Gli agonisti del recettore adrenergico Alfa-2 bloccano il reinserimento indotto dallo stress della ricerca di cocaina

Sperimentazione 1: Effetti di Clonidina, Lofexidine e Guanabenz sul rilascio di NE indotto da Footshock

Soggetti

I soggetti erano ratti maschi Long-Evans (Charles River, Quebec) di peso 300-350 g all’inizio dell’esperimento. Per tutta la durata dell’esperimento, gli animali sono stati alloggiati in una stanza di colonia a umidità e temperatura controllata con un programma luce-buio invertito (luci accese 1730-0530 ore) e hanno avuto libero accesso a cibo e acqua standard per ratti da laboratorio. Le procedure sperimentali hanno seguito le linee guida CCAC e sono stati approvati dal Comitato per la cura degli animali, Concordia University.

Chirurgia

Prima della chirurgia, i ratti sono stati anestetizzati con pentobarbital di sodio (65 mg / kg, i.p.) e sono stati iniettati con atropina solfato (0,6 mg / ml; 0,2 ml / ratto, SC) e antibiotico (Penlong, Rogar / STB Inc.; 0,1 ml / ratto, i.m.). Cannule guida (20 gauge; Plastics One) sono stati impiantati per il successivo inserimento di sonde di dialisi, uno è stato posto in PFC e uno in AMG in emisferi opposti. Gli animali utilizzati per studiare gli effetti del guanabenz hanno ricevuto una singola cannula guida puntata su PFC. L’emisfero in cui sono state impiantate le rispettive cannule guida è stato controbilanciato tra i trattamenti. Le coordinate stereotassiche utilizzate (relative al bregma e alla superficie del cranio) erano le seguenti: AMG, AP -3.0 mm, ML ± 4.5 mm, DV -6.7 mm; PFC, AP + 3.2 mm, ML ± 0.5 mm, DV -1.5 mm (Paxinos e Watson 1997). Al momento dell’inserimento, l’asta della sonda di dialisi si estendeva di 1 mm dalle cannule guida. Le cannule guida impiantate sono state fissate al cranio con viti in acciaio inossidabile e cemento dentale. Le cannule guida sono stati chiusi con obduratori a vite. Tutti gli animali sono stati restituiti alla stanza della colonia per un periodo di recupero di non meno di 1 settimana prima del test.

Microdialisi

Microdialisi è stata condotta in quattro camere di prova esagonali (42 × 39 × 33,5 cm) costruito da Plexiglas con soffitti in legno e pavimenti in acciaio inox asta. Le tende scure sono state tirate intorno ad ogni camera e l’illuminazione è stata fornita a ciclo inverso da lampadine in testa (15 W). La sonda di dialisi consisteva in una lunghezza di 1,8 mm (AMG) o 3,5 mm (PFC) di membrana di dialisi semipermeabile (Spectra/Por; 240 μm o.d., 13000 M.W. cutoff), chiusa ad un’estremità e collegata all’altra ad una lunghezza di 19 mm di tubo di acciaio inossidabile 26 gauge. Una lunghezza da 40 a 50 cm di tubo PE-20 ha collegato l’altra estremità dell’albero in acciaio inossidabile a una girella di infusione posizionata sopra la camera di prova che era a sua volta collegata tramite tubo PE-20 a una pompa di infusione a velocità variabile. Un tubo di silice fusa di piccolo diametro si estendeva internamente attraverso la sonda, con un’estremità appoggiata a 0,5 mm dalla punta della sonda e l’altra estremità che usciva dal tubo PE 35 cm sotto la girella di infusione. La lunghezza esterna del tubo PE-20 è stata protetta da danni mediante involucri di acciaio a molla. Le sonde sono state progettate in modo che l’intera lunghezza della membrana semipermeabile si estendesse sotto la punta della cannula guida.

Squadre separate di animali sono state utilizzate per esaminare gli effetti di ciascuno dei farmaci testati. All’interno di ogni squadra, ogni animale è stato assegnato in modo casuale alla condizione di trattamento. Gli animali che hanno ricevuto iniezioni di veicoli sono stati eseguiti in ogni squadra, ma sono stati combinati in un unico gruppo per l’analisi statistica. Dimensioni del gruppo finale (PFC / AMG) sono stati i seguenti: veicolo (n = 15/17), clonidina 20 μg/kg (n = 7/6), clonidina 40 μg/kg (n = 9/5), lofexidina 75 μg/kg (n = 6/6), lofexidina 150 μg/kg (n = 5/6), guanabenz 640μg/kg (n = 4, PFC). Con l’eccezione degli animali che hanno ricevuto guanabenz, tutti i soggetti sono stati dializzati due volte, una volta nel PFC e una volta nell’AMG con un intervallo di 3-4 settimane tra i test.

Le sonde sono state inserite il giorno prima dell’inizio dei test di microdialisi. Per evitare l’occlusione, CSF artificiale (145 mM Na +, 2.7 mM K +, 1.22 mM Ca2 +, 1.0 mM Mg2 +, 150 mM Cl-, 0.2 mM ascorbato, 2 mM Na2HPO4, pH 7.4 ± 0.1) è stato perfuso durante la notte ad un tasso di 0.06 μl/min. Il campionamento del dialisato e il monitoraggio dell’attività sono iniziati la mattina successiva. La portata del dialisato è stata aumentata a 0,6 μl / min, e campioni di dialisato linea di base (∼12 μl / campione) sono stati raccolti ogni 20 min. I campioni sono stati raccolti fino al raggiungimento di una linea di base stabile, definita come un minimo di tre campioni consecutivi in cui i livelli di NE nel dialisato variavano di ±10%. Dopo l’istituzione di livelli stabili di NE, tutti gli animali hanno ricevuto una iniezione i.p. (1 ml / kg) del farmaco appropriato o veicolo che è stato dato 40 min prima di un periodo di 10 min di shock del piede. Gli shock sono stati consegnati su un programma di tempo variabile ad un intervallo medio di 40 secondi (10-70 secondi gamma), ogni shock (0.6 mA) era 0.5 secondi di durata. I campioni sono stati raccolti per altri 120 minuti (6 campioni). I campioni sono stati immediatamente analizzati utilizzando uno dei due sistemi simili di cromatografia liquida ad alte prestazioni con rilevamento elettrochimico (HPLC-EC). I campioni (10 μl) sono stati caricati su colonne a fase inversa (15 × 0,46 cm; HAISIL C18, 5 μm; Sci. Products & Equipment, Concord, Ontario) attraverso porte di iniezione manuale (Reodyne 7125; loop da 20 μl); le correnti di riduzione e ossidazione per NE, acido diidrossifenilacetico (DOPAC), acido 5-idrossindoleacetico (5-HIAA) e acido omovanillico (HVA) sono state misurate con rilevatori coulometrici ESA a doppio canale (Coulochem 5100, con una cella di condizionamento modello 5021 e una cella analitica modello 5011, Sci. Products & Equipment). Le correnti per NE sono state misurate indipendentemente da quelle per DOPAC e HVA utilizzando canali separati dei rivelatori Coulochem. Le fasi mobili (acetato di sodio 36 mM, SOS 3,1 mM, EDTA 100 μM, 5% acetonitrile, regolata a pH 3,7 utilizzando acido acetico glaciale) sono stati fatti circolare attraverso ogni sistema chiuso ad una velocità di flusso di 1,4 ml/min da Waters 510 pompe HPLC. I picchi ottenuti per NE, DOPAC e HVA sono stati integrati e quantificati da EZChrom Chromatography Data System (Sci. Products & Equipment). I campioni di dialisato dei singoli ratti sono sempre stati analizzati con lo stesso sistema HPLC-EC, e l’assegnazione degli animali a ciascun sistema è stata controbilanciata in tutti i gruppi di trattamento. Il cibo è stato rimosso dalle camere prima del campionamento, ma era disponibile un tubo per bere acqua. Al termine del test, la conferma del corretto posizionamento della sonda è stata determinata dall’esame delle sezioni 30 μm tagliate attraverso i siti di posizionamento della sonda colorata con violetto di Cresile.

Sperimentazione 2: Effetti della clonidina su Footshock- e Cocaina-indotta Reinstatement

Soggetti

I soggetti erano 25 maschi ratti Long-Evans (Charles River, Quebec) di peso 350-425 g all’inizio dell’esperimento. Gli animali sono stati mantenuti come descritto nell’Esperimento 1.

Chirurgia

Gli animali sono stati preparati per la chirurgia come descritto nell’Esperimento 1. Un catetere intravenoso (Dow Corning) è stato impiantato nella vena giugulare destra. Una lunghezza di 3 cm di tubo di plastica è stato inserito nella vena (diametro interno 0,30 mm, diametro esterno 0,64 mm) ed è stato collegato con tubi termoretraibili a una lunghezza di 9 cm di tubo di plastica (diametro interno 0,51 mm, diametro esterno 0,94 mm) che è stato passato sottocutaneo alla parte superiore del cranio. Il catetere è stato fissato alla vena con suture di seta ed è uscito in un connettore (una cannula modificata 22 gauge; Plastics One, Roanoke, VA) che è stato montato al cranio con viti da gioielliere e cemento dentale; un tappo di plastica è stato posto sopra l’apertura della cannula. Agli animali sono state concesse 1-2 settimane per riprendersi dalla chirurgia.

Apparato

Le camere di autosomministrazione utilizzate negli esperimenti erano dotate di una leva retrattile (Med Associates, St Albans, VT) e una leva “fittizia” non retrattile. Entrambe le leve erano situate a 9 cm dal pavimento. Una pompa di infusione (Razel Scientific Instruments, Stamford, CT) è stata attivata dalle risposte sulla leva retrattile, o “attiva”. Le risposte sulla leva fittizia sono state registrate ma non hanno portato all’attivazione della pompa. Soluzione di droga è stato consegnato in un 10-s periodo in un volume di 65 μl. Per tutto il periodo di infusione, una luce bianca di stimolo appena sopra la leva attiva è stato illuminato e ulteriori risposte durante questo tempo sono stati registrati, ma non ha portato alla riattivazione della pompa. Ogni camera di autosomministrazione è stata attrezzata per fornire corrente costante, intermittente, ineluttabile, footshock elettrico attraverso uno scrambler al pavimento della griglia (Grason-Stadler Generator #E1064GS o Med Associates). Il footshock è stato somministrato per 15 minuti secondo un programma di tempo variabile ad un intervallo medio di 40 secondi (range 10-70 secondi). Ogni shock (0,6 mA) aveva una durata di 0,5 secondi. Questa intensità di footshock è stato trovato utilizzando il nostro apparato per essere il minimo richiesto per indurre la reintegrazione affidabile.

Farmaci

Cocaina HCl è stato ottenuto da BDH Chemicals (Toronto, Canada) ed è stato sciolto in soluzione fisiologica. Clonidina HCl è stato acquistato da Sigma (St Louis, MO) ed è stato sciolto in soluzione fisiologica e iniettato i.p. (0, 20, e 40 μg/kg).

Procedura

Fase 1: Formazione. I ratti sono stati addestrati ad auto-somministrare cocaina HCl (0.5 mg/kg/infusione, i.v.) su un programma a rapporto fisso-1 di rinforzo durante una sessione quotidiana di autosomministrazione di 3 ore. Ogni giorno, metà degli animali sono stati portati nelle camere operanti per la loro sessione di autosomministrazione al mattino, circa tre ore dopo lo spegnimento delle luci, e metà degli animali sono stati portati nelle camere nel pomeriggio, circa sette ore dopo lo spegnimento delle luci. Il gruppo di animali assegnati alle sessioni del mattino e del pomeriggio si alternava ogni giorno in modo che alla fine dell’addestramento tutti gli animali avessero ricevuto un numero uguale di sessioni di autosomministrazione in entrambi gli orari. Era importante che tutti gli animali avessero un’esperienza simile nell’autosomministrazione all’inizio e alla fine della giornata, poiché durante la Fase 2 tutti gli animali ricevevano sessioni di estinzione al mattino seguite da una sessione di test che in genere avveniva nel pomeriggio. All’inizio di ogni sessione, una luce rossa della casa è stata illuminata per 10 secondi prima dell’introduzione della leva retrattile nella gabbia. La luce appena sopra la leva attiva era accesa per i 30 secondi iniziali dopo la presentazione della leva. La luce della casa è rimasta accesa per tutta la sessione. Come indicato in precedenza, le risposte sulla leva attiva ha comportato l’attivazione della pompa di infusione e l’illuminazione della luce sopra la leva per i 10 secondi di erogazione del farmaco. Ulteriori pressioni della leva durante il periodo di somministrazione del farmaco sono state registrate ma non hanno portato alla riattivazione della pompa. Le condizioni di addestramento sono rimaste in vigore per 10-12 giorni. Alla fine della formazione, gli animali sono stati lasciati indisturbati nella stanza della colonia per 7-13 giorni. Successivamente, l’estinzione e il test hanno avuto luogo. In questo esperimento e nell’Esperimento 3B, gruppi di animali sono stati assegnati a diverse dosi dei farmaci di prova. Tutti gli animali di ogni gruppo sono stati poi sottoposti a tre condizioni di test: salina, cocaina e footshock.

Fase 2: estinzione e test. Durante l’estinzione e i test, che si sono verificati per quattro giorni consecutivi, gli animali sono stati alloggiati 24 ore al giorno nelle camere di autosomministrazione. Cibo e acqua erano liberamente disponibili per gli animali, tranne durante l’estinzione quotidiana e le sessioni di test. Gli animali sono stati portati nelle camere la sera precedente il primo giorno di estinzione e di test. Poiché due gruppi separati di ratti sono stati eseguiti ogni giorno durante la fase di addestramento, un gruppo di animali è stato testato nei primi quattro giorni della fase 2 e l’altro gruppo di animali è stato testato nei quattro giorni successivi. Durante l’estinzione e il test, tutte le condizioni che erano presenti durante l’addestramento sono state mantenute tranne che la pressione della leva non ha provocato infusioni di cocaina.

In questo e in tutti i successivi esperimenti di reintegrazione, agli animali sono state date diverse sessioni quotidiane di estinzione di 1 ora separate da periodi intermedie in cui la leva è stata ritirata. Il giorno 1, agli animali sono state date quattro sessioni di estinzione; nei giorni 2-4, gli animali sono stati dati da due a tre sessioni di estinzione, sufficiente a stabilire un livello di base di risposta di 15 o meno risposte in un’ora, seguita da una sessione di test 180 min. La durata dei periodi intermedi è stata mantenuta costante per ogni esperimento e corrispondeva al ritardo necessario per l’assorbimento della droga tra le iniezioni di pretrattamento e l’inizio del test. Nel presente esperimento, la durata dei periodi intermedi era 40 min.

Al test, gruppi separati di animali sono stati pretrattati con 0, 20, o 40 μg/kg, i.p., clonidina prima di ciascuna delle tre prove di reintegrazione (salina, cocaina, e footshock), dato in giorni consecutivi e in un ordine controbilanciato. La clonidina è stata iniettata 40 minuti prima dell’inserimento della leva. Per i test di adescamento con soluzione salina e cocaina, agli animali è stata somministrata una iniezione non contingente, i.p., di soluzione salina o cocaina (20 mg/kg) 5 minuti prima dell’inserimento della leva. Per i test di footshock, gli animali sono stati esposti al 15-min breve stress intermittente footshock immediatamente prima dell’inserimento della leva. Le sessioni di test avevano una durata di 3 ore. La dose di cocaina e i parametri di footshock sono stati scelti sulla base di precedenti lavori di questo laboratorio (Erb et al. 1996; Erb et al. 1998; Shaham et al. 1998). Le dosi di clonidina sono state scelte sulla base di esperimenti di reintegrazione che abbiamo condotto con ratti addestrati all’eroina (Shaham et al. 2000).

Sperimentazione 3A: Effetti della lofexidina su alti tassi di risposta per il saccarosio

Perché il profilo farmacologico della lofexidina non è stato ben caratterizzato come quello della clonidina, è stato condotto un esperimento per stabilire se, e a quali dosi, la lofexidina induce deficit di prestazioni. Le dosi nelle prove di reintegrazione sono state scelte sulla base dei risultati ottenuti in questo esperimento.

Soggetti

I soggetti erano 8 ratti maschi Long-Evans (Charles River, Quebec) di peso 400-550 g all’inizio dell’esperimento. I ratti sono stati precedentemente utilizzati in un esperimento volto a studiare la reintegrazione indotta da footshock della ricerca del saccarosio (Buczek et al. 1999). Gli animali sono stati mantenuti in condizioni simili a quelle descritte nell’esperimento 1.

Apparato

Ogni camera di autosomministrazione era dotata di due leve fisse, simmetricamente centrate su un pannello laterale, 5 cm sopra il pavimento. Le risposte su una leva, la leva “attiva”, attivava una pompa (Razel Sci. Stamford, CT). Le risposte sull’altra leva, la leva “fittizia”, sono state registrate ma senza conseguenze. L’attivazione della pompa si è tradotta in una consegna di 20 secondi di 0,18 ml di soluzione di saccarosio in un ricettacolo di gocce liquide situato tra le due leve. Durante tutto il periodo di erogazione del saccarosio, una luce bianca di stimolo appena sopra la leva attiva è stata illuminata e ulteriori risposte durante questo periodo sono state registrate, ma non hanno portato alla riattivazione della pompa.

Farmaci

Lofexidine HCl è stato generosamente fornito da Keith Davies, Britannia Pharmaceuticals Ltd., UK. Il farmaco è stato sciolto in soluzione fisiologica e iniettato i.p. (0, 80, 120, 160 o 200 μg/kg).

Procedura

Gli animali che avevano precedentemente imparato ad auto-amministrare il saccarosio in uno studio diverso (Buczek et al. 1999) sono stati successivamente dati cinque sessioni in cinque giorni consecutivi in cui hanno auto-amministrato una soluzione di saccarosio al 30% su un programma FR-1. Nelle successive sessioni giornaliere, gli animali sono stati iniettati con veicolo (0 μg/kg) o lofexidine (80, 120, 160 o 200 μg/kg, i.p.) 60 minuti prima dell’inizio della sessione di autosomministrazione. Tutti gli animali hanno ricevuto tutte le dosi di lofexidina in un ordine controbilanciato; la dose più alta di lofexidina è stata testata due volte. Ogni sessione in cui gli animali sono stati trattati con lofexidina è stata seguita da una sessione di pretrattamento salina per ridurre al minimo la possibilità di effetti di carry-over del farmaco.

Sperimento 3B: Effetti della lofexidina sulla reintegrazione indotta da footshock e cocaina

Soggetti

I soggetti erano 49 ratti maschi Long-Evans (34 di Charles River, Quebec; 15 di Harlan Sprague Dawley, USA) del peso di 350-400 g all’inizio dell’esperimento. Gli animali sono stati mantenuti come descritto nell’Esperimento 1. Non ci sono state differenze evidenti nella risposta tra gli animali dai due fornitori in qualsiasi fase dell’esperimento.

Procedura

Fase 1: Addestramento. Gli animali sono stati addestrati ad autosomministrare la cocaina nelle condizioni descritte nell’Esperimento 2.

Fase 2: Estinzione e test. In questo esperimento i periodi di intervallo, come descritto sopra, avevano una durata di 60 minuti. Al test, gruppi separati di animali sono stati pretrattati con 0, 50, 100, 150, o 200 μg/kg, i.p., lofexidine prima di ciascuna delle tre prove di reintegrazione (salina, cocaina, e stress footshock), dato in giorni consecutivi e in un ordine controbilanciato (vedi Esperimento 2). La lofexidina è stata iniettata 60 minuti prima dell’inserimento della leva. Le sessioni di test avevano una durata di 3 ore. Le dosi di lofexidina sono state scelte sulla base dei risultati ottenuti nell’Esperimento 3A.

Sperimento 4: Effetti del Guanabenz sulla reintegrazione indotta da Footshock e Cocaina

Soggetti

I soggetti erano 18 ratti maschi Long-Evans (Charles River, Quebec) del peso di 350-400 g all’inizio dell’esperimento. Gli animali sono stati mantenuti come descritto nell’Esperimento 1.

Droga

Guanabenz è stato acquistato da Sigma (St Louis, MO) ed è stato sciolto in soluzione fisiologica e iniettato i.p. (0, e 640 μg/kg).

Procedura

Fase 1: Formazione. Gli animali sono stati addestrati ad autosomministrare la cocaina nelle condizioni descritte nell’Esperimento 2.

Fase 2: Estinzione e test. In questo esperimento i periodi di intervallo, come descritto sopra, avevano una durata di 60 minuti. Al test, gli animali sono stati pretrattati con 0 o 640 μg/kg guanabenz, i.p., prima di ciascuna delle due prove di reintegrazione (no footshock, footshock o salina, cocaina), dato in giorni consecutivi (vedi Esperimento 2). Guanabenz è stato iniettato 60 min prima dell’inserimento della leva. Le sessioni di test avevano una durata di 3 ore. La dose di guanabenz è stata scelta sulla base della sua sostituibilità con 40 μg/kg di clonidina in una procedura di discriminazione farmacologica (Bennett e Lal 1982).

Analisi statistiche

I dati di microdialisi sono stati analizzati utilizzando un fattore misto ANOVA per la concentrazione di NE extracellulare in 20 campioni di dialisato min; il fattore tra soggetti era la dose di clonidina (0, 20, 40 μg/kg), lofexidine (0, 75, o 150 μg/kg), o guanabenz (0 o 640 μg/kg) e la misura ripetuta era il tempo. Le interazioni significative tra tempo e dose sono state sottoposte ad ANOVA a una via per il fattore della dose in punti temporali specifici. Quando appropriato, test post hoc (LSD di Fisher, p < .05) sono stati condotti per confrontare il veicolo (0 μg/kg) alle condizioni di droga.

Le due misure dipendenti nei test per il reintegro erano il numero di risposte sulla leva attiva (infusioni + risposte time out) e il numero di risposte sulla leva inattiva in tre ore. Tutti i dati comportamentali sono presentati come mezzi ± SEM. A causa della notevole variabilità nel numero di risposte effettuate nei diversi test di reintegrazione, le statistiche non parametriche per i campioni correlati (Friedman e Wilcoxon) e non correlati (Kruskal-Wallis e Mann-Whiney) sono state utilizzate dove appropriato.

Per lo studio sul saccarosio (Esperimento 3A) le misure dipendenti erano il numero di risposte sulle leve attive (risposte rinforzate + timeout) e inattive e il numero di rinforzi ottenuti. Le ANOVA a misure ripetute sono state condotte con la dose come fattore interno al soggetto. Quando appropriato, test post hoc (LSD di Fisher, p < .05) sono stati condotti per confrontare il veicolo (0 μg/kg) alle condizioni di droga.