Orologi biologici

L’alternanza del giorno e della notte del ciclo terrestre è così affidabile che non sorprende che animali, piante e batteri regolino il loro comportamento e la loro fisiologia (per una rassegna, vedi rif. 1). I ritmi circadiani sono un adattamento onnipresente di tutti gli organismi alle sfide ambientali più prevedibili. Un ritmo biologico che persiste in condizioni costanti e ha un periodo di ≈1 giorno è chiamato “circadiano” (circa, “intorno”; dian, “giorno”).

Fino a poco tempo fa, le molecole alla base dell’oscillazione sono rimaste sconosciute. La perturbazione di tali oscillazioni mediante inibitori della sintesi dell’RNA o delle proteine suggerisce che tali molecole sono coinvolte (2).

Un approccio che ha avuto successo nello svelare i meccanismi è l’uso di alterazioni genetiche. Il primo e il secondo mutante dell’orologio scoperto nel moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, sono i geni del periodo e del senza tempo (3-5).

Nei moscerini della frutta, l’abbondanza di mRNA e di prodotti proteici dei geni del periodo e del senza tempo si alternano per ≈24 ore in siti specifici del cervello della mosca (6). Maki Kaneko et al. hanno parlato di queste cellule pacemaker putative nel cervello del moscerino della frutta usando queste oscillazioni molecolari come marker (7). Nella testa adulta, gli studi sulle proteine hanno mostrato che per è ritmicamente espresso in siti specifici, i neuroni laterali situati tra il cervello centrale e i lobi ottici. I neuroni laterali sono considerati come le cellule pacemaker putativo per il ritmo di attività locomoter della mosca adulta.

Kaneko et al. (7) hanno dimostrato che i prodotti di per e tim sono rilevabili in un numero limitato di neuroni nel cervello larvale. I modelli di espressione in diverse di queste cellule sono ciclici. Tra questi neuroni, cinque cellule situate lateralmente esprimono. PERIODO (PER) dal primo stadio larvale, suggerendo che possono essere responsabili del mantenimento del tempo larvale dell’eclosione e dell’attività del locomotore. Un’altra scoperta interessante è un gruppo di neuroni con l’espressione ciclica di per e tim in antifase ai neuroni laterali. I risultati implicano la presenza di più oscillatori coinvolti nei ritmi di diversi processi fisiologici o comportamentali in un singolo organismo. Kaneko et al. (7) hanno anche descritto la caratterizzazione anatomica dei modelli di cablaggio dei neuroni pacemaker utilizzando per espressione del gene reporter dipendente dal promotore. Tale approccio anatomico molecolare dovrebbe portare una nuova visione nella mappatura funzionale di questo sistema cerebrale. Inoltre, il confronto tra le cellule dell’orologio dei mammiferi e della mosca dovrebbe chiarire la relazione evolutiva tra questi sistemi.

Il controllo circadiano della trascrizione fornisce un punto di ingresso per analizzare gli elementi regolatori cis-acting e i fattori trans-acting attraverso i quali l’orologio può regolare molte espressioni geniche controllate dall’orologio (6). Questi elementi di regolazione cis-acting putativi, chiamati “time-box” (8), si suppone che si trovino nella regione del promotore e dell’enhancer dei geni controllati dall’orologio. Inoltre, l’elemento reattivo controllato dall’orologio (6) o time-box può regolare i fenomeni fisiologici circadiani endogeni in condizioni costanti. Più recentemente, un possibile candidato per il time-box è stato identificato nella regione promotrice del gene period della Drosophila (9). Anche se per è stato proposto di mediare il ciclo dell’mRNA attraverso la repressione trascrizionale, l’interazione diretta tra per e DNA è molto improbabile a causa della mancanza di un dominio di legame al DNA in PER. Il gruppo di Hardin ha ampiamente analizzato la regione del promotore del gene per in studi che hanno utilizzato mosche transgeniche del gene di fusione per-lacZ (9). Hanno identificato un enhancer trascrizionale circadiano all’interno di un frammento di 69 bp di DNA contenente un E-box a monte del gene per, che è responsabile dell’attivazione notturna dell’espressione del gene per. L’E-box è un noto sito di legame per la classe di fattori di trascrizione basic helix-loop-helix.

Di recente, il candidato più forte per un fattore trans-agente nell’oscillatore è Clock, clonato usando una strategia forward-genetica (10). Il gruppo di Takahashi (10) ha isolato e analizzato l’attività del locomotore di ceppi di topi mutanti circadiani. Il mutante Clock mostrava un lungo periodo che diventava aritmico dopo diversi giorni di buio costante. Takahashi e colleghi (10) hanno clonato con successo il gene responsabile e hanno identificato la mutazione nella regione codificante la proteina del gene Clock. È interessante notare che la proteina Clock contiene un dominio di legame proteico (PAS), che si trova nel gene per della Drosophila e un motivo basic helix-loop-helix per il legame al DNA. Inoltre, Takahashi e colleghi (10) sono stati in grado di salvare completamente il periodo lungo e il fenotipo aritmico dei topi mutanti di clock mediante il trasferimento del gene clock normale.

Ravi Allada et al. hanno descritto i componenti molecolari comuni concentrandosi su Clock, che è responsabile della generazione del ritmo circadiano sia nelle mosche che negli umani (11). Allada e i suoi colleghi (11) hanno esaminato mosche chimicamente mutagenizzate alla ricerca di mutanti che alterano o aboliscono la ritmicità circadiana dell’attività del locomotore e hanno trovato un nuovo mutante aritmico, inizialmente chiamato Jrk. Le mosche Jrk esprimono bassi livelli di periodo e proteine senza tempo a causa dei ridotti livelli di trascrizione. Il gene è stato identificato e mostra una notevole conservazione della sequenza con il gene del ritmo circadiano dei mammiferi, Clock; quindi, Allada et al. (11) hanno rinominato questo gene della mosca dClock. Come l’orologio del topo, l’orologio della drosofila contiene domini basic helix-loop-helix e PAS così come un dominio di attivazione trascrizionale.

Recenti lavori sia dei mammiferi che delle mosche suggeriscono che anche i partner proteici di CLOCK sono evolutivamente conservati (chiamati BMAL) (12, 13). È stato dimostrato che i dimeri CLOCK-BMAL si legano alla regione promotrice dei geni period e timeless e transattivano entrambi i geni nelle mosche. Inoltre, l’espressione PERIOD-TIMELESS (PER-TIM) reprime l’induzione del reporter mediata da CLOCK-BMAL. Così, è stato proposto un modello di feedback negativo (Fig. 1).

Nei mammiferi, il SCN nell’ipotalamo è considerato un importante pacemaker per i fenomeni del ritmo circadiano, come dimostrato da molti studi anatomici e fisiologici (14). Recentemente, tre omologhi del gene del periodo di Drosophila sono stati riportati nel topo e nell’uomo (15). Nonostante l’esistenza di tre omologhi mammiferi del periodo che mostrano l’oscillazione circadiana dell’mRNA nel nucleo soprachiasmatico nel cervello del topo, non è stata riportata alcuna implicazione funzionale del comportamento circadiano del locomotore.

Per chiarire se il per omologo dei mammiferi potrebbe essere coinvolto nel ritmo circadiano del comportamento locomotore dei mammiferi, il gruppo di Ishida ha clonato un per omologo dei ratti e ha reso aritmici i ratti SCN-lesionati per monitorare i ritmi circadiani nei tessuti periferici (16).

Per verificare se l’espressione ritmica dell’mRNA del PERIODO 2 di ratto (RPER2) si osserva in tessuti diversi dal SCN, sono state effettuate analisi di Northern blot su tessuti dell’occhio, del cervello, del cuore, della milza dei polmoni, del fegato e dei reni. È interessante notare che tutti i tessuti esaminati hanno mostrato un’espressione ritmica di RPER2 mRNA, anche se il rapporto notte/giorno era diverso in ogni tessuto. RPER2 si comporta come un omologo mammifero del gene del periodo di Drosophila (16) perché la sua espressione circadiana era alta di notte in una grande varietà di tessuti come il periodo è in Drosophila.

Perché il SCN è considerato come un pacemaker dell’orologio circadiano nei mammiferi, il gruppo di Ishida (16) ha testato se l’espressione circadiana di più tessuti di RPER2 mRNA è influenzata da una lesione SCN. Abbastanza sorprendentemente, la natura ritmica dell’espressione tissutale multipla di RPER2 è stata completamente abolita dalla lesione del SCN. L’espressione tissutale multipla di RPER2 è quindi sotto il controllo del SCN. Questa è la prima relazione che indica che il ritmo circadiano multitessuto è governato da un orologio cerebrale dei mammiferi, il SCN dell’ipotalamo. I dati suggeriscono anche che un omologo mammifero per (RPER2) potrebbe essere coinvolto nel ritmo circadiano del comportamento locomotore nei mammiferi, perché la perdita di espressione circadiana di RPER2 mRNA in tutto il corpo si è verificato quando l’attività circadiana locomotore di ratti è stato perso. Per chiarire tale problema, dobbiamo fare animali transgenici con una mutazione loss-of-function o gain-of-function nel gene RPER2. Il fatto che l’espressione ritmica dell’mRNA di RPER2 in diversi tessuti dipende completamente dal SCN suggerisce che alcuni segnali sono necessari per mantenere coordinatamente il ritmo di tutto il corpo (Fig. 2). Uno studio sul trapianto di SCN suggerisce anche l’importanza dei fattori umorali del SCN (17). Tali fattori umorali dal SCN potrebbero essere importanti per generare l’espressione ritmica circadiana del gene RPER2 nei tessuti periferici. Così, sembra, come nel caso della biologia dello sviluppo, che le molecole chiave di questo orologio biologico siano ben conservate tra mosche e mammiferi. Il meccanismo dell’orologio molecolare comune dai batteri (18) all’uomo potrebbe essere previsto nel prossimo futuro.