L’importanza di distinguere le strategie di ricerca allocentriche ed egocentriche nei paradigmi di memoria spaziale dipendenti dall’ippocampo dei roditori: Ottenere di più dai dati

Paradigmi di memoria spaziale e di navigazione

Esiste una grande varietà di test comportamentali sia per i roditori che per gli esseri umani che forniscono una misura della memoria spaziale e della navigazione. Generalmente, i test di memoria spaziale dei roditori utilizzano apparati a labirinto che hanno un’area obiettivo che gli animali devono trovare, imparare e ricordare. Questi obiettivi possono essere rinforzi positivi come il cibo, fughe da stimoli negativi come l’acqua o la luce intensa o il risultato di un comportamento istintivo come la spinta esplorativa. I test di memoria spaziale umana, d’altra parte, sono per lo più condotti su setup di realtà virtuale che creano ambienti tridimensionali controllati con obiettivi che di solito vengono spiegati al soggetto dal ricercatore. Più recentemente, sono stati fatti dei passi per combinare aspetti di entrambi i test animali e umani per aumentare la somiglianza e quindi la traducibilità di questi test. Versioni di realtà virtuale di test per roditori sono state sviluppate per gli esseri umani, e sono diventate popolari anche le configurazioni di realtà virtuale e touchscreen per roditori che sono state sviluppate da equivalenti umani. Distinguere i quadri di riferimento allocentrici ed egocentrici e le strategie di ricerca utilizzate nei compiti di memoria spaziale per i roditori differisce a seconda del tipo di test. Alcuni compiti sono progettati per incoraggiare l’impiego di una singola strategia, e quindi le prestazioni su quel compito riflettono la salienza di quel particolare quadro di riferimento. Altri compiti possono essere completati con una combinazione di strategie allocentriche ed egocentriche, e sono necessarie analisi successive o test di sonda per dedurre deficit o preferenze in questi quadri di riferimento. La considerazione di quali tipi di navigazione spaziale vengono testati, e i passi extra per dissociare queste strategie sono spesso trascurati, nonostante la relativa facilità di implementazione di tali misure. Qui di seguito discutiamo i più diffusi labirinti utilizzati per studiare la memoria spaziale e vari test, controlli e analisi che possono aiutare a distinguere la navigazione egocentrica e allocentrica.

La memoria spaziale può essere studiata attraverso una varietà di test su labirinti come il labirinto a Y, il labirinto a scacchiera, il labirinto acquatico di Morris, il labirinto a stella, il labirinto di Barnes, il labirinto a bracci radiali e il labirinto a T. Questi labirinti comprendono l’indagine di una gamma di memoria spaziale, compresa la memoria a lungo, a breve termine e di lavoro, così come la flessibilità cognitiva. I test che sondano i quadri di riferimento allocentrici includono l’uso di spunti visivi statici che il roditore può utilizzare per sviluppare una mappa cognitiva. Si cerca di ridurre al minimo gli spunti prossimali e di creare spazi aperti e senza ostacoli per evitare strategie non allocentriche. L’opposto è vero per i compiti egocentrici in cui gli spunti visivi sono ridotti al minimo o resi irrilevanti (errati o casuali). Il modo più accurato di testare le strategie egocentriche è quello di eseguire un test al buio, che garantisce la rimozione di spunti visivi distali che potrebbero essere utilizzati per le strategie allocentriche. Molti apparati che vengono utilizzati per indagare la navigazione egocentrica limitano i movimenti a canali stretti o braccia per creare punti di scelta distinti in cui le strategie egocentriche sono incoraggiate.

Costruito a forma di “T” maiuscola, il labirinto T (Figura 2A) è un apparato semplice utilizzato per sondare la memoria spaziale di lavoro e a breve termine. A causa della forma del labirinto, solo due opzioni, un 90 gradi a sinistra o a destra, sono disponibili per il roditore quando lascia il braccio di partenza. Il labirinto a T può essere senza esca, con esche o con stimoli negativi per guidare l’esplorazione del labirinto. Generalmente, uno dei bracci è corretto (inesplorato, premiato con cibo/acqua, contenente una piattaforma di fuga) e viene appreso in presenza di una memoria intatta. Spunti visivi interni ed esterni possono essere utilizzati per sondare la strategia di navigazione. In breve, gli animali possono essere addestrati in presenza di spunti visivi extra-maze e di uno intra-maze. Raggiungere il braccio dell’obiettivo può essere raggiunto sia ricordando di girare nella direzione corretta, spostarsi verso o evitare l’intra-maze cue o spostarsi nella zona corretta in relazione alle indicazioni esterne statiche. Dopo aver acquisito con successo il compito, gli animali possono essere testati su prove sonda che comportano la commutazione sistematica degli spunti o della direzione corretta della svolta in modo che ora siano scorretti. In effetti, i ratti hanno dimostrato di avere una preferenza generale per una strategia basata sulla direzione sul T-maze, suggerendo che questo apparato incoraggia la navigazione egocentrica. Utilizzando simili manipolazioni di cue visivi sul T-maze, i topi transgenici che esprimono una mutazione legata alla malattia di Alzheimer hanno dimostrato di avere deficit specifici di apprendimento allocentrico del luogo in assenza di un disturbo generale nell’apprendimento e nella memoria, evidenziando l’importanza di includere questi test di sonda quando possibile.

Il labirinto a Y (Figura 2B) funziona in modo molto simile al labirinto a T; tuttavia, l’apparato è progettato a forma di Y con tre bracci uguali a 120 gradi l’uno dall’altro. Test senza esca sono popolari su questo apparato, basandosi sulla preferenza innata dell’animale di esplorare aree precedentemente inesplorate. La memoria a breve termine può essere testata bloccando l’accesso a uno dei bracci nella prima fase del test e osservando il tempo trascorso in quel braccio nella seconda fase in cui si può accedere a tutti e tre i bracci. C’è un ritardo variabile tra le fasi per controllare il carico di memoria a breve termine del compito. Questo nuovo compito di preferenza del braccio è un test per la memoria spaziale allocentrica, in quanto i roditori usano spunti sia intra- che extra-maze per ricordare la posizione del nuovo braccio. La memoria di lavoro può anche essere testata permettendo all’animale di esplorare liberamente tutti e tre i bracci e osservando se sceglie di entrare nel braccio esplorato più recentemente o se si alterna ed entra nel braccio più nuovo – questo è chiamato alternanza spontanea. L’alternanza spontanea può anche essere studiata sul T-maze; tuttavia, poiché i bracci del Y-maze sono uguali (e possono diventare ognuno nuovi bracci di partenza), l’alternanza può essere misurata continuamente senza interazione costante dello sperimentatore. Modificando il protocollo per includere braccia con esche e includendo o rimuovendo l’uso di spunti prossimali e distali permette l’indagine di strategie allocentriche ed egocentriche.

Il Biel water mazewas sviluppato da William Biel ed è costruito da più T-maze che si interconnettono per creare un labirinto in cui i roditori devono navigare da ‘Start’ a ‘Goal’ per sfuggire al labirinto. Il labirinto è eseguito in luce visibile, e non sono forniti espliciti spunti distali; inoltre, il labirinto è coperto da un grande contenitore per minimizzare l’accesso a spunti sia distali che prossimali. I parametri utilizzati per misurare la navigazione egocentrica includono gli errori tra le prove e la latenza di fuga. Tuttavia, questo labirinto aveva limitazioni nella progettazione e livello di difficoltà, soprattutto che è stato eseguito in luce visibile che potrebbe fornire spunti distali o prossimali dalla scatola sopra. Il labirinto d’acqua di Cincinnati (CWM) è un’estensione del labirinto d’acqua di Biel. Si tratta di un labirinto complesso che consiste in nove labirinti a T interconnessi (Figura 3). Un roditore sperimentale deve andare dalla posizione A alla posizione B ed è motivato dal suo istinto di sopravvivenza a lasciare l’acqua. È progettato per impiegare strategie di ricerca egocentriche basate sulle dimensioni fisiche e sul design del labirinto che crea nove punti di scelta (piuttosto che sei nel labirinto d’acqua di Biel) alle intersezioni dove i roditori devono fare una svolta a sinistra o a destra. Il CWM è costruito usando un materiale acrilico in modo che le pareti siano lisce e non ci siano spunti prossimali. La larghezza dei canali assicura che il roditore non possa arrampicarsi sulle pareti del labirinto, e l’esecuzione del test al buio sotto la luce infrarossa può agire come una doppia assicurazione contro l’uso di spunti visivi. In generale, il numero di errori, il numero di ritorni all’inizio e la latenza alla fuga sono i principali parametri riportati per questo labirinto.

Il labirinto radiale (RAM) consiste in un’area centrale circolare da cui si irradiano più braccia verso l’esterno. La memoria spaziale dei roditori è misurata dalla capacità di ricordare la posizione delle braccia esca attraverso l’uso di spunti salienti intorno alla stanza del labirinto (allocentrico) o un paradigma focalizzato sull’egocentrismo che impiega l’entrata forzata del braccio. Segue un esempio di paradigma egocentrico che utilizza la RAM. In questo caso il labirinto ha porte automatizzate che si aprono e si chiudono per consentire l’ingresso dell’animale. L’animale inizia in un braccio, e una volta iniziato l’esperimento, due bracci adiacenti al braccio iniziale vengono aperti per costruire una forma a Y. Ci sarà una ricompensa in cibo alla fine di un braccio, determinata per ogni topo a sinistra o a destra. Il braccio del labirinto inserito dall’animale diventa il nuovo braccio di partenza, che l’animale è limitato a durante un intervallo intertriale. Dopo un intervallo intertriale, si aprono due braccia adiacenti al nuovo braccio di partenza, e la direzione del braccio (sinistra o destra) viene corretta con una ricompensa in cibo. L’esperimento continua in questo modo e richiede all’animale di navigare nel labirinto in riferimento alla propria posizione. Limitando l’accesso a soli tre bracci (oltre al braccio iniziale) alla volta, questo assicura contro una strategia non egocentrica da utilizzare da parte dell’animale. Per esempio, se tutte le braccia della RAM fossero disponibili, l’animale potrebbe usare la strategia seriale di entrare in ogni braccio in modo sequenziale per trovare la ricompensa alimentare. Per la RAM, misure come il numero di errori e il grado del primo errore sono riportati per indicare le prestazioni della memoria. Mentre la RAM può essere utilizzata per studiare sia le strategie di ricerca egocentriche che allocentriche, il labirinto acquatico di Morris senza braccia è diventato lo standard per i test allocentrici, con l’acqua opaca aperta che funge da maschera per entrambi i punti di scelta per imparare una sequenza impostata, e l’olfatto. In contrasto con i disegni armati dei test egocentrici, i labirinti che mirano alle strategie spaziali allocentriche sono progettati per essere aperti e privi di oggetti/bordi intra-maze che possono agire come punti di scelta.

Il labirinto di Barnes si basa sulla preferenza per il buio, gli spazi chiusi dai roditori. Si tratta di un labirinto circolare aperto con fori lungo il perimetro (Figura 4). Sotto uno di questi fori c’è l’obiettivo della “scatola di destinazione”, che fornisce un piccolo spazio chiuso per il roditore. Durante il test il labirinto è inondato di luci, suoni e/o getti d’aria per motivare la ricerca dell’obiettivo. Spunti distali sono forniti intorno alla stanza per aiutare il roditore a navigare. Il numero di errori, la latenza di fuga e le strategie di ricerca sono comunemente riportati come misura delle prestazioni della memoria spaziale. Le manipolazioni di spunti visivi sul labirinto di Barnes mostrano che gli spunti distali sono più salienti di quelli prossimali, con gli animali addestrati senza spunti distali (con un marcatore nella posizione dell’obiettivo) mostrando prestazioni ridotte. Quindi questo compito tende a incoraggiare strategie allocentriche.

Il labirinto acquatico di Morris (MWM) è stato parte integrante della ricerca neuroscientifica come gold standard per testare la memoria spaziale nei roditori fin dalla sua introduzione (Morris et al. ). Il MWM utilizza una grande piscina circolare con acqua opaca e una piattaforma di fuga nascosta (Figura 5A). Più stecche distali sono posti intorno al labirinto per aiutare il roditore a raggiungere la piattaforma nascosta che usano per fuggire. La maggior parte dei protocolli vengono eseguiti su più giorni, con più prove al giorno, e mentre la posizione della piattaforma nascosta rimane la stessa, posizione di partenza per l’animale di ricerca è spesso cambiato per ridurre al minimo le strategie egocentriche. Tuttavia, se la posizione di partenza viene mantenuta coerente, e il test viene eseguito al buio senza spunti esterni, i roditori possono completare il MWM utilizzando una strategia egocentrica. Dopo l’addestramento, la piattaforma di fuga viene rimossa, e la memoria di riferimento viene testata. Ci si aspetta che gli animali trascorrano una maggiore quantità di tempo nel quadrante in cui si trovava precedentemente l’obiettivo. La posizione dell’obiettivo può anche essere cambiata per studiare l’apprendimento inverso e la flessibilità cognitiva. La motivazione principale per il roditore di navigare nel labirinto è quella di sfuggire all’acqua. Il vantaggio principale del MWM quando si testano le strategie di ricerca allocentrica è la rimozione dei segnali visivi e olfattivi all’interno del labirinto con l’uso di acqua opaca. Infatti, il mascheramento di qualsiasi spunto olfattivo disponibile è imperativo a causa del potente senso dell’olfatto dei roditori e dell’uso dell’olfatto nella loro navigazione. Tuttavia, l’acqua nel MWM può anche essere uno svantaggio, soprattutto quando si lavora con i topi perché non sono nuotatori naturali in natura e si stressano in acqua.

Il labirinto cheeseboard (CBM) (Figura 5B) è una versione secca del MWM ed è allo stesso modo un test di memoria spaziale a lungo termine, nonché una misura della flessibilità cognitiva. Il CBM è un’arena circolare uniforme con pozzi che possono essere adescati. I pozzi si irradiano in linee uniformi dal centro della tavola. Gli spunti spaziali sono collocati intorno al CBM. I roditori sono privati del cibo per la durata dell’esperimento per fornire la motivazione a trovare la ricompensa alimentare. La posizione del pozzo con l’esca è diversa per ogni animale e viene mantenuta costante tra le prove e i giorni per ogni singolo topo. Gli animali devono imparare a usare le indicazioni spaziali poste intorno al labirinto per trovare il pozzo con l’esca dall’area di partenza al centro per ricevere la ricompensa e ci si aspetta che usino strategie di ricerca allocentriche. Dopo l’acquisizione della posizione dell’obiettivo, la posizione della ricompensa alimentare viene cambiata, e l’animale deve quindi adottare una nuova strategia di apprendimento (inversione). Questa è una misura della flessibilità cognitiva e sta testando la capacità dell’animale di ignorare la posizione iniziale della ricompensa e imparare la nuova posizione della seconda ricompensa. Rispetto al MWM che si basa sulla motivazione di sopravvivenza, il CBM si basa sulla spinta della fame. Entrambi i compiti coinvolgono spunti distali per guidare il topo verso il suo obiettivo, che sia la piattaforma del MWM o la ricompensa alimentare del CBM. Queste diverse motivazioni potrebbero influenzare l’elaborazione cognitiva dei roditori. L’MWM è stato criticato come eccessivamente stressante, con l’animale di ricerca che deve impiegare l’apprendimento dell’evitamento. Il CBM, mentre la privazione di cibo può fornire uno stress simile, comporta un rinforzo positivo attraverso la ricompensa alimentare. Ci sono alcune argomentazioni che il rinforzo positivo potrebbe non essere sufficiente per incoraggiare gli animali da ricerca ad imparare, in confronto ad un test come il MWM dove le conseguenze negative devono essere evitate. Può essere che ogni test fornisca una diversa angolazione allo studio della cognizione. Lo stress da panico può essere dannoso per un apprendimento efficace o un impulso più forte rispetto alla privazione di cibo. Il vantaggio principale del MWM in termini di individuazione di strategie allocentriche ed egocentriche è che si tratta di un labirinto allocentrico più pulito. Nel MWM, l’uso di acqua opaca attraverso cui i roditori devono nuotare riduce al minimo la disponibilità di punti di scelta e di spunti olfattivi. In confronto, il CBM è un labirinto che richiede ai roditori di navigare non solo usando le indicazioni distali ma anche intorno ai pozzi. Quindi, i roditori possono incorporare questi pozzi nella loro strategia di navigazione, cosa che non può essere fatta nel MWM. Questo potrebbe fornire ai roditori l’opportunità di impiegare strategie non allocentriche, come la strategia seriale. Questo problema di rilevare dette strategie di ricerca egocentriche rispetto a quelle allocentriche è ulteriormente discusso nella sezione seguente.

Il labirinto Star (Figura 6), progettato da Rondi-Reig et al. è un labirinto d’acqua appositamente costruito che permette la distinzione delle strategie di ricerca allocentriche ed egocentriche. Si tratta di un labirinto d’acqua circolare composto da cinque canali d’acqua che formano un pentagono centrale, e cinque canali d’acqua si irradiano da questo pentagono. Le pareti del labirinto hanno un colore uniforme, e l’acqua è resa opaca. L’obiettivo del labirinto è quello di trovare la piattaforma nascosta per fuggire. Gli spunti extra-maze sulle pareti sono resi disponibili quando si analizza la navigazione allocentrica. L’impostazione di questo labirinto consente più protocolli per testare la navigazione allocentrica o egocentrica. Il primo protocollo, “la versione a strategie multiple”, è impostato per indagare la strategia di navigazione spontanea che viene impiegata dal roditore. Il secondo protocollo indaga la navigazione egocentrica impostando il labirinto in modo che una sequenza di movimenti di direzione mandi il roditore alla piattaforma di fuga. Il protocollo finale richiede ai roditori di utilizzare le indicazioni spaziali fornite per fuggire da punti di partenza assegnati in modo casuale. Questo labirinto è un ottimo setup in quanto permette l’elucidazione delle strategie di ricerca individuali, e dato che è un labirinto d’acqua, controlla la motivazione e le opportunità uguali.