PLOS ONE
Discussione
La maggior parte dei farmaci chemioterapici sono specificamente progettati per interferire con la sintesi del DNA, il metabolismo cellulare e la divisione cellulare. A causa di questa modalità d’azione, ci si aspetta che questi farmaci causino diversi tipi di mutazioni. La mutagenicità dei farmaci chemioterapici per le cellule normali è uno dei problemi più gravi della chemioterapia a causa della possibilità di indurre tumori maligni secondari ed esiti riproduttivi anomali come le sindromi di Down, Klinefelter e Turner. Pertanto, è imperativo determinare l’effetto mutageno dei farmaci chemioterapici sulle cellule normali. Il test del micronucleo è stato ampiamente utilizzato per misurare i danni non riparati al genoma, e l’aumento della frequenza di MN predice il rischio di cancro nell’uomo. Poiché MN può derivare da rottura cromosomica (clastogenicità) o cromosomi in ritardo (aneugenicità), il rilevamento di MN ha il potenziale per essere utilizzato come uno schermo per l’induzione di aberrazioni cromosomiche numeriche se i saggi che consentono l’identificazione di interi cromosomi all’interno di MN, come il saggio FISH, sono inclusi.
L’attività clastogenica di epirubicina durante la mitosi in vivo è stata segnalata dal test MN del midollo osseo . Attualmente, l’origine della MN indotta dall’epirubicina non è ancora stata determinata. Pertanto, lo studio attuale è stato progettato per indagare la capacità dell’epirubicina di indurre l’aneuploidia nelle cellule somatiche e germinali di topi maschi. Per determinare l’efficienza del metodo, due mutageni modello, la colchicina e la mitomicina C, noti per avere azioni aneugeniche e clastogeniche, rispettivamente, sono stati utilizzati come controlli positivi. I risultati osservati del MNPCE e la distribuzione dei segnali per MN nel controllo e i due mutageni positivi nello studio attuale corrispondono bene con i dati pubblicati, . Questi dati hanno confermato la sensibilità del protocollo sperimentale seguito nella rilevazione degli effetti genotossici.
I risultati del test MN hanno dimostrato che l’epirubicina produce aumenti dose-dipendenti nella formazione di MN nel midollo osseo del topo in vivo (Fig. 1) e un aumento dei MN colorati centromerici-negativi e centromerici-positivi, indicando l’induzione sia di clastogenicità che di aneugenicità (Fig. 2). Sia il potenziale clastogenico che quello aneugenico dell’epirubicina nelle cellule somatiche possono dare origine allo sviluppo di tumori secondari. I risultati della clastogenicità confermano i risultati di precedenti studi in vivo, dove dopo il trattamento con epirubicina sono stati osservati aumenti nella formazione di MN e aberrazioni cromosomiche strutturali nelle cellule somatiche del topo in un intervallo di dosi simile. I risultati di questi studi concordano anche con l’induzione di micronuclei precedentemente riportata da epirubicina in cellule tumorali murine in vitro, negli eritrociti di uova di gallina incubate e nella linea cellulare umana linfoblastoide TK6. Inoltre, l’induzione di aberrazioni cromosomiche strutturali e numeriche è stata anche segnalata in precedenza in pazienti affetti da cancro che ricevevano una chemioterapia contenente epirubicina. Studi precedenti hanno anche dimostrato che l’epirubicina induce aberrazioni cromosomiche strutturali in cellule HeLa in coltura, aberrazioni cromosomiche sia strutturali che numeriche e scambi di cromatidi sorella in una linea cellulare di criceto cinese, e aberrazioni cromosomiche in colture di linfociti del sangue periferico di donne con cancro al seno trattate con un regime contenente epirubicina in vitro.
Studi sugli esseri umani hanno dimostrato che alcuni regimi di chemioterapia aumentano la frequenza di aneuploidia nelle cellule germinali, suggerendo che tali pazienti possono essere a più alto rischio di esiti riproduttivi anormali, in particolare nelle età riproduttive. Pertanto, è di interesse generale per diminuire il rischio di produzione di aneuploidia, rilevare le cellule germinali aneugeni e capire i meccanismi causali. Nello studio attuale, l’aneuploidia è stata determinata nelle cellule germinali mediante il test spermatico-FISH con sonde di DNA specifiche per i cromosomi 8, X e Y del topo, ciascuno etichettato con un colore diverso. Per determinare l’affidabilità dei metodi, la colchicina, nota per essere prevalentemente aneugenica, è stata usata come sostanza di controllo positivo, e i risultati del controllo positivo e negativo erano nella stessa gamma di quelli degli studi precedenti, -. Questi dati hanno confermato la sensibilità del protocollo sperimentale nel rilevamento degli effetti aneuploidogenici dei composti testati.
Epirubicina è più attiva nelle fasi S e G2 del ciclo cellulare; tuttavia, ha qualche attività rilevabile in tutte le fasi del ciclo cellulare . È stato spesso riportato che le sostanze chimiche con proprietà aneugeniche possono alterare la progressione della divisione cellulare sia in cellule meiotiche che mitotiche. Nello studio attuale, il tempo di sviluppo dalle divisioni meiotiche negli spermatociti agli spermatozoi epididimali è stato valutato mediante il saggio di incorporazione di BrdU. I risultati indicano chiaramente che l’epirubicina ha prolungato la durata delle divisioni meiotiche negli spermatociti di topo per 48 h (Fig. 3). Queste osservazioni confermano quindi i risultati precedenti che l’inibizione indotta dall’epirubicina della funzione della topoisomerasi II durante diverse fasi del ciclo cellulare rallenta la progressione del ciclo cellulare e causa l’arresto delle cellule nella fase G2/M. Tale arresto G2/M può essere dovuto all’induzione del meccanismo di checkpoint G2, che permette al DNA danneggiato di essere riparato prima che le cellule passino alla fase successiva del ciclo cellulare.
Le informazioni in vivo sugli effetti dell’epirubicina sulla non-disgiunzione durante la meiosi sono limitate, ma alcune altre antracicline, come la doxorubicina e il suo derivato idarubicina, impediscono la segregazione cromosomica e inducono un aumento significativo delle frequenze di spermatozoi disomici e diploidi. Inoltre, uno studio in vitro ha dimostrato che il trattamento di colture di criceto cinese con epirubicina ha indotto aberrazioni numeriche sotto forma di ipodiploidia e iperdiploidia. Inoltre, l’analisi citometrica a flusso e istologica della spermatogenesi del topo ha mostrato un aumento del coefficiente di variazione dell’istogramma del DNA come misura di aneuploidia, e un aumento degli spermatidi diploidi dopo il trattamento con epirubicina. In accordo con i rapporti sopra citati, il presente esperimento ha dimostrato che l’esposizione all’epirubicina ha causato significativi aumenti dose-dipendenti nelle frequenze di spermatozoi disomici e diploidi e che l’induzione di aneuploidia era linearmente dose-responsivo tra 0 e 12 mg/kg di epirubicina (Fig. 4). Queste osservazioni in vivo sono anche in linea con una precedente relazione in vitro su linfociti umani coltivati da individui sani e pazienti oncologici in cui l’esposizione alla doxorubicina ha causato un aumento delle trisomie dei cromosomi 7 e 17 . Inoltre, Ganapathi et al. hanno riferito che le cellule di leucemia umana HL-60 che portano la monosomia 8 come unico cambiamento cariotipico hanno acquisito marcatori 7q21 dopo l’esposizione alla doxorubicina. Inoltre, i risultati citogenetici hanno mostrato la trisomia 8 in pazienti che hanno ricevuto cicli di chemioterapia sistemica con antracicline. Monosomia 7, 7q-, e traslocazione sbilanciata tra cui il cromosoma 7 sono stati osservati in pazienti che hanno ricevuto la chemioterapia contenente antracicline . Inoltre, aberrazioni cromosomiche strutturali dei cromosomi 1, 9 e 16 sono stati correlati a farmaci chemioterapici contenenti antracicline.
Tra le altre classi di inibitori della topoisomerasi II, etoposide è stato studiato in precedenza in spermatociti di topo, . I risultati di questi studi indicano che l’etoposide agisce come un agente genotossico e induce aneuploidie nelle cellule germinali principalmente meiotiche dopo il trattamento delle cellule pachitene. D’altra parte, Kallio e Lähdetie, hanno trovato che la sensibilità all’etoposide nei topi era massima durante la diplotene-diakinesis degli spermatociti primari, ridotta durante il tardo pachytene e bassa durante gli stadi preleptotene; un modello molto diverso rispetto alle sostanze chimiche alchilanti del DNA. Questi autori hanno suggerito che l’etoposide ha causato un fallimento della risoluzione dei bracci cromosomici ricombinati, probabilmente associato all’arresto del ciclo cellulare e all’attivazione della via apoptotica. Nei loro studi citogenetici dettagliati, Marchetti et al. riportarono che il pachitene era lo stadio più sensibile della spermatogenesi per l’induzione di aberrazioni cromosomiche strutturali e aneuploidia. Poiché i dati di Schmid et al. e quelli di Kallio e Lähdetie hanno potuto dimostrare che l’etoposide ha prolungato il ciclo cellulare meiotico, sembra possibile che gli effetti visti nelle prime divisioni di clivaggio da Marchetti et al. nel gruppo di accoppiamento di 24,5 giorni possano essere stati effettivamente indotti in una fase successiva, cioè durante la diacinesi meiotica, MMI o MMII invece di pachytene come suggerito dagli autori.
Nello studio attuale, abbiamo pianificato lo studio spermatico-FISH per determinare se il trattamento subacuto con basse dosi dell’inibitore della topoisomerasi II epirubicina avrebbe un effetto perché le fasi precedenti della profase sarebbero incluse nel trattamento con epirubicina. Dosi individuali di 0,25, 0,5 e 1 mg/kg di epirubicina sono state iniettate in 12 giorni consecutivi, e lo sperma è stato campionato 23 giorni dopo l’ultimo trattamento con epirubicina. Un totale di 12 mg/kg di epirubicina applicata all’intera profase della meiosi ha aumentato significativamente le frequenze di spermatozoi disomici e diploidi, mentre una dose totale di 3 e 6 mg/kg di doxorubicina era negativa (Fig. 5). Al contrario, una singola dose di 6 mg/kg di epirubicina applicata agli spermatociti durante MMI/MMII ha dato un risultato positivo (Fig. 4). Questi dati suggeriscono che le fasi precedenti della profase contribuiscono relativamente meno all’aneuploidia indotta dall’epirubicina nelle cellule germinali maschili.
Nel presente studio, è stato riscontrato che l’epirubicina ha causato un notevole aumento di spermatozoi autodiploidi (XX88 e YY88). Dopo il trattamento con epirubicina, gli spermatozoi autodiploidi risultanti dall’arresto di MMII erano più frequenti di quelli diploidi risultanti dall’arresto durante MMI (XY88). Quindi, la seconda divisione meiotica era più sensibile al trattamento con epirubicina rispetto alla prima divisione meiotica. La conclusione che le seconde divisioni meiotiche erano più sensibili al trattamento con epirubicina rispetto alle prime divisioni meiotiche è supportata anche dalle frequenze osservate di cromosomi sessuali disomici. Gli spermatozoi con segnali di XX8 o YY8 erano più frequenti di quelli con segnali di XY8. Queste osservazioni confermano che il saggio spermatozoo-FISH per la disomia o diploidia è in grado di rilevare gli effetti indotti durante entrambe le divisioni meiotiche e di confrontare la sensibilità di entrambe le divisioni meiotiche, come precedentemente riportato , .
Nel presente saggio spermatozoo FISH, è stato trovato che la più bassa dose positiva per causare spermatozoi disomici o diploidi era 6 mg/kg di epirubicina. Tuttavia, gli studi MN del midollo osseo del topo hanno mostrato che l’esposizione a 3 mg/kg di epirubicina ha prodotto un aumento significativo di MNPCE. Questa osservazione suggerisce che MN nel midollo osseo sono indotti a dosi più basse di disomie o diploidie nello sperma. Quindi, il midollo osseo è il tessuto più sensibile. Tuttavia, i saggi misurano diversi punti finali. La perdita e la rottura dei cromosomi è misurata nel test MN, mentre la non disgiunzione è rilevata nel test spermatico-FISH. Pertanto, i dati attuali confermano il paradigma generale della valutazione del pericolo, che afferma che un risultato positivo del test MN del midollo osseo è un indicatore del potenziale genotossico di un composto nelle cellule germinali. Tuttavia, la quantificazione dell’aneuploidia nelle cellule germinali è importante ai fini della valutazione del rischio.
Gli inibitori della topoisomerasi del DNA hanno una chiara tendenza a causare rotture del DNA a doppio filamento, che portano principalmente alla formazione di MN negativa al centromero. Analogamente, la dimostrazione che l’epirubicina è un efficace inibitore della topoisomerasi II suggerisce che l’epirubicina produce i suoi effetti clastogenici attraverso questo meccanismo. I metaboliti dell’epirubicina possono anche attivare le cellule per aumentare la produzione intracellulare di specie reattive dell’ossigeno, di cui le forme stabili e diffusibili possono danneggiare il DNA nucleare. Se i meccanismi di riparazione cellulare sono sovraccarichi, i danni primari al DNA possono portare ad aberrazioni cromosomiche strutturali o numeriche e alla fine causare tumori. Questo suggerimento è supportato dal fatto che gli individui che hanno sviluppato una seconda neoplasia maligna dopo il trattamento di una prima neoplasia maligna avevano una minore capacità di riparare le rotture del doppio filamento del DNA rispetto a quelli che non hanno sviluppato una seconda neoplasia maligna, come misurato dall’intensità γH2AX. L’induzione della MN centromero-positiva da parte dell’epirubicina indica che ci può essere un altro meccanismo attraverso il quale l’epirubicina induce il suo effetto genotossico. Questa osservazione sottolinea l’importanza di utilizzare la modifica FISH del test MN per determinare l’origine della MN indotta. Il potenziale meccanismo attraverso il quale l’epirubicina può esercitare il suo effetto aneugenico è attraverso l’inibizione della topoisomerasi II, che può provocare una cattiva segregazione dei cromosomi durante la divisione cellulare. Ciò si verifica perché la topoisomerasi II del DNA è necessaria per la corretta separazione dei cromatidi fratelli durante le divisioni cellulari e in sua assenza si verificano sia la non disgiunzione che la rottura. Quindi, l’epirubicina può essere in grado di inibire due ruoli chiave della topoisomerasi II; la sua capacità di segregare correttamente i cromosomi appena replicati, nonché la sua funzione nel rilegare le rotture transitorie del DNA a doppio filamento.
In sintesi, utilizzando il saggio FISH con una sonda centromerica del DNA per gli eritrociti MN, è stato dimostrato che l’epirubicina non è solo clastogenica ma anche aneugenica nelle cellule somatiche in vivo. Utilizzando il test di incorporazione di BrdU, è stato dimostrato che il ritardo meiotico causato dall’epirubicina era di circa 48 ore. Con l’analisi spermatozoi-FISH, è stato dimostrato che l’epirubicina induce aneuploidie durante la meiosi che risultano in spermatozoi disomici così come un arresto meiotico completo che crea spermatozoi diploidi. La prevalenza di spermatozoi autodiploidi (XX88, YY88) e disomici (XX8 o YY8) indica che la seconda divisione meiotica è più sensibile all’epirubicina rispetto alla prima divisione meiotica. I risultati suggeriscono anche che le prime fasi della profase contribuiscono relativamente meno all’aneuploidia indotta dall’epirubicina. Entrambi i potenziali clastogenici e aneugenici dell’epirubicina possono dare origine allo sviluppo di tumori secondari e a risultati riproduttivi anormali nei pazienti affetti da cancro e nel personale medico che espongono a regimi di farmaci che includono l’epirubicina. Anche se l’epirubicina ha meno tossicità sistemica e cardiaca della doxorubicina e di altre antracicline con uno spettro equivalente di azione antitumorale, ha effetti aneuploidogenici e citotossici nelle cellule non tumorali. Questo effetto aneuploidogenico del farmaco può essere responsabile della comparsa di esiti riproduttivi anormali e di tumori secondari, che si notano in alcuni pazienti oncologici qualche volta dopo il successo del trattamento dei loro tumori primari con la chemioterapia contenente epirubicina.