Inhibitor of Apoptosis Proteins: Translating Basic Knowledge into Clinical Practice

Classe 1 Inhibitor of Apoptosis Proteins.

Le IAP di classe 1 contengono domini BIR omologhi e un motivo RING finger. X-linked IAP ha tre domini BIR e un RING finger. È stata la prima IAP di questa classe ad essere identificata e rimane la meglio caratterizzata. Duckett et al. (24) hanno identificato XIAP nel 1996 in una ricerca di geni di mammiferi omologhi allo IAP del baculovirus. Si lega e inibisce le caspasi 3, 7 e 9 con affinità nanomolare, ma non si lega e non inibisce la caspasi 8 (25, 26). cIAP1 (noto anche come MIHB, hiap2 e BIRC2) e cIAP2 (noto anche come MIHC, hiap2 e BIRC3) sono strutturalmente correlati a XIAP con tre domini BIR e un RING finger. Queste IAP sono state identificate attraverso la purificazione biochimica di proteine associate al recettore di morte TNF-R2, ma il loro ruolo presso questo recettore rimane poco chiaro (27). cIAP1 e cIAP2 sono espressi nella maggior parte dei tessuti umani, ma l’espressione di cIAP1 è più alta nel timo, nei testicoli e nelle ovaie, e l’espressione di cIAP2 è più alta nella milza e nel timo (27). cIAP1 e cIAP2 si legano e inibiscono le caspasi 3 e 7, anche se meno fortemente della XIAP (25). Non inibiscono le caspasi 1, 6 e 8. ML-IAP (noto anche come livin, KIAP e BIRC7) e ILP-2 hanno un RING finger e solo un dominio BIR, ma il loro dominio BIR è più omologo al dominio BIR3 di XIAP, cIAP1 e cIAP2 (da qui la loro inclusione in questa classe). ML-IAP è espresso nel fegato fetale normale, nel rene, nel testicolo e nel timo degli adulti, così come nel melanoma e nelle linee cellulari di linfoma. ML-IAP inibisce le caspasi 3 e 9 con un’affinità simile a quella di cIAP1 ma non si lega né inibisce le caspasi 1, 2, 6 o 8 (28). L’espressione di ILP-2 è normalmente limitata al testicolo adulto, ma è stata documentata anche in una linea cellulare linfoblastoide. ILP-2 inibisce la caspasi 9, ma non le caspasi 3, 7 o 8 (29). Rimane da determinare se le variazioni di affinità per le caspasi tra le diverse IAP si riferiscono alle loro funzioni intracellulari endogene.

Le proteine inibitrici dell’apoptosi di classe 2.

Il NAIP, membro della famiglia IAP di classe 2, ha tre domini BIR ma nessun motivo RING finger. I suoi domini BIR sono più lontani dai domini BIR delle IAP di classe 1. NAIP è stato identificato nel 1995 da Roy et al. (30), mentre cercavano il gene su 5q13 responsabile delle atrofie muscolari spinali infantili. NAIP è espresso nel fegato adulto, nella placenta e nel sistema nervoso centrale. Inibisce le caspasi 3 e 7, ma non le caspasi 1, 4, 5 o 8 (31).

Class 3 Inhibitor of Apoptosis Proteins.

I membri IAP di classe 3, come survivin, contengono solo un singolo dominio BIR e nessun RING finger. Survivin è espressa nel fegato fetale, nei reni, nei polmoni e nel tratto gastrointestinale, ma non è espressa nella maggior parte dei tessuti adulti normali (32). L’espressione preferenziale di survivin nel tessuto fetale suggerisce che gioca un ruolo nello sviluppo. Survivin è frequentemente sovraespressa in una varietà di tumori maligni tra cui gli adenocarcinomi del polmone, del pancreas, del colon, del seno e della prostata (32, 33, 34, 35, 36).

L’espressione differenziale tra cellule normali e maligne può essere sfruttata per scopi terapeutici. Per esempio, il promotore di survivin potrebbe essere usato come un promotore tumore-specifico in cui un gene di interesse è acceso nelle cellule maligne, ma non nelle cellule normali. Questo targeting trascrizionale può essere utile nella terapia genica del cancro (37). In alternativa, l’espressione di survivin potrebbe essere usata come marker tumorale per l’identificazione precoce della malignità, come discusso in dettaglio più avanti.

Le proteine inibitrici dell’apoptosi inibiscono le caspasi attive

L’inibizione delle caspasi è il meccanismo meglio compreso attraverso il quale le IAP impediscono l’apoptosi. Nelle reazioni enzimatiche, lo XIAP ricombinante inibisce la caspasi 3, 7 e 9, ma non la caspasi 8. In vitro, la sovraespressione di XIAP in cellule 293T previene la scissione della procaspasi 3 e l’apoptosi indotta da BAX e FAS (38). L’effetto di XIAP sull’attivazione della caspasi è stato mappato sui suoi domini BIR, con il dominio BIR2 che inibisce le caspasi 3 e 7, e il dominio BIR3 RING che inibisce la caspasi 9.

Base strutturale dell’inibizione della caspasi da parte della X-Linked Inhibitor of Apoptosis Protein.

Dati i dati cellulari ed enzimatici che indicano che le IAPs inibiscono le caspasi, sono stati intrapresi sforzi per esplorare le interazioni fisiche tra le IAPs e le caspasi. La maggior parte degli studi si è concentrata su XIAP perché può essere prodotta in forma ricombinante e cristallizzata. XIAP inibisce le caspasi 3 e 7 e la caspasi 9 attraverso domini separati. Il suo dominio BIR2 (aminoacidi 163-240) con la sua estensione NH2-terminale (aminoacidi 124-162) inibisce le caspasi 3 e 7, mentre il suo dominio BIR3 (aminoacidi 241-356) inibisce la caspasi 9 (39). Questi studi hanno fornito la base per lo sviluppo di inibitori IAP che mirano alle tasche di legame alla caspasi della molecola.

Il dominio BIR2 inibisce la proteina X-Linked Inhibitor of Apoptosis.

Un modello “hook, line, and sinker” è stato proposto per spiegare come XIAP inibisce la caspasi 3 (Fig. 3)⇓. Il “gancio” (residui 138-146 del terminale NH2) inibisce la caspasi 3 trovandosi di fronte al sito attivo della caspasi, bloccando così la tasca di legame al substrato della caspasi 3 attiva. La “linea” rappresenta due legami peptidici su Val147 che collegano il gancio all’affondatore. Il “sinker” (residui 148-150) stabilizza l’interazione tra XIAP e caspasi 3 (40). In questo modello, XIAP inibisce la caspasi 3 attraverso un ostacolo sterico. Come tale, inibisce le caspasi 3 e 7 attraverso un meccanismo distinto dagli inibitori peptidilici della caspasi come il benzilossicarbonil-VAD-fluorometil chetone che competono con il substrato della caspasi per la tasca di legame.

Il dominio BIR3 inibisce la proteina X-Linked Inhibitor of Apoptosis.

Studi iniziali hanno determinato che il dominio BIR3 di XIAP potrebbe inibire la caspasi 9 (26, 41), ma solo recentemente è stato chiarito il meccanismo. Il dominio BIR3 di XIAP forma un eterodimero con la caspasi 9 monomerica, impedendo così la dimerizzazione e l’attivazione della caspasi 9. Oltre a intrappolare la caspasi 9 in una forma monomerica, mantiene anche il sito attivo della caspasi 9 in una conformazione inattiva (42). Quindi, è interessante notare che XIAP inibisce la caspasi 9 senza toccare fisicamente il sito attivo.

In un’estensione degli studi strutturali, sono stati esaminati gli effetti delle mutazioni nei domini BIR sugli effetti antiapoptotici di XIAP. Le mutazioni che interessano l’estensione NH2-terminale di BIR2 (per esempio, D148A) aboliscono il ruolo protettivo di XIAP nel prevenire il ligando Fas (uno stimolo della via estrinseca di attivazione della caspasi) o l’apoptosi indotta da Bax (uno stimolo della via intrinseca di attivazione della caspasi). Al contrario, le mutazioni che interessano il dominio BIR3 (per esempio, W310A) riducono l’inibizione mediata da XIAP dell’apoptosi indotta da BAX, ma non da CD95 (43). Quindi, queste mutazioni supportano gli studi strutturali che dimostrano che il dominio BIR2 è richiesto per l’inibizione della caspasi 3 e che il dominio BIR3 inibisce la caspasi 9.

Survivin.

Come XIAP inibisce le caspasi 3, 7 e 9 attraverso interazioni dirette, il meccanismo con cui survivin inibisce le caspasi è meno chiaro. Secondo alcuni studi (44, 45), survivin si lega e inibisce le caspasi attive 3 e 7, ma non la caspasi 8. Al contrario, altri (46) non rilevano un’interazione di survivin con la caspasi 3. Uno studio di Marusawa et al. (47) ha riportato che survivin non inibisce le caspasi ricombinanti 3, 7 o 9 in reazioni enzimatiche o in estratti citosolici precedentemente stimolati con citocromo c e dATP. Tuttavia, quando survivin viene aggiunta agli estratti citosolici prima dell’attivazione della caspasi 9 mediante aggiunta di citocromo c e dATP, impedisce l’attivazione della caspasi 3/7. Quindi, questi risultati suggeriscono che survivin inibisce la caspasi 9 attiva, ma non le caspasi 3 e 7 attive, e che l’inibizione della caspasi 9 richiede un cofattore. Per identificare tale cofattore, Marusawa et al. (47) hanno usato uno schermo a due ibridi per identificare le proteine che legano survivin e hanno identificato HBXIP. In reazioni enzimatiche, survivin e HBXIP in combinazione (ma nessuna proteina da sola) hanno inibito l’attività della caspasi 9. Saranno necessari ulteriori studi per risolvere queste discrepanze e decifrare il meccanismo con cui survivin inibisce le caspasi. Inoltre, per generalizzare l’importanza di HBXIP come cofattore necessario per survivin, dovrà essere valutato in altri sistemi cellulari. Tale lavoro sarà un passo importante verso lo sviluppo di inibitori chimici di survivin.

Oltre l’inibizione delle caspasi

La maggior parte dell’attenzione si è concentrata sulle IAP come inibitori delle caspasi, ma molteplici linee di evidenza indicano che le IAP possono inibire l’apoptosi attraverso effetti sulla progressione del ciclo cellulare, la divisione cellulare e la trasduzione del segnale.

Le proteine inibitrici dell’apoptosi regolano la divisione cellulare.

Le proteine IAP hanno probabilmente un ruolo nella divisione cellulare. Per esempio, il lievito manca di caspasi ma ha omologhi IAP che contengono un dominio BIR. La delezione della IAP del lievito porta a una formazione inefficiente delle spore, indicando che, almeno nel lievito, la IAP ha un ruolo nella meiosi (20, 21, 22). Nelle cellule di mammifero, survivin si colocalizza con l’apparato mitotico che include tubulina B, microtubuli, centrosomi e cinetocori (48, 49, 50). L’inibizione di survivin con l’anticorpo anti-survivin provoca un ritardo della metafase e produce cellule mitotiche con fusi mitotici più corti e meno densi (48, 50).

Le proteine inibitrici dell’apoptosi regolano la progressione del ciclo cellulare.

È stato dimostrato che gli IAP sono anche regolatori del ciclo cellulare. Per esempio, la sovraespressione di XIAP arresta le cellule nella fase G0-G1 del ciclo cellulare, e questo arresto della crescita è associato alla down-regolazione della ciclina A e D1 e all’induzione degli inibitori della chinasi ciclina-dipendente p21 e p27 (51). Inoltre, XIAP lega i regolatori del ciclo cellulare MAGE-D1 e NRAGE, ma il significato di questa interazione non è chiaro (52). Anche Survivin è stata implicata nella regolazione del ciclo cellulare. Nelle cellule HeLa, survivin è virtualmente non rilevabile nelle cellule G1 e aumenta ∼5- e 40 volte nelle cellule in fase S e G2-M, rispettivamente (50). I cambiamenti nei livelli di mRNA di survivin sono anche correlati agli aumenti della proteina survivin e dell’attività del promotore.

Le proteine inibitrici dell’apoptosi regolano la segnalazione cellulare.

La famiglia di proteine IAP svolge anche un ruolo nella segnalazione cellulare attivando il fattore nucleare (NF)-κB. XIAP e NAIP, per esempio, formano un complesso con la chinasi TAK1 e il suo cofattore, TAB1, che porta all’attivazione di c-Jun-NH2-terminal kinase 1 (53). La c-Jun-NH2-terminale chinasi 1 attivata attiva successivamente NF-κB attraverso la cascata di fosforilazione della proteina chinasi attivata da mitogeno (54). Inoltre, XIAP promuove la traslocazione della subunità p65 di NF-κB nel nucleo, che è un prerequisito per l’attività di NF-κB (55). Infine, XIAP promuove la degradazione dell’inibitore di NF-κB Iκβ (51).

Quando si chiarisce il ruolo degli IAP nella regolazione della divisione cellulare, del ciclo cellulare e della trasduzione del segnale, sarà importante identificare i domini IAP responsabili di queste attività. Se diventa possibile identificare domini separati delle proteine che inibiscono le caspasi, il ciclo cellulare e la trasduzione del segnale, allora si potrebbero realizzare IAP mutanti che dissociano queste funzioni. Questo lavoro potrebbe portare allo sviluppo di inibitori IAP che bloccano specificamente l’inibizione delle caspasi da parte delle IAP mentre le IAP mantengono il loro ruolo di regolatori del ciclo cellulare e della trasduzione del segnale.

Regolazione della funzione delle proteine inibitrici dell’apoptosi da parte delle proteine inibitrici endogene

I membri della famiglia IAP sono regolati a livello di gene, messaggio e proteina, ma i dettagli di questa regolazione vanno oltre lo scopo di questa rassegna. Piuttosto, questa rassegna si concentrerà sulla regolazione delle IAP da parte delle proteine inibitorie endogene perché servono come prototipi per gli inibitori chimici terapeutici delle IAP.

Le proteine leganti le IAP sono state identificate per la prima volta in Drosophila. Le proteine Reaper, Hid, Grim (56), e Sickle (57) hanno dimostrato di legare e inibire la IAP di Drosophila, DIAP1. Più tardi, versioni umane di Reaper (Rpr), Hid, Grim (Grm), e Sickle (Skl) sono state identificate e chiamate SMAC/DIABLO e HTRA2. Questi inibitori IAP condividono una sequenza omologa nel loro terminale NH2 che è responsabile del legame e dell’inibizione degli IAP (Fig. 4)⇓.