata un’ulteriore riduzione del FW delle piantine di A. hierochuntica rispetto allo stress termico di 1 h e nessun effetto sui livelli di clorofilla e carotenoidi rispetto al controllo. Lo stress termico di 3 e 4 h ha causato un grave stress alle piantine di Arabidopsis, come manifestato dall’impossibilità di ulteriore crescita delle piantine e dallo sbiancamento quasi completo dei cotiledoni. Al contrario, A. hierochuntica ha mostrato una tolleranza al calore notevolmente maggiore rispetto all’Arabidopsis dopo 3 e 4 h di stress termico. Per esempio, lo stress termico di 4 ore ha causato un calo del 50% del FW dell’A. hierochuntica mentre l’Arabidopsis ha mostrato una riduzione del 73% del FW. Inoltre, le piantine di A. hierochuntica non si sono sbiancate ma hanno mantenuto i livelli di clorofilla a circa il 65% dei livelli di controllo senza alcun effetto dello stress termico sul contenuto di carotenoidi.

Anastatica hierochuntica anche visualizzato la tolleranza a basso stress N rispetto a Arabidopsis (Figura 3E). Arabidopsis ha mostrato una progressiva, forte riduzione in FW come NO3- livelli sono stati ridotti in agar nutriente, esibendo una riduzione del 75% in FW a 0,05 mM NO3- (Figura 3F; Figura supplementare S3). Al contrario, A. hierochuntica ha mostrato un calo molto più moderato in FW come i livelli di NO3- sono stati ridotti, e FW è sceso solo del 25% a 0,05 mM NO3-. La condizione di forte stress delle piantine di Arabidopsis a bassi livelli di NO3- si è manifestata con la produzione di quantità progressivamente maggiori di antociani man mano che i livelli di NO3- scendevano (Figura 3G). D’altra parte, nessuna differenza significativa nel contenuto di antociani di A. hierochuntica rispetto al controllo potrebbe essere individuata a qualsiasi livello di NO3-.

Poiché il deserto del Negev possiede isole di alta salinità e A. hierochuntica si trova anche in crescita nella valle del Mar Morto, abbiamo testato se A. hierochuntica esibisce una maggiore tolleranza allo stress salino rispetto a Arabidopsis. Una riduzione molto maggiore della crescita dell’Arabidopsis è stata individuata all’aumentare della concentrazione di sale rispetto a quella osservata nell’A. hierochuntica (Figure 4A-C; Figura supplementare S4). Per esempio, a 100 e 200 mM NaCl, Arabidopsis visualizzato una riduzione 55 e 77% in FW, rispettivamente, mentre A. hierochuntica FW è stato ridotto solo da 30 e 48% alla rispettiva concentrazione iso-salina (Figura 4A). Allo stesso modo, il peso secco è stato influenzato in misura minore in A. hierochuntica rispetto a Arabidopsis a 100 e 200 mM NaCl (Figura 4B). Anche l’area fogliare dell’Arabidopsis è stata colpita in misura maggiore dallo stress salino rispetto all’A. hierochuntica. Per esempio, l’Arabidopsis ha mostrato una riduzione del 74% dell’area fogliare a 200 mM NaCl mentre l’area fogliare dell’A. hierochuntica è scesa solo del 49% (Figura 4C). Inoltre, in un test di allungamento delle radici in vitro, le piantine di Arabidopsis hanno mostrato una chiara e drastica riduzione dose-risposta mediata dal sale nel tasso di crescita relativa delle radici, tanto che a 200 mM NaCl l’allungamento delle radici era praticamente cessato (Figura 4D). D’altra parte, 100 mM NaCl ha avuto solo un lieve effetto sul tasso di crescita relativa delle radici di A. hierochuntica, mentre l’allungamento delle radici è continuato anche a 200 mM NaCl (Figura 4E).

A. hierochuntica controlla strettamente l’accumulo di Na+ e mostra caratteristiche fotochimiche che sono resistenti allo stress salino

Una caratteristica della tolleranza naturale al sale è la capacità delle piante di controllare strettamente l’accumulo di Na+ (ad esempio, Kant et al., 2006). In condizioni di controllo, A. hierochuntica possedeva circa 4,5 volte tanto Na+ nei germogli quanto l’Arabidopsis, simile alla quantità tre volte maggiore di E. salsugineum Na+ nei germogli rispetto all’Arabidopsis (Figura 5A; Kant et al., 2006). Entrambe le specie hanno accumulato quantità crescenti di Na+ all’aumentare delle concentrazioni di sale, ma l’Arabidopsis ha accumulato Na+ in misura molto maggiore rispetto alla A. hierochuntica (Figura 5B). L’Arabidopsis e l’A. hierochuntica hanno mostrato livelli di K+ comparabili in condizioni di controllo e una riduzione simile del contenuto di K+ in risposta allo stress salino (Figura 5C). Così, in condizioni di controllo, l’A. hierochuntica aveva un rapporto Na+/K+ più alto dell’Arabidopsis (Figura 5D), ma con l’aumento delle concentrazioni di sale nel suolo, i rapporti Na+/K+ sono aumentati in misura molto minore nell’A. hierochuntica (Figure 5D,E). Entrambe le specie hanno mostrato rapporti FW/DW simili a tutte le concentrazioni di sale (Figura 5F), suggerendo che le differenze nel contenuto di ioni non era dovuto a variazioni nel contenuto di acqua del tessuto. Presi insieme, i nostri dati di analisi degli ioni suggeriscono che A. hierochuntica è in grado di controllare strettamente l’accumulo di Na+.

Di recente abbiamo riportato che A. hierochuntica in condizioni di controllo esibisce NPQ inferiore, un meccanismo di dissipazione dell’energia luminosa in eccesso, rispetto all’Arabidopsis, e un tasso di trasporto degli elettroni del fotosistema II relativamente più alto (PSII ETR) (Eppel et al., 2014). Nel presente studio, A. hierochuntica ha esibito un NPQ inferiore di circa il 50% rispetto all’Arabidopsis in condizioni di controllo (Figura 5G), e mentre lo stress salino non ha avuto alcun effetto sul NPQ dell’Arabidopsis, ha causato un ulteriore calo del 50% del NPQ di A. hierochuntica. In condizioni di controllo, PSII ETR era circa il 55% più alto in A. hierochuntica rispetto all’Arabidopsis (Figura 5H). Lo stress salino ha causato una caduta del PSII ETR in entrambe le specie, ma A. hierochuntica ha mantenuto un PSII ETR superiore del 45% rispetto all’Arabidopsis. Pertanto, i dati NPQ e PSII ETR suggeriscono che la fotochimica di A. hierochuntica mostra una notevole resilienza allo stress salino.

Arabidopsis, E. salsugineum, e A. hierochuntica Riprogrammazione metabolica in risposta allo stress salino

Eutrema salsugineum mostra estrema tolleranza al sale (Kant et al., 2006; Kazachkova et al, 2013), che ci ha dato l’opportunità di confrontare tre specie correlate provenienti da ambienti molto diversi, e che differiscono nella loro tolleranza al sale: la glicofita sensibile al sale Arabidopsis (Columbia temperata, MT, USA), e le due estremofite – moderatamente tollerante al sale A. hierochuntica (caldo, deserto secco del Negev), e altamente tollerante E. salsugineum (zone costiere fredde e salate della provincia di Shandong, Cina).

Arabidopsis, E. salsugineum, e le piante di A. hierochuntica coltivate nel suolo sono state esposte a concentrazioni crescenti di NaCl (E. salsugineum non è stato esposto a 50 mM NaCl a causa del lieve effetto di questa concentrazione; Kazachkova et al, 2013), e l’abbondanza relativa dei metaboliti primari di carbonio e azoto è stata determinata per il tessuto fogliare. Per ottenere una visione globale delle differenze tra le specie di piante e tra i trattamenti, è stata impiegata la PCA. L’ispezione delle prime due componenti principali, che rappresentano il 68% della varianza totale all’interno del set di dati, ha permesso la classificazione dei campioni per specie e trattamenti (Figura 6). La prima componente principale che rappresenta il 48,2% della varianza totale ha chiaramente separato il metabolismo dell’Arabidopsis dai suoi due parenti estremofiti (Figura 6A). Tra i metaboliti che più influenzano la separazione tra le specie (in ordine decrescente di valore assoluto dell’autovettore e confermato da ANOVA a due vie) erano raffinosio, malato, galattinolo, fumarato, acido fosforico e glicerato (tabelle supplementari S1 e S2). Nel complesso, il test ANOVA a due vie per tutte e tre le specie ha rivelato che 25 dei 33 metaboliti erano significativamente diversi tra le specie (Tabella supplementare S2). Tra questi 25 metaboliti, 22 metaboliti anche visualizzato una specie significativa × interazione sale-trattamento.

La seconda componente principale che rappresenta il 19,8% della varianza totale ha discriminato i campioni secondo il trattamento del sale. Tra i metaboliti che più influenzano la separazione tra i campioni (in ordine decrescente di valore assoluto dell’autovettore e confermato dall’ANOVA a due vie) sono stati prolina, malato, raffinosio, serina, fumarato e mio-inositolo. Nel complesso, 20 metaboliti sono risultati significativamente diversi tra i trattamenti con sale (Tabella supplementare S2). Controllo e sale trattati gruppi di campioni Arabidopsis erano sostanzialmente sparsi attraverso la seconda componente, mentre E. salsuginem e A. gruppi di campioni hierochuntica erano più condensati.

La completa separazione dei profili metabolici di Arabidopsis e le due estremofite, e la risposta metabolica parzialmente sovrapposta di E. salsugineum e A. hierochuntica suggerito sia risposte comuni e specie-specifiche delle estremofite allo stress da sale (Figura 6A). Questa nozione è stata supportata dall’analisi di clustering gerarchico (HCA) che ha posto le due estremofite su un clade separato da Arabidopsis ma ha separato E. salsugineum e A. hierochuntica su due sottocladi (Figura 6C). La PCA delle due estremofite da sola ha illustrato chiaramente la risposta metabolica specie-specifica allo stress salino (Figura 6B). I metaboliti che hanno principalmente influenzato la separazione degli estremofiti (in ordine decrescente di valore assoluto dell’autovettore e confermato dal test ANOVA a due vie) sono stati: prolina, citrato, aspartato, raffinosio, acido treonico e acido piroglutammico (tabelle supplementari S1 e S2).

L’esame dei singoli metaboliti in condizioni di controllo ha rivelato un fenotipo metabolico complessivamente comparabile tra le due estremofite, con la maggior parte dei metaboliti che mostrano un’abbondanza significativamente maggiore in A. hierochuntica e E. salsugineum rispetto all’Arabidopsis (Figura 7). Tra i metaboliti che mostrano differenze tra Arabidopsis e le due estremofite in condizioni di controllo sono stati: (i) gli intermedi del ciclo TCA, citrato e malato che erano significativamente più alti nelle estremofite, e fumarato che era significativamente più alto in Arabidopsis; (ii) gli zuccheri, glucosio e fruttosio; (iii) gli esosi fosfati, fruttosio-6-fosfato e glucosio-6-fosfato; (iv) acido fosforico; (v) gli antiossidanti, ascorbato e deidroascorbato (Foyer e Noctor, 2011). I livelli dei metaboliti indicati in (ii) a (v) erano tutti più alti nelle estrofite. Inoltre, la prolina osmoprotettrice (Smirnoff e Cumbes, 1989) era più alta nelle piante di estremofite in condizioni di controllo, mentre gli osmoprotettrici mio-inositolo (anche un precursore del galattinolo osmoprotettore; Bohnert et al., 2006) e galattinolo (anche un precursore del raffinosio osmoprotettore; Taji et al., 2002; Nishizawa et al., 2008) erano più alti in Arabidopsis. È interessante notare che la maggior parte dei metaboliti ha mostrato livelli significativamente più bassi in A. hierochuntica rispetto a E. salsugineum.

L’ispezione dei livelli di metaboliti in risposta allo stress salino ha rivelato solo alcune risposte metaboliche comuni. Tutte e tre le specie hanno mostrato un aumento dei livelli degli osmoprotettori mio-inositolo e prolina in risposta allo stress salino (Figura 8). In particolare, l’E. salsugineum ha mostrato un maggiore contenuto di prolina rispetto all’Arabidopsis e all’A. hierochuntica al controllo e a 100 mM NaCl. Alti livelli di prolina sono una caratteristica ben caratterizzata di E. salsugineum coltivato nel suolo e ben fertilizzato (Kant et al., 2006; Guevara et al., 2012; Kazachkova et al., 2013). Inoltre, i livelli di glicina sono stati ridotti in risposta allo stress in tutte e tre le specie, anche se il livello effettivo di glicina era più alto in Arabidopsis a tutti i livelli di trattamento rispetto alle estremofite.

In contrasto con le poche risposte metaboliche comuni tra le tre specie, un numero considerevole di metaboliti ha mostrato una risposta complessiva comune in entrambe le ellitofite che era diversa da quella osservata in Arabidopsis. Per esempio, tra gli amminoacidi, il livello di alanina nell’Arabidopsis è diminuito gradualmente in risposta al sale, mentre è rimasto costitutivamente alto nelle endofite e persino in leggero aumento in A. hierochuntica a 200 mM NaCl. L’aspartato era a malapena rilevabile in Arabidopsis, ma aumentava sostanzialmente con la concentrazione di sale in entrambe le specie di estremofite, ma in particolare in E. salsugineum. Al contrario, i livelli di treonina sono aumentati drammaticamente in Arabidopsis, mentre sono rimasti relativamente più bassi nelle estremofite, con un piccolo ma significativo aumento in A. hierochuntica a livelli di sale più alti. La serina e il glicerato, che sono intermedi del ciclo fotorespiratorio, hanno anche mostrato differenze di accumulo tra le estremofite e l’Arabidopsis. Il contenuto di serina è aumentato in risposta al sale sia in Arabidopsis che in A. hierochuntica, ma si è accumulato a livelli notevolmente più alti in Arabidopsis alla più alta concentrazione di sale. D’altra parte, la serina ha mostrato solo una leggera diminuzione mediata dal sale in E. salsugineum. I livelli complessivi di glicerato erano molto più bassi nell’Arabidopsis che nelle estremofite. Inoltre, mentre il glicerato non ha mostrato alcuna risposta al sale in Arabidopsis, è stato mantenuto a un livello costantemente più alto in A. hierochuntica e ha mostrato un aumento mediato dal sale in E. salsugineum.

I livelli degli intermedi del ciclo TCA, citrato e malato, erano sostanzialmente più alti nelleantofite rispetto all’Arabidopsis. Tuttavia, mentre in E. salsugineum entrambi i livelli di citrato e malato sono aumentati significativamente in risposta al sale, i livelli di citrato in A. hierochuntica sono aumentati significativamente mentre il malato è rimasto a un livello costantemente più alto che in Arabidopsis. Il contenuto di fumarato, d’altra parte, era sostanzialmente più alto in Arabidopsis, diminuendo in risposta allo stress salino, ma rimanendo costantemente basso nelle estremofite. I livelli di altri acidi carbossilici, come l’ascorbato e il deidroascorbato, erano costitutivamente più alti nelle estremofite che nell’Arabidopsis.

Sono state osservate anche differenze nel contenuto di zuccheri tra Arabidopsis e le estremofite. Le differenze più evidenti erano nei livelli degli osmoprotettori galattinolo e raffinosio (Taji et al., 2002; Nishizawa et al., 2008). Entrambi sono aumentati drammaticamente nell’Arabidopsis, ma sono stati indotti in misura molto inferiore nelle utofite. Inoltre, il fruttosio-6-fosfato e il glucosio-6-fosfato si sono accumulati in misura maggiore nelle estremofite, essendo mantenuti a livelli complessivamente costanti in A. hierochuntica, mentre sono stati significativamente ridotti in E. salsugineum in risposta al sale.

Abbiamo anche individuato risposte specie-specifiche che si differenziano tra le estremofite. Per esempio, il livello di serina in E. salsugineum è stato significativamente ridotto dallo stress salino, mentre in A. hierochuntica il contenuto di serina è aumentato significativamente. Il piroglutammato (probabilmente parte della via di riciclaggio del glutatione, un osmoprotettore e un serbatoio di Glu (Ohkama-Ohtsu et al., 2008; Kumar e Bachhawat, 2012; Schreiber et al, 2012), fruttosio e glicerofosfoglicerolo hanno tutti mostrato livelli costitutivamente più alti in E. salsugineum rispetto a A. hierochuntica.

A. hierochuntica è tollerante al grave stress ossidativo

I livelli costitutivamente più alti dei composti antiossidanti ascorbato e deidroascorbato in A. hierochuntica (ed E. salsugineum) rispetto all’Arabidopsis (Figure 7 e 8) suggeriscono che A. hierochuntica possiede un sistema antiossidante costitutivamente attivo. Il confronto della risposta delle piantine di Arabidopsis e di A. hierochuntica al viologo metile (MV) che forma ROS (Babbs et al., 1989; Fujii et al., 1990), ha dimostrato che le piantine di A. hierochuntica hanno mostrato una notevole tolleranza a concentrazioni crescenti di MV rispetto all’Arabidopsis (Figura 9A). A. hierochuntica shoot FW e l’allungamento delle radici è diminuito in misura molto minore rispetto all’Arabidopsis con l’aumento della concentrazione di MV. Inoltre, A. hierochuntica mantenuto i livelli di clorofilla totale in risposta a concentrazioni estreme MV (12 μM), mentre i livelli di clorofilla sono stati ridotti in Arabidopsis, che ha esposto segni di sbiancamento (figure 9A-D; Figura supplementare S5). I gravi sintomi di stress osservati in Arabidopsis si riflettevano anche nell’alto accumulo di antociani in risposta a MV mentre solo bassi livelli di antociani sono stati osservati in A. hierochuntica (Figura 9E). Questi dati suggeriscono che A. hierochuntica ha un sistema antiossidante altamente attivo.

Discussione

Anastatica hierochuntica – Una pianta del deserto di Lineage III che è tollerante a molteplici stress abiotici

La famiglia delle Brassicaceae comprende oltre 3.600 specie tra cui molte colture importanti e il sistema di piante modello A. thaliana (Franzke et al., 2011; Al-Shehbaz, 2012). Contiene 301 generi classificati in 49 tribù monofiletiche. La famiglia può essere suddivisa in due gruppi principali: il gruppo Aethionema e il gruppo core (Franzke et al., 2011), quest’ultimo dei quali può essere diviso in tre lignaggi principali (lignaggi I, II e III).

Negli ultimi anni, un certo numero di risorse genomiche sono state generate per le Brassicaceae fornendo così una piattaforma impressionante per studi di biologia evolutiva e comparativa. Almeno 36 genomi sono stati sequenziati o sono in corso di sequenziamento (Koenig e Weigel, 2015) tra cui 13 specie del lignaggio I (ad esempio, A. thaliana, Arabidopsis lyrata, Capsella rubella), 17 specie del lignaggio II o del lignaggio II esteso (ad esempio, Arabis alpina, Brassica napus, E. salsugineum, S. parvula) ma solo tre specie del lignaggio III (Diptychocarpus strictus, Euclidium syriacum, Malcolmia maritima) (Franzke et al., 2011; Kiefer et al., 2014; Huang et al., 2015). Inoltre, tra i genomi completati, nessuno proviene da specie del lignaggio III. Questa ricca collezione di genomi offre un mezzo per comprendere caratteristiche come lo sviluppo e la storia della vita che possono mancare in A. thaliana. In particolare, gli estremofiti della famiglia delle Brassicaceae che prosperano in alcuni degli ambienti più estremi offrono sistemi eccellenti per comprendere i meccanismi molecolari alla base dell’adattamento ad ambienti difficili.

L’estremofita A. hierochuntica della tribù delle Anastaticeae appartiene alle specie del lignaggio III poco rappresentate (Couvreur et al., 2010; Kiefer et al., 2014; Huang et al., 2015), per le quali esiste una carenza di conoscenze fisiologiche e molecolari. Inoltre, A. hierochuntica presenta un’opportunità per il confronto di un annuale del deserto con estremofite Brassicaceae come E. salsugineum che faciliterà la nostra comprensione di come le piante si sono adattate a habitat estremi molto diversi.

Nello studio attuale, abbiamo dimostrato che A. hierochuntica è tollerante a diversi stress associati al suo habitat desertico, vale a dire alte temperature, basso suolo N, e salinità (figure 3 e 4). Sia la tolleranza al calore che la tolleranza al basso contenuto di N sono caratteristiche importanti per le quali A. hierochuntica potrebbe essere una fonte di nuovi determinanti di tolleranza. Lo stress da calore, soprattutto se combinato con la siccità, può portare a enormi perdite nella produzione delle colture (Mittler, 2006; Mittler e Blumwald, 2010; Lesk et al., 2016) soprattutto perché i cereali sono più sensibili a questi stress durante la fase di riempimento dei chicchi (Barnabas et al., 2008). Infatti, un recente rapporto ha identificato la tolleranza al calore nel grano nella fase riproduttiva come un tratto chiave per aumentare le rese sotto il cambiamento climatico previsto (Stratonovitch e Semenov, 2015). Sebbene i rapporti dettagliati sulle estremofite in grado di resistere a temperature estremamente elevate siano scarsi, alcuni lavori sono iniziati (Emad El-Deen, 2005; Lawson et al., 2014; Yates et al., 2014; Gallas e Waters, 2015). Rhazya stricta in particolare, può mantenere la fotosintesi pienamente funzionale in campo a temperature fogliari fino a 43°C insieme a intensità di luce >1000 μmol fotoni m-1 s-1 (Lawson et al., 2014).

L’efficienza di utilizzo dell’azoto (NUE) è un altro tratto che è stato al centro di molte ricerche e sforzi di breeding (McAllister et al., 2012; Han et al., 2015). Le piante coltivate sfruttano solo circa il 30-40% del N applicato (Raun e Johnson, 1999), e il restante N viene perso per lisciviazione, denitrificazione, volatilizzazione, erosione del suolo e consumo microbico, aumentando così sia l’inquinamento ambientale N che i costi di produzione (Good et al., 2004). Poiché il breeding tradizionale per migliorare l’NUE ha raggiunto un plateau, l’uso di estremofite poco tolleranti all’N è stato suggerito come un approccio per identificare nuovi alleli e geni (Kant et al., 2011). Infatti, E. salsugineum è più tollerante alle condizioni di limitazione di N rispetto all’Arabidopsis, e possiede un più alto contenuto di N, amminoacidi totali e proteine totali solubili a bassi livelli di N nel suolo (Kant et al., 2008). Il più alto NUE di E. salsugineum può essere in parte attribuito all’assorbimento costitutivamente più elevato di NO3- in condizioni di basso N, così come l’espressione differenziale dei geni che codificano l’assimilazione di NO3- e i geni trasportatori.

A. hierochuntica e E. salsugineum condividono simili caratteristiche di assorbimento del sale e di fotosintesi in risposta allo stress salino

Anastatica hierochuntica ha mostrato diverse caratteristiche fisiologiche di tolleranza al sale che sono simili a quelle osservate in E. salsugineum (Inan et al, 2004; Kant et al., 2006). In primo luogo, in condizioni di controllo, A. hierochuntica possiede livelli di Na+ più alti di Arabidopsis (Figura 5). In E. salsugineum, un più alto contenuto di Na+ nei germogli probabilmente aiuta a mantenere un potenziale osmotico fogliare costitutivamente più negativo rispetto all’Arabidopsis (Inan et al., 2004). In secondo luogo, in condizioni saline A. hierochuntica mostra uno stretto controllo dell’accumulo di Na+ rispetto all’Arabidopsis (Figure 5A-D), di nuovo simile a E. salsugineum (Kant et al., 2006). Una corrente in entrata di Na+ significativamente ridotta e un minore afflusso di Na+ nelle radici di E. salsugineum rispetto all’Arabidopsis (Volkov e Amtmann, 2006; Wang et al., 2006), così come l’espressione differenziale di un gene che codifica l’antiportere Na+/H+, SOS1 (Kant et al, 2006), probabilmente contribuiscono al controllo rigoroso dell’assorbimento di Na+ nell’estremofita.

In terzo luogo, A. hierochuntica mostra un trasporto di elettroni PSII più alto e un NPQ più basso di Arabidopsis in condizioni di controllo e saline, suggerendo che una maggiore quantità di energia luminosa viene utilizzata per scopi produttivi in A. hierochuntica che in Arabidopsis (Figure 5G,H). E. salsugineum è anche in grado di mantenere un NPQ più basso di Arabidopsis in condizioni saline, mentre il trasporto di elettroni PSII aumenta effettivamente in risposta al sale (Stepien e Johnson, 2009).

A. hierochuntica possiede un sistema antiossidante altamente attivo

Anastatica hierochuntica mostra costitutivamente alti livelli di composti antiossidanti (Figure 7 e 8) e una sorprendente tolleranza alla MV generatrice di ROS (Figura 9) suggerendo che A. hierochuntica possiede un sistema antiossidante altamente attivo, che è una caratteristica comune delle estremofite. In E. salsugineum e S. parvula, per esempio, diversi enzimi coinvolti nel ROS scavenging sono altamente attivi, e i metaboliti antiossidanti come la tioredossina, l’ascorbato e il deidroascorbato mostrano livelli costitutivamente più alti che in Arabidopsis (M’rah et al., 2007; Kazachkova et al., 2013; Uzilday et al., 2014). Una maggiore espressione dei geni di E. salsugineum che codificano i componenti del macchinario antiossidante sia in condizioni di controllo che di stress salino potrebbe essere alla base delle maggiori attività enzimatiche e dei livelli antiossidanti (Taji et al., 2004; Gong et al., 2005).

I meccanismi antiossidanti attivi non sono importanti solo per le estremofite del deserto o le alofite ma sono anche cruciali per altre estremofite. Per esempio, le piante artiche come Deschampsia antarctica, devono sostenere la fotochimica sotto una combinazione di basse temperature e alta luce. D. antarctica possiede un’attività di superossido dismutasi (SOD) costitutivamente più alta rispetto ad altre Poaceae, esprime un isozima MnSOD resistente al perossido di idrogeno durante l’acclimatazione al freddo, e produce una serie di composti protettivi UV-B inducibili (Xiong e Day, 2001; Perez-Torres et al., 2004; Ruhland et al., 2005).

Oltre ai meccanismi antiossidanti, i processi di dissipazione di energia possono anche prevenire la generazione di ROS dannosi. Per esempio, nelle estremofite come A. hierochuntica e la pianta alpina Ranunculus glacialis, la fotorespirazione gioca un ruolo nella dissipazione di energia (Streb et al., 2005; Eppel et al., 2014). Tuttavia, questo non sembra essere il caso di E. salsugineum. Piuttosto, c’è un aumento mediato dallo stress nei livelli proteici dell’ossidasi terminale plastidica che potrebbe funzionare come un sink alternativo di elettroni e prevenire la generazione di ROS (Stepien e Johnson, 2009). È interessante notare che la quantità di PTOX nelle foglie di R. glacialis supera la quantità trovata in tutte le altre specie di piante esaminate, e anche quando il flusso di elettroni per l’assimilazione, la fotorespirazione e la reazione di Mehler sono bloccati, le foglie di R. glacialis sotto alta intensità luminosa possono mantenere il flusso di elettroni (Streb et al., 2005; Laureau et al, 2013).

Quindi, per le estremofite che incontrano una combinazione di gravi stress come A. hierochuntica (alta intensità luminosa, alte temperature, basso stato di nutrimento del suolo, suoli salini), sistemi antiossidanti altamente attivi spesso accoppiati con meccanismi di dissipazione dell’energia in eccesso sembrano cruciali per la sopravvivenza in habitat estremi.

Le estremofite di diversi habitat mostrano strategie metaboliche comuni e distinte per far fronte allo stress salino

I nostri dati di profilo metabolico hanno suggerito che le estremofite possiedono sia cambiamenti comuni che specie-specifici mediati dallo stress nel metabolismo che sono diversi dall’Arabidopsis (Figure 6-8). Inoltre, l’analisi PCA ha suggerito che i diversi livelli di stress salino causano cambiamenti molto più grandi in Arabidopsis che nelle estremofite (Figura 6) indicando che A. hierochuntica e E. salsugineum possono essere innescati per lo stress in accordo con altri rapporti su E. salsugineum (ad esempio, Kant et al., 2006; Kazachkova et al., 2013; Vera-Estrella et al., 2014). Un ulteriore supporto alla nozione che le estremofite sono preparate per lo stress potrebbe essere visto nell’analisi dei livelli di metaboliti in condizioni di controllo (Figura 7). Entrambe le estremofite hanno mostrato l’accumulo di antiossidanti, zuccheri e intermedi del ciclo TCA, che hanno precedentemente dimostrato di essere importanti per le risposte delle piante a vari stress, tra cui sale e siccità (Smirnoff, 1996; Urano et al., 2009; Lugan et al., 2010; Obata e Fernie, 2012). Non tutte le estremofite, tuttavia, sono preparate per lo stress. Per esempio, il legume estremofita tollerante al sale Lotus creticus non esibisce tale fenomeno (Sanchez et al., 2011).

Sono state osservate differenze sorprendenti tra le estremofite e l’Arabidopsis nell’abbondanza di intermedi specifici del ciclo TCA. Entrambe le estremofite hanno mostrato alti livelli di malato e citrato ma bassi livelli di fumarato, mentre l’Arabidopsis ha mostrato il modello opposto (Figure 7 e 8). Questa firma metabolica sembra essere una caratteristica importante di extremophyte Brassicaceae in condizioni di controllo, sale e basso-N e indipendentemente dalle piattaforme di crescita (Kant et al., 2008; Kazachkova et al., 2013). Abbiamo precedentemente ipotizzato che un grande aumento del pool di malato e bassi livelli di fumarato potrebbe riflettere la generazione di ossalacetato per fornire scheletri di carbonio per una maggiore sintesi di aminoacidi in E salsugineum (Kazachkova et al., 2013). L’ossalacetato può essere ulteriormente metabolizzato in aspartato (Sweetlove et al., 2010), e infatti abbiamo osservato livelli più alti di controllo e indotti dal sale di aspartato nelle estremofite rispetto all’Arabidopsis. Un uso dei livelli più alti di aspartato potrebbe essere quello di fornire gruppi amminici al ciclo fotorespiratorio attraverso la glicina (Novitskaya et al., 2002). Anche l’alanina può contribuire con gruppi amminici alla glicina durante la fotorespirazione (Liepman e Olsen, 2001; Novitskaya et al., 2002), e le estremofite sono state in grado di mantenere i livelli di alanina in condizioni di controllo e di stress salino, mentre il contenuto di alanina è diminuito in Arabidopsis in risposta al sale. Coerentemente con l’idea che le estremofite possono sostenere il flusso metabolico attraverso il ciclo fotorespiratorio, il rapporto glicina-serina era sempre più basso nelle estremofite che nell’Arabidopsis. Un alto rapporto glicina-serina è spesso correlato all’ossigenazione della rubisco nelle fasi a breve termine dopo l’induzione delle condizioni fotorespiratorie (Novitskaya et al., 2002). Tuttavia, l’aumento del flusso attraverso la via fotorespiratoria causa una riduzione del rapporto glicina-serina (Timm et al., 2012). Un ulteriore supporto per un maggiore flusso fotorespiratorio nelle estremofite può essere derivato dai più alti livelli di glicerato in A. heirochuntica e E. salsugineum in condizioni di controllo e di stress salino rispetto all’Arabidopsis. Il glicerato è il prodotto della penultima reazione nella via fotorespiratoria e viene convertito in 3-fosfoglicerato, che viene reimmesso nel ciclo di Calvin (Hagemann e Bauwe, 2016). Come menzionato sopra, la fotorespirazione gioca un ruolo importante nella dissipazione dell’energia in eccesso in A. hierochuntica (Eppel et al., 2014).

Un altro motivo per i bassi livelli di malato in Arabidopsis rispetto alle estremofite potrebbe essere dovuto alla probabile maggiore inibizione mediata dal sale della fotosintesi in Arabidopsis (Stepien e Johnson, 2009). Questo potrebbe portare a un ridotto flusso di carbonio attraverso la via glicolitica e quindi a una necessità di conversione del malato in piruvato da parte dell’enzima malico per mantenere la funzione del ciclo TCA (Casati et al., 1999). D’altra parte, sia A. hierochuntica che E. salsugineum mostrano un tasso fotosintetico relativamente più alto e un NPQ più basso di A. thaliana e di altre specie di piante, in condizioni di controllo e di sale, e sotto varie concentrazioni di CO2 e intensità di luce (Figure 5G,H; Stepien e Johnson, 2009; Eppel et al., 2014). Infatti, i livelli complessivi più elevati di glucosio, fruttosio, glucosio 6-fosfato e fruttosio 6-fosfato nelle estremofite possono indicare un flusso di glicolisi più elevato o dalla fotosintesi o dal consumo di amido, che può mantenere l’ingresso del piruvato nel ciclo TCA.

Raffinosio e il suo precursore galattinolo sono ritenuti essere osmoprotettori e antiossidanti (Taji et al, 2002; Nishizawa et al., 2008; Farrant et al., 2009). Abbiamo osservato un grande aumento del contenuto di galattinolo e raffinosio in Arabidopsis in risposta al sale, mentre i livelli di questi metaboliti sono rimasti bassi nelle estremofite (Figura 8). È degno di nota il fatto che le estremofite provenienti da due habitat molto diversi si siano entrambe evolute per evitare l’accumulo di alti livelli di raffinosio come componente di tolleranza allo stress simile al muschio a spiga tollerante all’essiccazione Selaginella lepidophylla (Yobi et al., 2012). Anche se non è chiaro quale vantaggio si ottiene non accumulando il raffinosio, questo zucchero può essere metabolizzato in saccarosio e successivamente in glucosio e fruttosio per la glicolisi.

L’aumento dell’accumulo di metaboliti osservato nelle estremofite è costoso (Munns, 2002) e potrebbe contribuire al tasso di crescita più lento di E. salsugineum rispetto all’Arabidopsis (Lugan et al., 2010). Tuttavia, A. hierochuntica, dove i livelli della maggior parte dei metaboliti e quindi i costi sono più bassi rispetto all’E. salsugineum, mostra una germinazione e un insediamento rapido delle piantine. È possibile che l’habitat salino di E. salsugineum richieda costantemente alti livelli di soluti compatibili e antiossidanti. Al contrario, A. hierochuntica è esposta a livelli di salinità più bassi di E. salsugineum, ma sperimenta un’intensa radiazione luminosa, una bassa disponibilità di acqua e nutrienti e temperature estreme. Accumulando composti specifici, come gli antiossidanti, mentre accumula moderatamente altri soluti come zuccheri e aminoacidi, A. hierochuntica potrebbe aver sviluppato una strategia di tolleranza allo stress con costi metabolici più bassi, adatta al suo habitat specifico, permettendo un rapido insediamento delle piantine e un rapido completamento del suo ciclo vitale per evitare la stagione secca.

Contributi degli autori

GE, RS, e SB hanno concepito e progettato lo studio. GE e RS hanno eseguito tutti gli esperimenti tranne il conteggio dei cromosomi, la fluorescenza della clorofilla e la citometria a flusso, che sono stati eseguiti rispettivamente da AK, AE e AC, sotto la supervisione di SB, SR e NT-Z. GE e YK, sotto la supervisione di AF, hanno eseguito gli esperimenti di profilo metabolico e l’analisi dei dati. TA ha partecipato agli esperimenti di stress ossidativo. YG ha supervisionato e partecipato alle raccolte sul campo di A. hierochuntica e ha dato consigli sui protocolli di crescita. GE e SB hanno scritto l’articolo e tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto.

Finanziamento

Questa ricerca è stata sostenuta dalla Fondazione Koshland per il sostegno della ricerca interdisciplinare nella lotta contro la desertificazione, il Goldinger Trust Jewish Fund for the Future, e il programma I-CORE del Comitato di pianificazione e di bilancio e la Israel Science Foundation .

Dichiarazione di conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano Noga Sikron per l’eccellente aiuto tecnico e Albert Batushansky per la consulenza statistica. Apprezziamo la gentile donazione di semi di R. sativus da parte del Prof. J. Doležel. Grazie al Gilat Hasade Services Laboratory per le misurazioni del contenuto di ioni, e a María Fernanda Arroyave Martínez per la foto della crescita di Arabidopsis e A. hierochuntica a intensità di luce più elevate. Siamo molto grati ad Anna Amtmann per la lettura critica di questo manoscritto.

Materiale supplementare

Il materiale supplementare per questo articolo può essere trovato online su: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fpls.2016.01992/full#supplementary-material

Footnotes

1. ^http://www.ims.gov.il/IMSENG/All_Tahazit/homepage.htm
2. ^http://rsbweb.nih.gov/ij/