Il complesso adattatore AP-3 media lo smistamento dei trasportatori di aminoacidi di base del lievito e dei mammiferi della famiglia PQ-loop-di lieviti e mammiferi della famiglia PQ-loop- trasportatori di aminoacidi alla membrana vacuolare/lisosomiale

La proteina Ypq1 può raggiungere la membrana vacuolare attraverso il percorso ALP o endosomiale

Avendo recentemente riportato che una proteina di fusione Ypq1-GFP localizza alla membrana vacuolare6, abbiamo cercato di determinare attraverso quale via di traffico Ypq1 raggiunge questo compartimento. Le proteine di membrana vacuolare possono raggiungere il vacuolo attraverso due diverse vie: la via ALP (fosfatasi alcalina) e la via CPY (carbossipeptidasi Y), quest’ultima comporta il passaggio delle proteine attraverso gli endosomi (Fig. 2A). Per verificare se Ypq1 segue la via CPY, abbiamo esaminato la sua distribuzione intracellulare in un mutante pep12Δ privo di un t-SNARE coinvolto nella fusione delle vescicole con l’endosoma tardivo13. In questo mutante, Ypq1-GFP è stato trovato esclusivamente nella membrana vacuolare (Fig. 2B). In un mutante vps27Δ privo di un componente del complesso endosomiale ESCRT-0, le proteine di membrana che trafficano attraverso gli endosomi sono tipicamente impilate in compartimenti di classe E chiaramente visibili che corrispondono a endosomi anormalmente allargati, ma la proteina Ypq1-GFP era destinata normalmente alla membrana vacuolare in questo mutante (dati non mostrati). Questi risultati mostrano che Ypq1 non richiede una via CPY funzionale per raggiungere il vacuolo. Abbiamo poi testato se Ypq1 raggiunge la membrana vacuolare attraverso la via ALP. E’ ben documentato che questa via richiede il complesso adattatore AP-3, che si presume agisca nel Golgi trans per smistare le proteine di carico in vescicole che successivamente si fondono con gli endosomi. Questo complesso è un eterotetramero costituito da due grandi subunità (β3a e δ), una subunità media (μ3a) e una piccola subunità (σ3) e l’assenza di una di queste subunità risulta in un complesso AP-3 carente 14. Abbiamo quindi isolato due ceppi AP-3-deficienti, apm3Δ (privo di subunità μ3a) e apl5Δ (privo di subunità δ). In questi mutanti, Ypq1-GFP è stato trovato alla membrana vacuolare così come in piccole strutture punteggiate prontamente etichettati con FM4-64 e non osservato in cellule wild-type (Fig. 2B). Nelle cellule mutanti amp3Δ e apl5Δ che esprimono anche un funzionale Sec7-mCherry per etichettare il Golgi, un’alta percentuale di queste strutture punteggiate erano decorate con Sec7-mCherry (Fig. 2C) (per una quantificazione dei modelli di sublocalizzazione, vedi Fig. S1 supplementare online). Questi risultati indicano che quando il percorso ALP è carente, Ypq1 tende ad accumularsi nel Golgi mentre una frazione significativa della proteina raggiunge la membrana vacuolare attraverso un altro percorso. Per verificare se quest’ultima sia la via CPY, abbiamo determinato la posizione di Ypq1-GFP nei doppi mutanti apm3Δ pep12Δ e apl5Δ pep12Δ (Fig. 2B). È interessante notare che la consegna di Ypq1-GFP al vacuolo è stata in gran parte compromessa in questi ceppi e la proteina è stata trovata per lo più dispersa nel citosol così come in strutture punteggiate etichettate con Sec7-mCherry (Fig. 2B,C) (per una quantificazione dei modelli di sublocalizzazione, vedi Fig. S1 supplementare online). Il vacuolo in questi doppi mutanti potrebbe essere normalmente etichettato con FM4-64. Questi risultati mostrano che Ypq1 può essere smistato alla membrana vacuolare attraverso entrambe le vie ALP e CPY. Nelle cellule wild-type, essa utilizza principalmente la via ALP, ma quando questa via è carente, la proteina risiede più a lungo nel Golgi ma può ancora raggiungere efficientemente la membrana vacuolare attraverso la via CPY. Quando entrambe le vie ALP e CPY sono carenti, una piccola frazione di Ypq1-GFP è rilevabile sulla membrana vacuolare, suggerendo che la proteina può utilizzare ancora un altro percorso, ma uno che è molto meno efficiente nel puntare correttamente Ypq1 al vacuolo.

Un motivo acido di dileucina promuove lo smistamento di Ypq1 verso il percorso ALP

Lo smistamentoAP-3-dipendente delle proteine transmembrana è spesso mediato da segnali basati sulla tirosina (YXXØ) o sulla dileucina (XXXL) (dove Ø è un residuo idrofobico voluminoso e X qualsiasi aminoacido)15. Ypq1 contiene una sequenza EQQPLL nel suo secondo grande loop rivolto verso il citosol. La dileucina di questo motivo è preceduta da una prolina, una caratteristica osservata in diversi carichi che utilizzano la via ALP16. Un mutante di sostituzione dileucina-dialanina di Ypq1 (Ypq1LL>AA) è stato trovato per essere mirato alla membrana vacuolare, ma anche per decorare strutture punteggiate (Fig. 3A). Questo fenotipo assomiglia a quello osservato per Ypq1 wild-type in cellule AP-3-deficienti, suggerendo così che Ypq1LL>AA raggiunge il vacuolo attraverso la via alternativa CPY. A sostegno di questo punto di vista, Ypq1LL>AA prodotto in un mutante pep12Δ non è riuscito ad essere indirizzato al vacuolo ed è stato missortato in strutture puntuali citosoliche come osservato per Ypq1 nei mutanti apm3Δ pep12Δ e apl5Δ pep12Δ (Fig. 3A). Questi risultati mostrano che il motivo acido della dileucina di Ypq1 è richiesto per il suo ordinamento AP-3-dipendente al vacuolo, ma non per la sua consegna Pep12-dipendente al vacuolo. Queste conclusioni sono coerenti con i risultati di un recente studio pubblicato da S. Emr e collaboratori durante la preparazione di questo manoscritto17. Abbiamo poi indagato in modo più dettagliato come la variante Ypq1LL>AA si dirige verso il vacuolo. Abbiamo dapprima ipotizzato la possibilità che questa proteina mutante, a causa del suo mancato utilizzo della via ALP, potesse essere prima missortata alla membrana plasmatica prima di subire una rapida endocitosi e la successiva consegna Pep12-dipendente alla membrana vacuolare. Questo modello non è stato supportato dalle nostre osservazioni: Ypq1LL>AA non si è accumulato sulla superficie cellulare in un mutante end3Δ difettoso nell’endocitosi, il che indica che raggiunge il vacuolo attraverso la via CPY (Fig. 3B). Abbiamo quindi ipotizzato che la consegna di Ypq1LL>AA al vacuolo potrebbe coinvolgere il suo smistamento dal Golgi agli endosomi grazie ad adattatori alternativi come il complesso AP-1 o le proteine monomeriche GGA. Abbiamo espresso la proteina mutante Ypq1LL>AA in cellule gga1Δ gga2Δ, prive degli adattatori ridondanti Gga1 e Gga2 e in cellule amp1Δ, amp2Δ e apl4Δ, prive di subunità del complesso AP-1. In ognuno di questi mutanti, la proteina ha raggiunto il vacuolo (Fig. 3B). Queste osservazioni suggeriscono che questi adattatori agiscono in modo ridondante per promuovere lo smistamento di Ypq1LL>AA nel vacuolo attraverso la via CPY o che altri adattatori sono coinvolti.

Ypq2 e Ypq3 anche il traffico al vacuolo attraverso la via ALP, ma subiscono destini diversi quando la via ALP non è funzionale

Le proteine Ypq2 e Ypq3, molto simile in sequenza a Ypq1, anche localizzare alla membrana vacuolare6 ed entrambi contengono anche una dileucina acido nel secondo ciclo citosolico. I risultati della Fig. 4A mostrano che Ypq2 viaggia normalmente verso il vacuolo in un mutante pep12Δ. Questo si è dimostrato vero anche nei mutanti apm3Δ e apl5Δ difettosi nel percorso ALP, dove è stato trovato anche a decorare strutture punteggiate, un fenotipo non osservato nelle cellule wild-type. Un’alta percentuale di queste strutture punteggiate erano anche marcate con Sec7-mCherry (Fig. 4B), indicando che Ypq2, in modo simile a Ypq1, tende ad accumularsi nel Golgi quando la via ALP è carente. In entrambi i mutanti apm3Δ pep12Δ e apl5Δ pep12Δ doppio, Ypq2 in gran parte mal localizzato a piccole strutture citosoliche punteggiate, molte delle quali sono state decorate con Sec7-mCherry, anche se una frazione della proteina sembrava correttamente consegnato al vacuolo (Fig. 4A, B) (per una quantificazione dei modelli di sublocalizzazione, vedi Fig. Supplementare S2 online). Questi risultati indicano che Ypq2 si comporta come Ypq1 in quanto utilizza principalmente la via ALP per raggiungere il vacuolo. Essi mostrano anche che quando questa via è difettosa, Ypq2 risiede più a lungo nel Golgi, ma può ancora essere consegnato alla membrana vacuolare, principalmente attraverso la via CPY.

Poiché l’espressione di un gene YPQ3-GFP sotto il controllo del promotore naturale di YPQ3 ha prodotto un livello appena rilevabile di Ypq3-GFP, abbiamo espresso il gene di fusione sotto il controllo di un promotore galattosio-inducibile. Per ridurre il rischio di una cattiva localizzazione dovuta alla sovrapproduzione di Ypq3-GFP, le cellule sono state prima coltivate su raffinosio, poi è stato aggiunto galattosio per 3 ore, e infine è stato fornito glucosio per due ore per reprimere la trascrizione del gene YPQ3-GFP. Questo Ypq3-GFP transitoriamente indotto, che si è accumulato nella cellula ad un livello vicino al livello endogeno di Ypq1-GFP (vedi Fig. Supplementare S3, online), è stato trovato per localizzare alla membrana vacuolare (Fig. 5A), in linea con i nostri precedenti risultati6. Questa localizzazione vacuolare è stata osservata anche nel mutante pep12Δ. Nei mutanti apm3Δ e apl5Δ, tuttavia, Ypq3 era principalmente missortato nel lume del vacuolo. Questo missorting dipendeva da Pep12, dal momento che Ypq3 non è riuscito ad essere mirato al vacuolo in apm3Δ pep12Δ e apl5Δ pep12Δ doppio mutanti (Fig. 5A) (per una quantificazione dei modelli di sublocalizzazione, vedi Fig. supplementare S4 online). Questi risultati suggeriscono che, come Ypq1 e Ypq2, Ypq3 utilizza principalmente la via ALP per raggiungere la membrana vacuolare. Quando i componenti del complesso AP-3 sono carenti, Ypq3 viene reindirizzato in modo Pep12-dipendente agli endosomi, dove viene smistato nel percorso del corpo multivascolare (MVB), con conseguente consegna al lume vacuolare. Questa interpretazione è stata ulteriormente valutata isolando un mutante Ypq3LL>AA che non dovrebbe essere riconosciuto dal complesso adattatore AP-3. Nelle cellule wild-type la variante Ypq3LL>AA era chiaramente missortata nel lume vacuolare, ma in un mutante pep12Δ è stata reindirizzata a piccole strutture punteggiate citosoliche (Fig. 5B).

Abbiamo considerato che il diverso comportamento di Ypq3 rispetto a Ypq1 e Ypq2 in AP-3 ceppi carenti potrebbe essere dovuto al fatto che Ypq3-GFP è stato sintetizzato in cellule che crescono in presenza di galattosio, o perché la trascrizione del gene YPQ3-GFP è stato indotto utilizzando il promotore forte GAL. Questo, tuttavia, sembra improbabile perché le proteine Ypq1-GFP e Ypq2-GFP indotte transitoriamente nei ceppi wild-type e mutanti utilizzando lo stesso promotore GAL si sono localizzate nelle cellule come quando sono state espresse sotto i loro propri promotori genici (vedi Fig. supplementare S5 online). Inoltre, anche se il segnale fluorescente era appena rilevabile, abbiamo ottenuto la prova che Ypq3-GFP espresso utilizzando il promotore naturale del gene YPQ3 etichettava la membrana dei vacuoli nel ceppo wild-type, ma non nel mutante apl5Δ, un fenotipo chiaramente diverso da quelli ottenuti con Ypq1-GFP e Ypq2-GFP. In questo mutante, Ypq3-GFP era presente in strutture punteggiate che probabilmente corrispondevano al Golgi, e il suo spostamento verso il lume vacuolare non era chiaramente visibile, probabilmente perché la fluorescenza era troppo debole (vedi Fig. S6 supplementare online).

In conclusione, come mostrato sopra per Ypq1, le proteine Ypq2 e Ypq3 usano principalmente la via ALP per raggiungere la membrana vacuolare e sono deviate verso gli endosomi quando questa via è difettosa. Tuttavia, mentre Ypq1 e Ypq2 che transitano attraverso gli endosomi raggiungono la membrana vacuolare in modo efficiente, Ypq3 è più incline ad essere smistato nel percorso MVB, portando così al suo targeting nel lume vacuolare.

PQLC2 prodotto in lievito utilizza il percorso ALP e il suo motivo dileucina per raggiungere la membrana vacuolare

In uno studio precedente, PQLC2 ratto è stato trovato per localizzare ai lisosomi in cellule HeLa, ma il suo mutante PQLC2LL>AA, in cui la dileucina C-terminale è sostituito con una dialanina, visualizzato una distribuzione più diffusa attraverso la cella ed è stato parzialmente missortato alla membrana plasmatica6. Inoltre, PQLC2 prodotto in lievito è stato trovato per localizzare alla membrana vacuolare, dove è funzionale, dal momento che è stato trovato per integrare il fenotipo di crescita di un mutante ypq2Δ6. I risultati in Fig. 6A mostrano che PQLC2 è stato correttamente indirizzato al vacuolo del lievito in un mutante pep12Δ, ma deviato al lume vacuolare in apm3Δ e apl5Δ mutanti. Questo targeting al lume vacuolare è stato compromesso in apm3Δ pep12Δ e apl5Δ pep12Δ mutanti doppi, dove PQLC2 è stato trovato per essere diffusamente distribuito attraverso il citosol (per una quantificazione dei modelli di sublocalizzazione, vedi Fig. supplementare S7 online). Abbiamo anche espresso in ceppi di lievito wild-type e mutante il mutante PQLC2LL>AA. Nel lievito wild-type, PQLC2LL>AA è stato trovato per localizzare al lume vacuolare, ma è stato trovato distribuito in tutto il citosol nel mutante pep12Δ (Fig. 6B). Ordinamento dei carichi al percorso corpo multivascolare è tipicamente compromessa in un mutante vps27Δ privo di un componente chiave della ESCRT-0 complesso 18. Nel mutante vps27Δ, PQLC2LL>AA era impilato in un grande compartimento perivacuolare: il compartimento di classe E tipicamente osservato in questa categoria di mutante (Fig. 6B). Questi risultati dimostrano che PQLC2 prodotto in lievito si comporta come l’Ypq3 endogeno: viene smistato nel vacuolo attraverso la via ALP in un modo dipendente dal corretto riconoscimento del suo motivo di dileucina da parte del complesso adattatore AP-3. Quando questo riconoscimento è compromesso perché il motivo della dileucina è mutato o perché manca un componente del complesso AP-3, PQLC2 viene deviato verso gli endosomi, dove viene efficientemente smistato nel percorso MVB, raggiungendo infine il lume vacuolare.

Depletion di un AP-3 subunità compromette la consegna di PQLC2 ai lisosomi

PQLC2-GFP prodotto in cellule HeLa in gran parte colocalizza con il marcatore lisosomiale LAMP1. Localizzazione di PQLC2 alla membrana lisosomiale è stato ulteriormente supportato da analisi semiquantitativa spettrometria di massa delle proteine in preparazioni altamente arricchito in membrane lisosomiali da cellule di fegato di ratto 6. Per determinare se l’adattatore AP-3 contribuisce alla selezione di PQLC2 ai lisosomi, abbiamo usato piccolo RNA interferente (siRNA) per inibire la sintesi della subunità μ3A di AP-3 in cellule HeLa. L’analisi dell’immunoblot ha confermato che le due bande tipiche corrispondenti alle subunità μ3A19 erano appena rilevabili nelle cellule trattate con μ3A-siRNA, in contrasto con le cellule di controllo (Fig. 7A). Questa deplezione di μ3A fortemente perturbato la localizzazione di PQLC2-GFP (Fig. 7B): la proteina localizzata in gran parte a numerose strutture intracellulari punteggiati non etichettati dal colorante Lyso Tracker accumulando nei lisosomi ed è stato trovato anche alla superficie cellulare, tra cui i microvilli, indicando che una parte della proteina è stato anche indirizzato male alla membrana plasmatica. Questo contrasta con la localizzazione di PQLC2 nelle cellule trattate con mock, dove la proteina era presente in strutture punteggiate anche fortemente etichettate dal colorante Lyso Tracker, come previsto. Questi risultati suggeriscono che il complesso AP-3 contribuisce alla corretta localizzazione di PQLC2 ai lisosomi. Abbiamo anche studiato la localizzazione del mutante PQLC2LL>AA (Fig. 7C). Nelle cellule HeLa di controllo, PQLC2LL>AA è stato trovato distribuito in strutture intracellulari punteggiate non o molto poco etichettate dal colorante Lyso Tracker ed era anche chiaramente presente sulla superficie cellulare, in linea con le osservazioni precedenti6. Questa localizzazione non era significativamente perturbato in μ3A-siRNA-trattati cellule, sostenendo l’opinione che il ruolo del motivo dileucina di PQLC2 è quello di mediare il traffico intracellulare attraverso il complesso AP-3. Abbiamo poi esaminato se PQLC2LL>AA viene dirottato verso il lume dei compartimenti endosomiali/lisosomiali, come quando è prodotto nel lievito. Le cellule HeLa che esprimono PQLC2-GFP sono state trattate per due ore con vacuolina-1, un composto che induce la fusione omotypic dei compartimenti del sistema endosomiale/lisosomiale, con conseguente formazione di grandi strutture gonfie (Fig. 8). PQLC2-EGFP è stato trovato per localizzarsi, come previsto, alla membrana limitante di questi compartimenti endosomiali/lisosomiali allargati. Lo stesso è stato vero nelle cellule che producono PQLC2LL>AA, suggerendo che la proteina mutante non è efficientemente smistata nel percorso MVB. In conclusione, il complesso adattatore AP-3 sembra svolgere un ruolo importante nel puntare PQLC2 al lisosoma, molto probabilmente attraverso il riconoscimento della sua dileucina C-terminale. Quando questo riconoscimento è compromesso, la proteina viene deviata verso la superficie cellulare e verso la membrana limitante dei compartimenti interni.