Nuove intuizioni sulla struttura e la funzione dell’apoptosoma

Le prime informazioni strutturali sono state fondamentali per rivelare l’organizzazione del dominio dell’apoptosoma. L’apoptosoma umano contiene sette molecole Apaf-1 disposte simmetricamente in una struttura a forma di ruota per formare un hub centrale composto da NOD con sette bracci HD2 estesi, ciascuno terminante in una regione a forma di V che è formata dai due propulsori β. Le pieghe α/β del NBD e HD1 legano ADP/dATP tra di loro, mentre le ripetizioni WD40 formano le eliche β a 7 e 8 pale. Contrariamente ai suggerimenti precedenti, è stato trovato che le interazioni laterali tra le α/β-fold delle molecole di Apaf-1 adiacenti sono utilizzate per organizzare l’hub centrale, mentre le CARD N-terminali si trovano sopra questo anello, e sono disordinate in assenza di pc-9 (PDB 3J2T). Tuttavia, recenti strutture quasi atomiche hanno dimostrato che le CARD di Apaf-1 formano una caratteristica simile a un disco sulla superficie dell’apoptosoma attivo in presenza delle CARD di pc-9, e questa disposizione differisce da quella trovata in CED-4 e Dark (Figg. 1 e 2) . La stabilità dell’hub centrale è mantenuta da una complessa rete di interazioni α-eliche, legami idrogeno e ponti salini tra i moduli adiacenti NBD e HD1 da molecole Apaf-1 vicine. I contatti WHD/HD1 sui protomeri adiacenti sembrano sostenere l’assemblaggio dell’apoptosoma con i domini WHD che collegano i domini NBD e HD1 adiacenti. Come avviene in Dark, l’elica ISM in Apaf-1 (α12) è accoppiata con l’elica α13 attraverso ampie interazioni idrofobiche per formare un motivo elica-loop-elica in ogni subunità, che a loro volta, interagiscono lateralmente con le subunità adiacenti per formare un picchetto elicoidale che fiancheggia il poro centrale dell’anello.

Nelle cellule sane, i monomeri di Apaf-1 esistono in una conformazione chiusa e inattiva con ADP incorporato in una fessura nell’interfaccia del NBD-HD1 (PDB 1Z6T, 3SFZ). Questa conformazione chiusa presagisce la necessità di estesi cambiamenti conformazionali al monomero per facilitare l’assemblaggio dell’apoptosoma. In contrasto con la formazione dell’apoptosoma in C. elegans e Drosophila, il citocromo c rilasciato dai mitocondri durante la segnalazione dell’apoptosi si lega all’Apaf-1 monomerico, che innesca cambiamenti conformazionali che portano allo scambio di nucleotidi (ATP o dATP possono sostituire ADP), e la successiva oligomerizzazione di un Apaf-1 esteso per formare l’apoptosoma (Fig. 3) . Per comprendere i cambiamenti conformazionali che avvengono, sono necessari modelli accurati degli stati inattivi ed estesi di Apaf-1. Sono state determinate due strutture cristalline di monomeri inattivi di Apaf-1 con ADP legato, con uno privo di β-propulsori e il secondo privo dei domini CARD N-terminali per facilitare la cristallizzazione. Tuttavia, il NOD in queste due forme cristalline è praticamente identico e questo ha permesso di costruire un modello di consenso per l’intero monomero Apaf-1 con ADP legato. Strutture quasi atomiche dell’apoptosoma umano sono state ottenute da diversi gruppi utilizzando una singola particella cryo-EM, per fornire approfondimenti sulla conformazione estesa di Apaf-1 in assenza e presenza di pc-9 (PDB 3JBT, 5JUY, 5WVE; Fig. 3). Come previsto, la conformazione di Apaf-1 nell’hub centrale, nei bracci HD2 e nella regione di regolazione è essenzialmente identica in entrambi gli apoptosomi inattivi e attivi. Questi studi hanno fornito importanti dettagli sui residui specifici coinvolti nei contatti di van der Waals interdominio all’interno delle singole molecole di Apaf-1, hanno rivelato i residui critici per le interazioni di dominio che stabilizzano l’apoptosoma attivo, e hanno mostrato le interazioni all’interno del dominio sensore a forma di V delle eliche tandem a 7 e 8 pale β, che forma la superficie di legame del citocromo c

Nell’apoptosoma di Apaf-1, il sito di legame dATP è situato all’interfaccia NBD-HD1, ed è formato in parte dal ciclo Walker A e dal ciclo tra HD1 e WHD. Mentre Apaf-1 può legare ADP nello stato inattivo, c’è una piccola preferenza ad usare dATP per l’assemblaggio dell’apoptosoma in vitro (rivisto in rif. ), mentre ATP è molto più abbondante in vivo (~ 2 mM per ATP vs. 10 μM per dATP). Una certa stabilizzazione avviene attraverso le interazioni tra un residuo di arginina (Arg265) nel NBD, insieme a Ser325 e Tyr359 nel HD1 e la molecola ATP/dATP legata. Una rotazione della coppia NBD-HD1 intorno all’α-elica 20 nella WHD, posiziona l’anello HD1-WHD sul fondo della tasca nucleotidica, che permette alla coppia NBD-HD1 di formare interazioni circonferenziali all’interno dell’hub centrale durante l’assemblaggio. Questo rompe anche le interazioni con il WHD che normalmente stabilizzano una configurazione chiusa .

Sensori β-propulsori e legame del citocromo c

I “raggi” della ruota dell’apoptosoma sporgono verso l’esterno dell’hub dai domini HD2 e ogni braccio forma la base della regione a forma di V contenente i due domini sensori β-propulsori. Nella più lunga isoforma di Apaf-1, (Apaf-1XL) che è espressa nella maggior parte dei tessuti, le quindici ripetizioni WD40 formano tandem a 7 e 8 pale β-propulsori e un recente studio crio-EM ha indicato che questo ha un nuovo meccanismo di chiusura. Questa topologia delle β-eliche è simile a quella trovata nella proteina che interagisce con l’actina (Aip1p), in cui il linker da HD2 forma il d-strand dell’ultima lama nella β-elica a 8 pale (indicata dalla piccola regione blu presente all’inizio dell’elica a 7 pale in Fig. 1a), prima di attraversare per formare la β-elica a 7 pale. Questa topologia è stata verificata da una struttura cristallina di Apaf-1 murino a 3,0 Å risoluzione e sembra essere conservata nelle β-eliche scure.

Nell’apoptosoma Apaf-1, le β-eliche a forma di V formano la tasca di legame del citocromo c, e l’interazione con il citocromo c sembra essere stabilizzata da legami idrogeno e ponti di sale. Entrambe le forme ridotte e ossidate del citocromo c possono interagire con l’apoptosoma per mediare la sua attivazione. È interessante notare che il citocromo c sembra interagire preferenzialmente con l’elica β a 8 pale, mentre una superficie di contatto più limitata si forma con l’elica β a 7 pale. Il citocromo c è risolto a ~ 6 Å di risoluzione nelle nuove mappe, a causa del movimento locale e la molecola è ruotata di ~ 90°, rispetto a un modello precedente basato sul docking molecolare in una mappa dove le eliche non erano risolte. La mutagenesi diretta ha rivelato residui critici nel citocromo c richiesti per l’associazione stabile con i β-propulsori di Apaf-1, e alcuni di questi residui (G56, P76, I81) sono importanti per la formazione dell’apoptosoma e la successiva attivazione della caspasi .

Molecole troncate di Apaf-1 prive di regioni ripetute WD-40 possono anche assemblarsi per formare apoptosomi che sono costitutivamente attivi ma si smontano nel tempo . Questo ha suggerito che i propulsori β possono essere in qualche modo inibitori dell’assemblaggio mentre stabilizzano anche l’apoptosoma Apaf-1. Tuttavia, i propulsori β nell’apoptosoma Apaf-1 sono situati ad alto raggio e non interagiscono con le subunità adiacenti, né interagiscono con altri domini nel monomero, con l’eccezione di HD2. Quindi, il meccanismo di destabilizzazione rimane misterioso. Anche se speculativo, la mancanza di β-propulsori negli apoptosomi troncati potrebbe indebolire le interazioni di HD2 con l’hub centrale portando a un disassemblaggio dipendente dal tempo.

Ora è chiaro che il legame del citocromo c provoca una rotazione verso l’alto della regione β-propeller, che interrompe la connessione tra la 7-blade β-propeller e la coppia NBD-HD1 nel monomero Apaf-1 inattivo, mentre la 7-blade β-propeller ruota verso la 8-blade β-propeller in un movimento di serraggio. Questi eventi destabilizzano la conformazione autoinibita di Apaf-1 e facilitano lo scambio di nucleotidi promuovendo cambiamenti conformazionali che espongono la tasca di legame ADP per permettere il legame ATP/dATP. Questo stabilizza il monomero Apaf-1 in una conformazione estesa tale che può interagire con i protomeri vicini. Gli esperimenti di band shift suggeriscono che lo scambio di nucleotidi e i cambiamenti conformazionali associati in Apaf-1 possono verificarsi in risposta al legame del citocromo c perché non sono state rilevate alterazioni significative nella conformazione di Apaf-1 con aggiunta di dATP in assenza di citocromo c. Quando presi insieme, questi dati supportano un modello sequenziale in cui il legame del citocromo c si verifica prima dello scambio di nucleotidi, per facilitare la transizione da una conformazione chiusa a una estesa Apaf-1. Inoltre, questi risultati indicano che le ripetizioni WD40 agiscono come sensori che innescano l’assemblaggio iniziale dell’apoptosoma legando il citocromo c.

Meccanismi possibili di attivazione della procaspasi-9

La procaspasi-9 è reclutata dall’apoptosoma per formare un oloenzima che aumenta la sua attività catalitica. In soluzione, pc-9 è un monomero costitutivo quando non è legato ad Apaf-1, mentre le caspasi attive in generale sono dimeri. Notevolmente, un’interazione dimerica tra due monomeri pc-9 in un reticolo cristallino promuove la formazione di un sito attivo su una subunità catalitica, mentre la seconda subunità rimane in una configurazione inattiva (PDB 1JXQ) e un fenomeno simile si verifica nei dimeri CED-3 ad alta concentrazione. La CARD N-terminale in pc-9 interagisce con Apaf-1 CARD(s) per reclutare la procaspasi apicale all’apoptosoma e questo promuove l’attivazione del dominio catalitico, che è separato dalla CARD da un lungo linker (Fig. 2a) . Inoltre, le subunità p20 e p10 del dominio catalitico sono anche collegate da un linker che è soggetto ad auto-cleavage. Quindi, per capire come la pc-9 viene attivata dobbiamo capire il ruolo dei CARD e dei linker della pc-9 nell’olo-apoptosoma.

Sono stati proposti diversi modelli che spiegano i meccanismi di attivazione della pc-9 da parte dell’apoptosoma. Il “modello di dimerizzazione indotta dalla vicinanza” prevede che il reclutamento di molecole pc-9 nell’apoptosoma Apaf-1 possa facilitare l’omodimerizzazione, che si pensa porti all’autoattivazione della pc-9. Tuttavia, fino a poco tempo fa nessuna prova strutturale o biochimica aveva dimostrato che la pc-9 è omodimerica quando è legata all’apoptosoma (vedi sotto). Il “modello di conformazione indotta” ha proposto che l’apoptosoma Apaf-1 sia una piattaforma che lega pc-9 per facilitare la sua conformazione attiva. Una recente modellazione ha suggerito che l’attivazione della pc-9 è mediata principalmente attraverso la regolazione allosterica dalla piattaforma dell’apoptosoma. In tutti questi modelli, una funzione primaria dell’apoptosoma è quella di assemblare un complesso multimerico tra Apaf-1 e pc-9 CARDs per facilitare l’attivazione della pc-9 aumentando la concentrazione locale dello zimogeno. Inoltre, i dati su una pc-9 ingegnerizzata che è un dimero costitutivo in soluzione suggeriscono che il CARD e il suo linker possono inibire i domini catalitici. Quindi, la formazione di un eterodimero CARD sull’apoptosoma può rilasciare questa inibizione, tuttavia, questa idea rimane da testare.

Mentre la dimerizzazione può svolgere un ruolo chiave nell’attivazione, come questo avviene sull’apoptosoma è rimasto inspiegato, e infatti dati recenti hanno suggerito la possibilità di un meccanismo di attivazione più complicato che coinvolge sia l’omodimerizzazione delle molecole pc-9 che la formazione di eterodimeri di un singolo dominio catalitico pc-9 con il NBD di Apaf-1 . Intrigante, una conformazione inattiva del monomero Apaf-1 non preclude il legame pc-9 tramite interazioni CARD-CARD, come dimostrato da esperimenti di band shift. Così, pc-9/Apaf-1 eterodimeri possono essere reclutati per l’apoptosoma assemblaggio come parte della sua attivazione (Fig. 3). Rimane una questione aperta se l’assemblaggio di Apaf-1 in presenza di pc-9 è guidato da ulteriori interazioni tra CARD nel disco nascente.

Una struttura cristallina iniziale ha rivelato un complesso stabile 1:1 tra i domini CARD di Apaf-1 e pc-9 con un’interfaccia complementare (nota come Tipo I), che è indispensabile per l’attivazione di pc-9. Tuttavia, questo complesso stabile 1:1 è stato successivamente dimostrato essere insufficiente per attivare la pc-9. Invece, Apaf-1 e pc-9 CARDs formano complessi oligomerici di ordine superiore, stabilizzati principalmente da due delle tre possibili interfacce (note come TypeI, II e III), che si trovano anche in altri complessi Death Domain. Il confronto delle interazioni coinvolte nel disco CARD-CARD negli apoptosomi CED-4, Dark e Apaf-1, evidenzia una certa conservazione delle interfacce di Tipo II e III, con interazioni CARD di Tipo I trovate solo nell’apoptosoma umano. Una recente struttura di cristallo a risoluzione 2,1 Å ha rivelato un complesso eterotrimerico composto da due Apaf-1 CARD con una pc-9 CARD inserita nel mezzo. Le interazioni di tipo II che coinvolgono residui in pc-9 (Arg36/ Arg65) e Apaf-1 (Glu78) CARDs hanno dimostrato di essere critiche per l’attivazione pc-9, insieme alle interazioni di tipo I descritte in precedenza. Inoltre, un singolo residuo (Glu41 nella CARD di Apaf-1) può formare un’interazione biforcata con una CARD di pc-9 in un’interfaccia minima di tipo III. Ulteriori interazioni con Lys58 e Lys62 sulla Apaf-1 CARD hanno anche dimostrato di essere richieste per l’attivazione di pc-9 e possono aiutare a posizionare Apaf-1 CARD sulla piattaforma. Così, la formazione di un complesso CARD eterotrimerico fornisce un mezzo per legare più domini catalitici pc-9 alla piattaforma dell’apoptosoma.

Due strutture a risoluzione quasi atomica dell’apoptosoma attivo Apaf-1 hanno rivelato che l’architettura generale della disposizione a disco di Apaf-1 e pc-9 CARD crea un disco inclinato che si trova sopra l’hub centrale (Figg. 2 e 3). La mancata corrispondenza di simmetria tra il disco e la piattaforma risulta in un posizionamento acentrico del disco CARD quando viene visto dall’alto (Fig. 3). Il disco può essere descritto come una spirale di coppie Apaf-1 e pc-9 CARD con quattro Apaf-1 CARD che formano uno “strato” inferiore mentre tre o quattro pc-9 CARD sono presenti sulla superficie superiore (Fig. 2b-d). Inoltre, le CARD Apaf-1 si muovono più lontano dalla superficie del mozzo centrale, come spirale verso l’alto in modo sinistro e quindi, hanno diverse conformazioni linker e diverse interazioni con i loro NBD cognate nel mozzo centrale. Le coppie Apaf-1 e pc-9 CARD interagiscono attraverso interfacce di tipo II, e si uniscono lateralmente intorno alla spirale principalmente attraverso interazioni di tipo I. Notevolmente, solo quattro dei sette Apaf-1 CARDs interagiscono con pc-9 CARDs nel disco. Questo perché le restanti tre molecole Apaf-1 CARD non si adattano facilmente al modello di legame delle subunità della spirale e non possono continuare la spirale perché i loro linker CARD-NBD sono troppo corti. Le CARD di Apaf-1 di subunità adiacenti nell’apoptosoma si trovano in una cucitura (tra le posizioni 1a e 7a), dove la spirale smette di allungarsi verticalmente (Fig. 2c, d). La formazione del disco Apaf-1/pc-9 CARD è richiesta per l’attivazione dell’apoptosoma e i domini catalitici pc-9 sono legati in modo flessibile ai CARD attraverso un linker (Fig. 2a). In una struttura, un disco con quattro Apaf-1 CARDs e tre pc-9 CARDs è stato visualizzato, con una debole densità che indica che una quarta pc-9 CARD potrebbe legarsi alla parte superiore della spirale elicoidale ad una minore occupazione. In una seconda struttura, la configurazione predominante del disco conteneva 8 CARD con la conformazione delle CARD nella spirale molto simile tra le due strutture risolte indipendentemente (vedi sovrapposizione, Fig. 2d). Variazioni nel pH e nella concentrazione di sale possono spiegare la diversa occupazione dell’ottava posizione. Così, l’assemblaggio dell’apoptosoma promuove il reclutamento e la concentrazione locale di pc-9 CARDs, che permette la formazione di un nuovo oligomero elicoidale con 7 o 8 CARDs.

Un’analisi recente (da MALS e SAXS) ha mostrato che la formazione del complesso CARD è dipendente dalla concentrazione e che quantità uguali di Apaf-1 e pc-9 CARDs si associano come coppie attraverso l’interfaccia più forte di tipo I, con un complesso predominante 3:3 formato ad alta concentrazione in soluzione. Questo complesso CARD è stato cristallizzato e la struttura determinata a 3,0 Å risoluzione per rivelare una spirale sinistra di tre coppie Apaf-1/pc-9 CARD con una conformazione simile a quella osservata nell’apoptosoma ma con alcune differenze (PDB 5WVC; Fig. 2e). Tuttavia, l’ambiente nel cristallo è molto diverso da quello incontrato sull’apoptosoma in assemblaggio, in parte a causa dei contatti di reticolo e la mancanza di una superficie di nucleazione con vincoli imposti da CARD-NBD linkers. Questo può spiegare le differenze osservate tra le strutture CARD elicoidali. Questo include l’aggiunta di una o due CARD in più alla spirale simile a un disco nell’oloapoptosoma e l’avere quattro CARD Apaf-1 che formano la base del disco, piuttosto che tre come trovato in soluzione e nel cristallo. Dopo l’allineamento ottimale del disco 8 CARD con la spirale 6 CARD dalla struttura del cristallo, c’è una buona congruenza tra CARDs nelle posizioni 2p, 3a, e 4p, con qualche divergenza nella seconda metà della spirale 6 CARD (Fig. 2f, g). In particolare, l’Apaf-1 CARD in posizione 7a è dislocata verticalmente in una posizione intermedia, in assenza dell’Apaf-1 CARD in posizione 1a (Fig. 2g). Così, le interazioni tra la piattaforma e il disco CARD sono critiche per nucleare le più grandi spirali 7 e 8 CARD trovate sull’apoptosoma.

Durante l’assemblaggio del disco, la nucleazione della spirale può avvenire in diversi modi, compresa la formazione di un eterotrimerio CARD composto da due Apaf-1 CARD e una pc-9 CARD, con una Apaf-1 CARD situata alla base della spirale (in posizione 1a). La successiva aggiunta di due coppie Apaf-1/pc-9 CARD che interagiscono attraverso le loro interfacce di tipo I può quindi verificarsi con un tapping finale della spirale da una pc-9 CARD in posizione 8p in alcuni casi. Tuttavia, altre permutazioni sono possibili data la natura flessibile del linker Apaf-1 CARD-NBD tale che tre coppie Apaf-1/pc-9 CARD “Tipo I” possono essere nucleate in modo sequenziale dal mozzo centrale, con l’aggiunta di un Apaf-1 CARD alla base della spirale (in posizione 1a), durante le prime fasi del montaggio. Importante, l’assemblaggio del disco può essere cooperativo al fine di mantenere la corretta spaziatura dei quattro Apaf-1 CARD sull’apoptosoma, che formano la base della spirale.

Per l’apoptosoma attivo, una differenza importante è evidente sul mozzo centrale, quando si confrontano le strutture pubblicate (Figg. 3 e 4). In breve, la densità identificata come un dominio catalitico di pc-9 (p20/p10) si trova sul mozzo centrale in una recente mappa 3D, e questa caratteristica è risultata essere presente in circa il 50% dei complessi. Inoltre, una densità simile è stata visualizzata in una precedente mappa a bassa risoluzione dell’olo-apoptosoma, che ha permesso un ragionevole, anche se preliminare docking delle subunità p20/p10; quindi, la caratteristica osservata è riproducibile. Tuttavia, questa nuova densità è stata visualizzata solo a bassa risoluzione, il che può riflettere una certa flessibilità nell’attacco delle subunità p20/p10 all’hub centrale. In una mappa di risoluzione quasi atomica determinata dal gruppo di Yigong Shi, un’ulteriore densità a forma di falce è stata risolta a ~ 7 Å di risoluzione sul mozzo centrale, adiacente al disco CARD. Questa densità contiene chiaramente un ulteriore pc-9 CARD al centro, che interagisce con due Apaf-1 CARD situati su entrambi i lati, in un modo simile a quello osservato in due strutture di cristallo. Tuttavia, questa configurazione eterotrimerica potrebbe essere risolta solo in ~ 10% delle particelle. Così, sembra che le condizioni sperimentali durante la preparazione del campione e il congelamento della griglia possono influenzare il modo in cui pc-9 interagisce con potenziali siti di legame sul mozzo centrale, compresa la formazione di una spirale a disco con un numero variabile di pc-9 CARDs e nell’uso di siti di legame che si trovano adiacenti al disco acentrico. Quando le due recenti strutture asimmetriche dell’olo-apoptosoma sono allineate in base ai loro dischi CARD, i nuovi picchi di densità situati sull’hub centrale si trovano in posizioni abbastanza distinte (Fig. 4). Mentre il dominio catalitico pc-9 (p20/p10) può essere situato in due posizioni (con quella più probabile mostrata in Fig. 4c), la densità CARD tre è ruotato e ha un profilo diverso visto di lato (non mostrato), se confrontato con quello per pc-9 dominio catalitico (Fig. 4b, d). Il modello di densità del linker Apaf-1 CARD-NBD permette una precisa mappatura di tutti i linker CARD-NBD rilevanti nell’olo-apoptosoma CARD con sei CARD Apaf-1 ordinate (Fig. 4d). Criticamente, la lunghezza del linker (~ 25-30 Å) e le posizioni relative dei linker possono precludere il legame di un modulo di tre CARD alla posizione 1 o 2 sul mozzo centrale. Così, sembra che ci siano più siti sul mozzo centrale che possono essere utilizzati in modi diversi per legare un pc-9 CARD o un dominio catalitico.

Procaspase-9 è stato stimato legarsi all’apoptosoma con rapporti tra 2-5 zimogeni per 7 molecole di Apaf-1, quindi sembra che il numero esatto di molecole di pc-9 legate all’apoptosoma possa variare a seconda delle condizioni durante l’assemblaggio, il che può riflettere la natura dinamica di questa macchina proteolitica. Per estensione, sembra chiaro che un sesto o un settimo pc-9 CARD non è legato dalle loro controparti Apaf-1, rispetto ai siti già documentati sull’apoptosoma, il che può riflettere sia una limitazione sterica o la necessità di un oligomero più grande per stabilizzare le pc-9 CARD legate. È importante notare che alcuni domini catalitici pc-9 non sono visti nelle attuali mappe di densità cryo-EM, a causa del loro attaccamento flessibile attraverso lunghi linker CARD-p20, il che rende difficile decifrare e comprendere i precisi meccanismi di attivazione, evidenziando la necessità di ulteriori studi su singole molecole.

La funzione primaria dell’apoptosoma è di attivare pc-9 in modo che possa eseguire l’apoptosi. Mentre gli studi strutturali hanno fornito informazioni sul reclutamento e sui requisiti per l’attivazione della pc-9, una serie di test biochimici ha ora dimostrato che sia la dimerizzazione indotta dalla vicinanza che la regolazione allosterica della pc-9 monomerica sono fondamentali per regolare la funzione dell’apoptosoma e possono anche governare la durata dell’attività dell’apoptosoma. In primo luogo, il reclutamento di pc-9 da parte dell’apoptosoma aumenta la sua concentrazione locale per consentire l’omodimerizzazione, che aumenta la sua affinità per il complesso. È interessante notare che una pc-9 non scalfibile ha una maggiore propensione all’omodimerizzazione e mostra una maggiore attività proteasica (scissione della caspasi-3) all’interno dell’apoptosoma, rispetto alla caspasi-9 scalfita. Di conseguenza, la scissione del linker inter-subunità p20/p10 del dominio catalitico riduce l’affinità della pc-9 per l’apoptosoma e una volta processata, la caspasi-9 viene rilasciata e non si lega nuovamente all’apoptosoma. È importante notare che questi studi hanno dimostrato che l’omodimerizzazione della pc-9 è l’evento chiave richiesto per l’attivazione e che l’apoptosoma agisce per facilitare questo evento. Questo è coerente con gli studi biochimici di altre caspasi CARD, come la caspasi-2 e Dronc, dove l’attivazione iniziale richiede la dimerizzazione, piuttosto che la scissione dello zimogeno. La stabilizzazione del legame della pc-9 all’apoptosoma non richiede solo interazioni CARD-CARD, ma anche interazioni della piccola subunità pc-9 (p10) attraverso il suo motivo GCFNF404 per formare omo- ed eterodimeri. Ciò che non è chiaro a questo punto, è come la formazione dell’omodimero pc-9 influenzi la stabilità del disco CARD-CARD, poiché i dimeri del dominio catalitico sembrano essere abbastanza flessibili, poiché possono essere rilasciati dall’olo-apoptosoma dalla trombinolisi sito-diretta e non sono risolti nelle mappe crio-EM raffinate senza simmetria. Il motivo GCFNF in pc-9 interagisce anche con un NOD Apaf-1 per formare eterodimeri pc-9/Apaf-1 che scindono efficacemente la caspasi-3. Questi dati suggeriscono che un dominio catalitico pc-9, che interagisce direttamente con l’apoptosoma, può essere attivo. Questo sito attivo putativo per la scissione della caspasi-3 può corrispondere alla nuova densità osservata sull’hub centrale che è stata interpretata come una molecola p20/p10 e sono necessari ulteriori studi su questo punto. Se presi insieme, questi risultati indicano che pc-9 può avere due diverse conformazioni attive all’interno dell’apoptosoma, con uno o forse due omodimeri legati al disco CARD e un eterodimero pc-9/Apaf-1 legato all’hub centrale. Quando gli olo-apoptosomi con un modulo CARD legato all’hub centrale sono presi in considerazione, allora sono possibili almeno sei permutazioni per la disposizione da tre a cinque domini catalitici pc-9 (Fig. 5). Così, il numero di possibili domini catalitici pc-9 attivi (come omodimeri ed eterodimeri) varierà a seconda del numero di molecole pc-9 reclutate nell’apoptosoma, poiché esse riempiono i possibili siti di legame mediati dai CARD di Apaf-1.

Finalmente, la scissione completa della pc-9 da parte della caspasi-3 rimuove il linker inter-subunità e ripristina la piena attività della caspasi-9, indicando che la caspasi-3 ha anche un feedback proteolitico sulla pc-9 che può amplificare il segnale apoptotico. Un meccanismo simile è stato proposto per la caspasi-2. Questi studi biochimici hanno inoltre presentato un modello di timer molecolare in cui il tasso di dissociazione della caspasi-9 dall’apoptosoma è determinato da una scissione iniziale del linker p20-p10 che riduce la sua affinità di legame all’apoptosoma. Tuttavia, la completa dissociazione della caspasi-9 scissa dall’olo-apoptosoma richiederebbe il rilascio della sua CARD dal modulo disco o tre CARD. Quindi, ci può essere una gerarchia per il rilascio delle molecole attive di caspasi-9 che dipende dall’ambiente locale delle loro CARD. Il design del disco CARD, con tutte le CARD pc-9 situate sulla superficie superiore, può anche facilitare il rilascio della caspasi-9.