Isolamento, caratterizzazione e potenziale tossicologico di Alternaria-micotossine (TeA, AOH e AME) in diverse specie di Alternaria provenienti da varie regioni dell’India

Raccolta e isolamento di specie di Alternaria

Le parti infette come foglie, frutti e steli di piante malate provenienti da diverse regioni dell’India, sono state raccolte e portate in laboratorio. I campioni di foglie sono stati sterilizzati in superficie con una soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,5%, lavati accuratamente con acqua distillata sterile (SDW) per diverse volte e posti su un terreno di coltura di destrosio di patate (PDA) in piastre di Petri per 3-4 giorni. Le piastre PDA contenenti pezzi di foglie infette sono stati incubati a 28 ° C per 12 h luce / buio fotoperiodo per 6-10 giorni57. Per evitare la contaminazione batterica, la streptomicina è stata integrata nel mezzo. I conidi sono stati prodotti monosporzionati per ottenere colonie pure, che sono state poste su carta da filtro sterilizzata.

Test di patogenicità

Per determinare le formae speciali, l’analisi della virulenza degli isolati è stata effettuata su cultivar di pomodoro suscettibili all’Alternaria. Un totale di 60 isolati di Alternaria sono stati testati per la patogenicità. I semi di pomodoro sono stati scarificati in ipoclorito di sodio, sciacquati in acqua di rubinetto e poi asciugati all’aria. Le piante sono state coltivate separatamente in vasi. Le condizioni fisiologiche come la temperatura e l’umidità per la crescita delle piante sono state mantenute da 28 °C a 32 °C e dal 40 al 60% di umidità relativa, rispettivamente. La concentrazione ottimale degli inoculi è stata mantenuta (2 × 106 spore/ml) e spruzzata sulla zona delle foglie. Le piante sotto esperimento sono state mantenute in camere di rugiada per 8 ore a 25 °C. Queste piante sono state regolarmente monitorate per 2-3 giorni per la gravità dell’infezione e lo sviluppo della malattia rispetto alla foglia di controllo che non è stato inoculato. I sintomi hanno cominciato ad essere visibili 1 giorno dopo la spruzzatura delle spore inoculate. La gravità della malattia è stata valutata da 1 giorno di inoculazione fino a 6 giorni. I dati sono stati analizzati statisticamente utilizzando l’analisi della varianza (ANOVA) e il test di Duncan (P ≤ 0,05).

Estrazione del DNA e identificazione del patogeno

Il patogeno è stato inizialmente identificato sulla base delle caratteristiche morfologiche tra cui dimensione e forma, e la struttura dei conidi, e ulteriormente confermato dall’amplificazione ITS usando i primer universali ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) e ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATGC-3′) che amplificano le regioni ITS e 5.8S che codificano per le specie fungine. L’estrazione del DNA è stata effettuata secondo il metodo suggerito da Doyle e Doyle58. Mat micellare liofilizzato di 0,5 g è stato macinato in un mortaio e pestello con 10 ml di tampone di estrazione CTAB e poi incubato a 65 ° C in bagno d’acqua per 30 min. Il campione è stato poi mescolato con un volume uguale di cloroformio/alcool isoamilico raffreddato e mescolato delicatamente seguito da centrifugazione a 10.000 rpm per 10 min a 4 °C. Il surnatante così ottenuto è stato mescolato con un volume uguale di isopropanolo e lasciato per 2 ore a 4 °C. Il campione è stato nuovamente centrifugato a 10000 rpm per 10 min a 4 °C. Il pellet è stato poi sciacquato con etanolo al 70% e asciugato all’aria per 4 ore per rimuovere le tracce di alcol. Amplificazione ITS rDNA reazione sono stati eseguiti in 25 microlitri miscela di reazione contenente 2,5 microlitri 10X tampone di reazione, 5 microlitri di ogni trifosfato deossiribonucleotide (dNTP), e 1,0 microlitri ciascuno di ITS e 5,8 S regione universale primer forward (ITS1) e primer inverso (ITS4), 0,3 microlitri di Taq DNA-polimerasi, 10-100 ng DNA, e 2,5 microlitri MgCl2. Il profilo termico ottimizzato della PCR è stato la denaturazione iniziale a 95 °C per 3 minuti, la denaturazione a 95 °C per 30 secondi, l’annealing a 70 °C per 30 secondi e l’estensione finale a 72 °C per 1 minuto con ulteriori 40 cicli. L’amplificazione è stata confermata su gel di agarosio all’1% in tampone TBE 0.5X, eseguito in parallelo con un marcatore standard del peso molecolare del DNA e visualizzato sotto un transilluminatore UV.

Analisi della sequenza ITS

Le regioni ITS rDNA ottenute degli isolati selezionati sono state ulteriormente ridotte e purificate utilizzando il kit di purificazione QIAquick PCR (QIAGEN, Germania), secondo le istruzioni del produttore. I prodotti purificati sono stati infine inviati a SciGenome Cochin, Kerala, India per il sequenziamento. Le sequenze sono state confrontate con quelle in GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) usando NCBI BLAST. L’analisi BLAST è stata eseguita con le sequenze ITS a lunghezza intera come query per rivelare le relazioni con le sequenze pubblicate. L’omologia più alta e il punteggio totale sono stati annotati per ulteriori analisi. Le sequenze ottenute nel presente studio sono state presentate a GenBank. Le sequenze ITS di ceppi di Alternaria di altre formae speciali sono state scaricate dal database NCBI GenBank e sono state utilizzate nelle analisi filogenetiche come sequenze di riferimento. Tutte le sequenze di DNA sono state allineate con il programma Clustal W incluso in BioEdit sequence alignment editor59, 60. Il file di allineamento multiplo risultante è stato utilizzato per le analisi filogenetiche che sono state eseguite utilizzando MEGA 5.0 con il metodo Neighbor-Joining che consente 500 repliche bootstrap61.

Estrazione delle tossine dalle specie di Alternaria

Le estrazioni dei metaboliti tossici sono state effettuate secondo il metodo di Andersen et al.62 con alcune modifiche. Le estrazioni di queste fitotossine sono state effettuate su un terreno di Brodo di destrosio di patate (PDB) utilizzando colture di 20 giorni. Tre tappi di agar (3 mm) sono stati tagliati dal centro di ogni colonia di Alternaria e inoculati in 200 ml di terreno PDB. Le colonie del patogeno sono state tagliate con l’aiuto di una sonda di sughero (5 mm) e poi le colonie sono state inoculate nel mezzo PDB. Le colture di venti giorni sono state filtrate attraverso la carta da filtro con la macchina del filtro a vuoto. Aggiunto un volume uguale di metanolo nei filtrati di coltura, mescolato correttamente e tenuto a 4 ° C per 24 ore. Successivamente, il filtrato è stato precipitato ed è stato fatto evaporare il metanolo a secco in un concentratore rotativo sotto vuoto (IKA ® RV 10) a 43 ° C. Un volume uguale di acetato di etile è stato aggiunto al filtrato estratto, mescolato correttamente in un imbuto separatore. Si sono ottenute due fasi, una fase organica e un’altra fase acquosa. Lo strato acquoso è stato separato ed estratto con acetato di etile. L’estratto di acetato di etile è stato concentrato a 44 ° C in evaporatore sotto vuoto e sciolto in metanolo.

Purificazione e separazione di Alternaria fitotossina tramite cromatografia su colonna

Purificazione e separazione dei composti sono stati eseguiti utilizzando la metodologia di Devi et al.63 con leggere modifiche. Cromatografia su colonna (CC) è stato intrapreso in una colonna di vetro (700 mm × 30 mm) e gel di silice (100-120 mesh dimensione Merk) è stato scelto come fase stazionaria. La fase mobile consisteva di solvente puro o di solventi diversi a seconda delle condizioni richieste. La colonna è stata caricata con il complesso grezzo estratto da isolati di specie di Alternaria. Per la separazione di metaboliti tossici fase mobile consisteva di cloroformio: metanolo (80:20 e 95:05), benzene: acetone: acido acetico (60:35:05) rapporto è stato utilizzato per separare composto e gradiente di eluizione è stato seguito. Le diverse frazioni eluite da CC sono state separate mediante cromatografia su strato sottile (TLC) e confermate dall’analisi HPLC.

L’analisi della cromatografia su strato sottile (TLC) delle fitotossine

La cromatografia su strato sottile (TLC) è stata utilizzata per identificare le varie fitotossine prodotte da spore grandi e piccole delle specie di Alternaria identificate. La TLC è stata eseguita utilizzando il metodo di Andersen et al.64. In questo metodo, 4,5 g di gel di silice G254 (13% CaSO4 ½ H2O come legante) è stato aggiunto con 25 ml di acqua bidistillata e mescolato da bacchetta di vetro fino a quando si è formato slurry di gel di silice. Dopo di che lo slurry è stato applicato delicatamente sulla piastra di vetro e posto in un luogo sicuro per l’essiccazione all’aria. Per la separazione delle varie fitotossine sono state utilizzate diverse fasi mobili nel rapporto cloroformio: metanolo (80:20; v/v), benzene: acetone: acido acetico (60:35:5; v/v), cloroformio: metanolo (95:5; v/v), acetato di etile: benzene (95:5; v/v). Queste miscele di solventi sono state poi poste in essiccatori e sono state lasciate per 30 minuti per saturare l’ambiente al suo interno. Prima di eseguire la TLC, le piastre di vetro rivestite di gel di silice sono state caricate mettendole in forno a 60 °C per 10 minuti. Dopo la carica, 5 µl di campioni sono stati macchiati in diversi punti a 2 cm dalla base. Dopo aver macchiato i campioni, le piastre TLC sono state asciugate in un essiccatore per alcuni minuti. Le macchie risultanti sono state sviluppate esponendo le piastre TLC allo 0,2% di cloruro ferrico etanolico o visualizzate sotto la luce UV a 365 nm. Le piastre TLC sono state poi asciugate all’aria per una notte, dopo di che sono stati calcolati i valori Rf. Le macchie di diversi metaboliti i cui valori Rf sono stati trovati simili ai valori Rf degli standard sono stati grattati via, sciolti in metanolo di grado HPLC e utilizzati per l’analisi HPLC.

Analisi HPPLC-UV

Preparazione dello standard

TeA (cat No: T1952), AOH (cat No: A4675) e AME (cat No: A4678) sono stati acquistati da Biogenuix (LKT laboratories, Inc, New Delhi, India) e utilizzati in forma cristallizzata per preparare lo standard. La soluzione stock (1000 µg ml-1) e una soluzione di lavoro separata di (10 µg ml-1) delle tossine sono state preparate in metanolo di grado HPLC e conservate a -20 °C per ulteriori usi. Queste tossine sono state utilizzate come standard per la calibrazione HPLC e per altri esperimenti aggiuntivi diluendo le soluzioni di lavoro preparate.

Condizioni di analisi HPLC-UV

Per l’analisi HPLC i campioni sono stati separati cromatograficamente utilizzando una base disattivata (250 mm di lunghezza × 4. 6 mm, 5,0 µm).6 mm, dimensione delle particelle 5.0 µm) C18 Waters Spherisorb, colonna ODS2 (prodotto n.: PSS831915, USA) che è stata collegata alla colonna di guardia, sistema della serie Waters (Waters, Waters Corporation, Milford, USA) con rilevatore UV-VIS (2998 PDA) e controller del sistema Waters 600E. Il rivelatore 2998 PDA è stato impostato a 254 nm come lunghezza d’onda di integrazione. I campioni sono stati iniettati utilizzando un loop da 10 μl del campionatore automatico Waters 717plus (Waters Corporation, Milford, USA). La colonna e la colonna di guardia erano controllate termostaticamente a 28 °C. La portata era di 0,70 ml/min e la fase mobile consisteva nel 75% di metanolo di grado HPLC (solvente A), 25% di una soluzione acquosa (solvente B) di tampone fosfato 0,1 M aggiunto 900 ml DW per 1 litro e pH 5,8 mantenuto da acido fosforico. Lo strumento è stato eseguito in modalità lineare isocratica e la rilevazione è stata monitorata nell’intervallo di 200-400 nm. L’affidabilità del metodo HPLC per l’analisi di AME, TeA e AOH è stata convalidata attraverso il limite di rilevazione (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ).

AnalisiLC-MS/MS

Per un’ulteriore conferma delle tossine dell’Alternaria (AME, AOH e TeA), è stato eseguito un metodo cromatografico – spettrometrico di massa tandem (LC-MS/MS) con leggere modifiche di Tölgyesi et al.65. Il metodo prevede un’estrazione solido-liquido con metanolo e una successiva derivatizzazione per TeA, AOH e AME. Poi, i campioni sono stati purificati con estrazione in fase solida su cartucce a base polimerica e, infine, le tossine sono state separate tramite LC-MS/MS. Per l’analisi LC-MS/MS il campione è stato preparato in un processo a tappe.

Reagenti, solventi e preparazione dello standard

I calibratori analitici essiccati di AME, AOH e TeA sono stati acquistati da Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, India). Gli standard sono stati ricostituiti con 1,0 ml di metanolo per ottenere soluzioni stock da 0,1 mg ml-1 . Tutte le soluzioni stock sono state conservate a 4 °C. 2,4-dinitrofenilidrazina (DNPH) e undecanal sono stati acquistati da Sigma-Aldrich. Il reagente di derivatizzazione (0,58% DNPH in soluzione HCl) è stato preparato come descritto da Siegel et al.7. Il reagente di arresto era 5% (v / v) undecanal in metanolo. Le soluzioni standard derivate TeA, AOH e AME (1,91 μg/ml, 2,54 μg/ml, e 2,71 μg/ml metanolo, rispettivamente) sono stati preparati mescolando 1 ml di 10 μg/ml soluzioni metanoliche TeA, AOH e AME con 1 ml di soluzione DNPH. La miscela è stata lasciata tutta la notte e trattati come scritto nelle sezioni di estrazione del campione e SPE clean-up. Il volume finale è stato regolato a 10 ml con metanolo. Queste soluzioni sono state utilizzate per ottimizzare le condizioni LC-MS/MS per l’analisi. Un totale di 50 mM tampone formiato di ammonio è stato preparato in acqua e il suo pH regolato a 3,0 con acido formico. Metanolo e acetonitrile erano LC-MS grado ottenuto da Sigma-Aldrich. Acetato di etile, n-esano, diclorometano, acido formico e formiato di ammonio erano di grado HPLC e acquistato da Merck (Darmstadt, Germania). La colonna Kinetex C-18 UPLC LG 500 (3 × 100 mm, 2,6 μm), le cartucce Strata SPE (6 ml, 200 mg) e i filtri a siringa in cellulosa rigenerata (RC) (15 mm, 0,45 μm) sono stati ottenuti da Phenomenex (Utrecht, Olanda). Le colonne HPLC Supelco Ascentis Express C-18, ciano (ES-CN) e fenile-esile (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) sono state acquistate da Sigma- Aldrich. I campioni di tossine standard, utilizzati per lo sviluppo del metodo, sono stati acquistati da Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, India). I campioni sono stati conservati a -20 °C fino a quando sottoposti ad analisi.

Estrazione del campione

I campioni di estrazione dei metaboliti grezzi sono stati purificati con il metodo della cromatografia su colonna e la frazione sono stati eluiti e sciolti in metanolo. 50 ml di campione di ogni frazione sono stati mescolati in provette da centrifuga in polipropilene (PP) da 50 ml che sono state poi sigillate. I campioni sono stati mescolati al vortex per 5 secondi e agitati orizzontalmente su un agitatore CAT S50 a 600 min-1 per 45 minuti a temperatura ambiente. Poi, i tubi sono stati centrifugati a 5.000 rpm per 10 min a 20 °C e lo strato superiore è stato raccolto in un nuovo tubo da centrifuga PP da 50 ml. 100 μl di reagente di derivatizzazione (0,596% DNPH in 2 mol/lit HCl) è stato aggiunto al campione e mescolato al vortex per 5 secondi. Il campione è stato lasciato in derivatizzazione per 1 ora a temperatura ambiente. Successivamente, 500 μl di reagente di arresto 5% (v/v) undecanal in metanolo è stato aggiunto e vortex-mixed per 5 secondi. Il campione è stato lasciato riposare per 30 min e poi diluito nella provetta PP fino a 35 ml con 50 mM di tampone formiato di ammonio (pH 4, regolato con acido formico). Il campione è stato centrifugato a 5.000 rpm per 10 min a 20 °C e sottoposto alla pulizia con estrazione in fase solida.

Pulizia con estrazione in fase solida (SPE)

Le cartucce Strata-XL (200 mg, 6 ml, 100 μm) sono state condizionate con 6 ml di metanolo seguito da 6 ml di acqua e 6 ml di tampone formulato 50 mM. I serbatoi da 75 ml sono stati collegati alle cartucce e i campioni sono stati caricati nei serbatoi. Poi, i campioni sono stati passati a goccia. Successivamente, le colonne SPE sono state lavate con 6 ml di metanolo-acqua (15/85, v/v) e successivamente con 6 ml di n-esano. Le cartucce sono state asciugate sotto vuoto per 5 minuti prima di eluire i campioni in provette di vetro con 5 ml di metanolo. I campioni sono stati evaporati a secco a 45 °C sotto una leggera corrente di azoto e sono stati ridisciogliuti in 250 μl di metanolo mescolando al vortex per 20 secondi. Come fase finale, i campioni sono stati filtrati attraverso filtri di cellulosa rigenerata in fiale HPLC.

Strumentazione e attrezzature

Lo sviluppo del metodo è stato effettuato utilizzando un sistema Ascentis Express C-18 (2.1 × 100 mm, 2. 7 μm) UPLC LG 500 nm (Accucore RP-MS 100 × 3.0 MM, 2.6UM, ACQ-TQD-QBB1152, rivelatore Waters acuity PDA).7 μm) UPLC LG 500 nm sistema (Accucore RP-MS 100 × 3.0 MM, 2.6UM, ACQ-TQD-QBB1152, Waters acuity PDA rivelatore, Waters Corporation, Milford, MA, USA) accoppiato ad un rivelatore MS quadruplo MassLynx (Waters, Milford, MA, USA). L’acquisizione e la valutazione dei dati sono state eseguite con MassLynx versione 4.0. Il metodo finale è stato trasferito anche ad un Thermo ACQ-TQD Quantum Ultra LC-MS/MS sistema (Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA) che ha coinvolto un Waters acquity QSM pompa binaria (SN- L10QSM943A), un Waters acquity fin autosampler (SN-M10SDI443M), un termostato colonna e un TQD Quantum Ultra triplo quadrupolo MS rivelatore. Temperatura della colonna target e la temperatura del campione target erano 30 ° C e 10 ° C, rispettivamente. L’acquisizione e la valutazione dei dati sono stati eseguiti utilizzando il software Xcalibur 2.0.7. SP1. Entrambi i sistemi erano dotati di un’interfaccia electrospray (ESI) in cui durante l’acquisizione è stata utilizzata solo la ionizzazione negativa. L’azoto è stato utilizzato come gas di essiccazione e di collisione. I parametri della sorgente ionica sono riassunti nella tabella supplementare S2. Inoltre, la trasferibilità del metodo è stata studiata con un sistema LC-MS/MS che consisteva in un Agilent 1100 HPLC accoppiato a un AB Sciex 4000 triplo quadrupolo MS (Framingham, MA, USA).

Condizioni dello strumento

Le tossine Alternaria sono separati su un Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) colonna UPLC dotato di un 2,1 mm C-18 pre-colonna utilizzando eluizione gradiente lineare. Quattro solventi (solventi A, B, C e D) sono stati miscelati dalla pompa binaria. Il solvente A conteneva; acetonitrile (ACN) + acqua (5:95), il solvente B conteneva; ACN: 5% alcool isopropilico (IPA), il solvente C conteneva; 100% metanolo e il solvente D conteneva; acetato di ammonio puro. La velocità di flusso era di 0,5 ml/min. La fase mobile dei solventi nel tempo iniziale era 0,0% A, 30% B, 30% C e 40% D. Al tempo finale (5 min) i solventi erano 0,0% A, 30% B, 30% C e 40% D. Una fase di lavaggio sufficiente nel programma a gradiente era necessaria per rimuovere i soluti della matrice lipofila accumulati. Il tempo totale di analisi è stato di 5 minuti. Il termostato della colonna ha mantenuto la temperatura a 30 °C con un volume di iniezione di 1,0 μl. L’autocampionatore è stato azionato a 20 ° C.

Il sistema UPLC LG 500 nm è stato accoppiato ad un rivelatore MS / MS (Micromass Quattro Ultima PT) tramite un’interfaccia electrospray (ESI) che opera in modalità negativa. Le impostazioni ESI ottimizzate sono state le seguenti: temperatura della sorgente 120 °C, temperatura di desolvatazione 350 °C, flusso di gas di essiccazione 650 L/Hr, flusso di gas cono 30 L/Hr e tensione capillare 3,50 kV. L’azoto è stato utilizzato come gas di essiccazione e collisione (2,67 × 10-6 bar). La modalità di monitoraggio multiplo della reazione (MRM) è stata applicata nella MS durante la rilevazione e due transizioni ioniche sono state scansionate per ogni tossina target. La modalità MRM è stata applicata nel rivelatore MS/MS e due transizioni ioniche (quantificatore e qualificatore) sono state registrate per ogni composto bersaglio. Le transizioni ioniche selezionate con le tensioni ottimizzate (lente cono o tubo), energie di collisione (CE) e tempi di permanenza sono riassunti nella tabella (Tabella supplementare S2).

Valutazione del potenziale tossicologico di diverse micotossine di Alternaria (TeA, AOH e AME)

Misurazione del grado di morte cellulare come indotto da diverse micotossine sono stati determinati dal metodo di inoculazione foglia staccato. Per questo, i campioni di foglie fresche sono stati staccati dalle piante coltivate in serra e adeguatamente lavati per 3-4 minuti in acqua di rubinetto corrente, sterilizzati in ipoclorito di sodio all’1,0% (0,01 g/ml) per circa 1 minuto e poi puliti in superficie con etanolo al 70%, e infine sciacquati asetticamente con acqua distillata sterile. Infine, le foglie sono state poste su carta da filtro inumidita e forate da un ago sterile sulla superficie inferiore. Le tossine sono state dissolte in acqua deionizzata sterile alla concentrazione di 100 μg/ml. Gocce (100 µl) di ciascuna delle tre tossine sono state iniettate nelle foglie ferite con un ago sottile (Dispovan, 1 ml). Un campione di controllo è stato regolato iniettando acqua distillata sterile. I campioni di foglie trattati sono stati mantenuti all’interno di una camera umida (27 ± 0,5 °C e 60% di umidità relativa) in condizioni di serra (14 ore di luce e 10 ore di buio a 27 °C). Un’osservazione regolare (ogni 24 ore per 6 giorni) è stata fatta al fine di scoprire eventuali cambiamenti relativi agli effetti tossicologici sviluppati nei campioni iniettati rispetto ai campioni di controllo. Il set up sperimentale è stato mantenuto in tre repliche e la percentuale di area fogliare colpita a causa della morte cellulare indotta dalla tossicità è stata misurata da (misuratore di area fogliare Systronic 211) e calcolata con la formula riportata di seguito.

Determinazione della morte cellulare tramite il test di assorbimento del blu di Evans

La perdita di vitalità cellulare (morte cellulare) è stata valutata utilizzando il metodo di colorazione del blu di Evans (Baker e Mock, 1994). Le foglie di pomodoro sono state trattate con la stessa concentrazione (250 μg/ml) di tutte e tre le tossine. Le foglie trattate sono state colorate con una soluzione acquosa allo 0,25% (v/v) di blu Evans per 15 minuti. Dopo il lavaggio con acqua distillata per 30 minuti, le foglie sono state escisse e imbevute con 500 µl di N, N-dimetilformammide per 1 ora a temperatura ambiente. La densità ottica del blu Evans rilasciato è stata misurata spettrofotometricamente a 600 nm.

Analisi statistica

L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software IBM SPSS Statistics ver. 20 tramite l’analisi della varianza (ANOVA a una via) seguita dal test della gamma multipla di Duncan al livello di significatività P ≤ 0,05. I dati sono stati espressi come media ± deviazione standard (SD) di almeno tre replicati di ogni metabolita. Le analisi statistiche dei dati sono state analizzate in 48 isolati selezionati di specie di Alternaria che erano patogeni in natura.